Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Podsumowanie

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Streszczenie

Aby zbadać zdarzenia napędzające rozwój serca i określić mechanizmy molekularne prowadzące do chorób mięśnia sercowego u ludzi, konieczne jest najpierw wygenerowanie funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów (CM). Wykorzystanie tych komórek w badaniach nad lekami i toksykologią byłoby również bardzo korzystne, umożliwiając walidację przedkliniczną nowych cząsteczek farmakologicznych stosowanych w leczeniu chorób serca na komórkach pochodzenia ludzkiego. Spośród możliwych źródeł CM, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są jednymi z najbardziej obiecujących, ponieważ mogą pochodzić bezpośrednio z łatwo dostępnych tkanek pacjenta i posiadają wewnętrzną zdolność do tworzenia wszystkich typów komórek w organizmie ¹. Zaproponowano kilka metod różnicowania komórek iPS w CM, począwszy od klasycznego podejścia do agregacji ciał zarodkowych (EBs), a skończywszy na chemicznie zdefiniowanych protokołach ^2,3. W tym artykule proponujemy protokół oparty na EBs i pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do wydajnego generowania funkcjonalnych komórek podobnych do CM z komórek iPS bez zasilania.

Wprowadzenie

Historycznie rzecz biorąc, badanie genetycznych i molekularnych mechanizmów napędzających rozwój człowieka i choroby opierało się na generowaniu genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych. Jednak wielu ludzkich fenotypów nie udaje się z powodzeniem replikować u myszy, głównie z powodu różnic biologicznych istniejących między tymi dwoma gatunkami. Z drugiej strony dostęp do tkanek ludzkich może być ograniczony i często nie pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości materiału do pogłębionych badań eksperymentalnych. Dziedzina biologii sercowo-naczyniowej cierpi na oba te ograniczenia: fizjologia ludzkiego serca znacznie różni się od fizjologii myszy, a znaczna ilość tkanki serca jest dostępna tylko po sekcji zwłok lub podczas operacji serca. Znalezienie optymalnego źródła różnicowania funkcjonalnych ludzkich CM stało się zatem centralnym tematem biologii sercowo-naczyniowej i włożono wiele wysiłku, aby rozwiązać ten problem. Zaproponowano różne typy komórek, w tym mioblasty szkieletowe, lokalne komórki macierzyste serca, komórki jednojądrzaste szpiku kostnego, progenitory śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste. Jednak dane uzyskane przy użyciu tych komórek nie były spójne ⁴.

Pierwsze 5 i przełomowe odkrycie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przez Yamanakę i Thomsona ^6,7 później zdawały się dostarczać rozwiązań: komórki te mają zdolność do wzrostu w nieskończoność i potencjał do powstania wszystkich pochodnych komórkowych trzech listków rozrodczych, w tym CM. Zastosowanie komórek iPS ma jeszcze inne zalety: ponieważ pochodzą z autologicznych komórek dorosłych, mają ten sam genom co osoba lub pacjent, od którego pochodzą. Pozwalają one zatem na opracowanie modeli in vitro, które ułatwiają badanie chorób genetycznych człowieka i mechanizmów ich rozwoju. Ze względu na tę cechę, komórki iPS mogą również przezwyciężyć problemy związane z odrzuceniem immunologicznym i kwestiami etycznymi ⁸. Z tych powodów, mimo że ESC nadal stanowią złoty standard w dziedzinie biologii komórek macierzystych, naukowcy na całym świecie skłaniają się obecnie bardziej ku technologii komórek iPS.

Komórki iPS są teraz wykorzystywane do modelowania ludzkich chorób in vitro dla różnych schorzeń, w tym wrodzonych zaburzeń sercowo-naczyniowych ^9,10. Ostatnio przeprowadzono zastosowanie modelowania chorób z komórek iPS w monogenowych zaburzeniach serca (tj. zespołach wydłużonego odstępu QT, katecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczu komorowym) oraz patologiach, w których wady serca są częścią złożonego fenotypu (np. zespoły lamparta i tymotki, kardiomiopatia rozstrzeniowa). Doniesienia te potwierdziły, że specyficzne dla pacjenta komórki iPS, które są różnicowane w CM, wykazują podobne cechy fenotypowe i funkcjonalne jak choroba in vivo.

Jednakże, wciąż istnieje wiele wyzwań związanych z poprawą skuteczności indukowania komórek iPS do linii serca. Spontaniczne wytwarzanie CM z ludzkich ESC poprzez tworzenie agregatów zwanych ciałami embrionalnymi (EB) okazało się skuteczne ¹⁷. Od czasu tego odkrycia zaproponowano wiele innych metod. Wiele grup znacznie zwiększyło skuteczność protokołu różnicowania i przeszło w kierunku chemicznie zdefiniowanych i wolnych od produktów zwierzęcych odczynników do hodowli (patrz Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) w celu kompleksowego przeglądu wszystkich istniejących metod ³).

Niemniej jednak, klasyczna metoda oparta na agregacji EB nadal jest najczęściej stosowana do przeprowadzania badań funkcjonalnych i badania mechanizmów chorobowych. Proponowany przez nas protokół opiera się na agregacji komórek iPS w EB i hodowli w obecności surowicy i kwasu askorbinowego, co, jak wykazano, wzmacnia proces różnicowania serca i pozytywnie wpływa na dojrzewanie tych komórek ^18,19. W tym artykule szczegółowo omówimy tę metodologię i pokażemy, jak wykorzystać linie komórkowe iPS bez karmienia do generowania specyficznych dla pacjenta CM pochodzących z iPS.

Protokół

1. Konserwacja i pasażowanie linii komórkowych ludzkiego iPS bez użycia feederów

1. Przygotuj naczynia pokryte Matrigelem. Rozmrozić jedną fiolkę z ludzkim Matrix zakwalifikowanym do ESC na lodzie przez jedną godzinę i rozcieńczyć ją w 25 ml pożywki DMEM-F12. Dodaj 1 ml do każdej płytki o średnicy 35 mm (lub równoważnej ilości na powierzchnię, jeśli używane są inne naczynia), trzymając wszystko na lodzie i upewniając się, że wszystkie talerze i rurki są wstępnie schłodzone. Przykryj płyty folią aluminiową.

Uwaga: Stężenia masywu Matrigel różnią się w zależności od partii. Instrukcje dotyczące rozcieńczania znajdują się w karcie katalogowej.

2. Trzymaj talerze na lodzie przez noc i zdejmij z lodu następnego dnia. Talerze można przechowywać w lodówce do tygodnia przed użyciem.
3. Przygotować kompletną pożywkę mTESR1 (lub rozmrozić fiolkę z pożywką Nutristem) i pożywkę H-ESM (pożywkę dla ludzi ESC) zgodnie z poniższą tabelą. . .

   H-ESM	KOŃCOWE STĘŻENIE	NA 500 ml
   Wymiana surowicy nokautującej (KSR)	20%	Pojemność 100 ml
   GlutaMAX 100X	2 mM	Pojemność 5 ml
   Aminokwasy endogenne MEM	0,1 mM	Pojemność 5 ml
   Penicylina-streptomycyna	100 U/ml - 0,1 mg/ml	Pojemność 5 ml
   2-merkaptoetanol	0,1 mM	900 μl
   Suplement B27 - bez witaminy A	1 proc	Pojemność 10 ml
   Suplement N2	1 proc	Pojemność 5 ml
   Nokaut DMEM	-	Pojemność 370 ml

   
   Podłoże podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie. Aby przygotować kompletną pożywkę wzrostową, tuż przed karmieniem dodaje się zasadowy FGF w końcowym stężeniu 20 ng/ml.

Uwaga: Kompletny H-ESM oparty na mysich fibroblastach embrionalnych może być stosowany zamiast mTESR1 lub Nutristem dla komórek iPS.

4. Umieścić powlekane płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut do 2 godzin przed pasażem.
5. Komórki powinny być przepuszczane mniej więcej co 5 dni, nawet jeśli nie osiągnęły zbiegu. Kolonie nie powinny się stykać.
6. Zastąp pożywkę wzrostową 1 ml dypazy (1 mg/ml, rozpuścić z 10 mg/ml zapasu w PBS).
7. Usunąć zróżnicowane obszary za pomocą pipet Pasteura z wyciągniętego szkła. Obszary, które powinny zostać usunięte, obejmują struktury przypominające kratery lub torbiele w centrum kolonii oraz wszelkie obszary, w których komórki zostały oddzielone od kolonii i spłaszczone i wydają się migrować na zewnątrz.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C pod kapturem hodowlanym, aż granice kolonii staną się jaśniejsze i zaczną się odrywać (zwykle około 5-7 minut). Wyrzuć dispase. Przemyć 1 ml H-ESM i wyrzucić.
9. W 1 ml H-ESM użyj podnośnika komórkowego (skrobaka przypominającego szpatułkę) do zebrania kolonii i zebrania w 15 ml probówce Eppendorf. Spłukać 1 ml H-ESM i dodać do tubki. Wirować z prędkością 1,000 rcf przez 4 minuty i usunąć supernatant.
10. Zawiesić osad w 1 ml wstępnie ogrzanej pożywki wzrostowej (mTESR1 lub Nutristem). Unikaj zbytniego rozbijania grudek - pipeta w górę i w dół mniej niż 6-8 razy. Określ, ile komórek należy posiać i usuń zbędne komórki (zwykle rozcieńczenie 1:4 lub 1:5), np. na 2 płytki w stosunku 1:5 usuń 600 μl, a następnie dodaj 1,6 ml świeżej pożywki.
11. Usuń Matrigel z płytek. Układaj komórki kropla po kropli, równomiernie rozprowadzając na talerzu. Unikaj nadmiernego potrząsania rurką, ponieważ spowoduje to przesuwanie się komórek w kierunku środka.
12. Umyj probówkę 1 ml pożywki i podziel na płytki. Ostateczna objętość w każdej płytce powinna wynosić 1,5 -2 ml.
13. Zmieniaj podłoże codziennie, z wyjątkiem dnia po pasażu. Chociaż idealna jest codzienna zmiana pożywki, czasami może to być zmieniane z częstotliwością raz na dwa dni, jeśli nie minęły więcej niż 2-3 dni od ostatniego pasażu bez wpływu na pluripotencję lub potencjał różnicowania.
14. Jeśli linia komórkowa musi zostać zamrożona, zamiast tego ponownie zawiesić w 1-2 ml mFreSR zamrażarki za pomocą pipety 2 ml i umieścić 1 ml/kriowial. Umieścić fiolki w kriopojemniku w temperaturze -80 °C i przenieść do ciekłego azotu w ciągu 3-4 dni.

Uwaga: Ręczna mikrodysekcja komórek iPS musi być wykonana pod mikroskopem stereoskopowym. Stacja robocza do zapłodnienia in vitro (IVF) (np. stacja robocza IVF firmy KSystem) zintegrowana ze stereomikroskopem umożliwia manipulowanie komórkami w sterylnych warunkach, gdy są one przechowywane na ogrzewanej powierzchni. Jeśli nie jest to możliwe, mikroskop stereoskopowy można przenieść pod zwykłą pokrywę z przepływem laminarnym.

2. Agregacja ciał embrionalnych i indukcja serca

1. Przygotować pożywkę EBM-20 zgodnie z poniższą tabelą.

   EBM-20	KOŃCOWE STĘŻENIE	NA 500 ml
   Surowica płodowa bydlęca (pochodzenie z Ameryki Południowej)	20%	Pojemność 100 ml
   Aminokwasy endogenne MEM	0,1 mM	Pojemność 5 ml
   Penicylina - streptomycyna	100U/ml - 0,1 mg/ml	Pojemność 5 ml
   GlutaMAX 100X	0,1 mM	Pojemność 5 ml
   2-merkaptoetanol	50uM	450 μl
   DMEM/F12	-	Pojemność 385 ml

   
   Stosowanie FBS pochodzących z Ameryki Południowej ma kluczowe znaczenie dla określenia skuteczności różnicowania: zastosowanie innych rodzajów surowic może wpływać na proces różnicowania. Aby przygotować kompletny EBM-20, dodaj kwas askorbinowy (AA) do końcowego stężenia 50 μg/ml. Kompletne podłoże wzrostowe można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień.
2. Zbierz kolonie iPS zgodnie z powyższym opisem (kroki od 1.6 do 1.9).
3. Delikatnie zawiesić w 1 ml EBM-20 za pomocą pipety 2 ml. Unikaj zbytniego rozbijania grudek - pipetuj w górę i w dół nie więcej niż 2-3 razy, sprawdzając wielkość kolonii pod mikroskopem stereoskopowym. Płytka na płytkach o bardzo niskim mocowaniu w stosunku 1:1 (np. w przypadku naczynia 35 mm należy użyć 1 dołka z płytki 6-dołkowej). Opłucz probówkę 1 ml EBM-20 i dodaj do talerza.

Uwaga: Wielkość kolonii wpływa na proces różnicowania, kontrolując skuteczność i czas indukcji serca. Wykazano, że agregacja EB o jednorodnej wielkości zmniejsza zmienność obserwowaną podczas różnicowania.

4. W dniu 3 zmień EBM-20 raz za pomocą mikroskopu, aby uniknąć usunięcia EBs. Trzymaj pipetę blisko krawędzi płytki i usuń medium.
5. W 7 dniu należy przestawić EB na płytki pokryte 0,1% żelatyną i uprzednio umieszczone w temperaturze 37 °C na 30 minut. W razie potrzeby żelatynę można usunąć, a płytki pozostawić pod kapturem do hodowli komórkowych O/N. Dodać 35-40 EB na szalkę 35 mm.
6. Sprawdzaj EB pod kątem obszarów bicia i zmieniaj EBM-20 dwa razy w tygodniu. Zaznacz miejsca, w których znajdują się obszary dudnienia na górze pokrywy naczynia, aby ułatwić ich lokalizację pod mikroskopem stereoskopowym. Obszary kontraktacji powinny pojawić się po około 10-20 dniach.
7. Gdy pojawią się obszary ze spontanicznym skurczem, zmień pożywkę na EBM-2 (przygotuj jako EBM-20, zamiast tego z 2% FBS) i wyizoluj je zgodnie z opisem poniżej w sekcji 3.
8. Kontynuuj sprawdzanie innych obszarów do ubijania i zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu, aż obszary ubijania będą potrzebne do dalszych eksperymentów.

Uwaga: Efektywność procesu różnicowania zależy w dużym stopniu od kilku czynników, z których najbardziej krytyczne to specyficzne linie komórkowe i partia surowicy używana do indukowania różnicowania serca. Aby uzyskać najwyższą skuteczność, należy przetestować linie komórkowe pod kątem potencjału kardiomiogennego i różne partie surowicy.

3. Izolacja i kultura obszarów pokonania

1. Pokryj płytki 12-dołkowe (powierzchnia 4^cm2) lub płytki będące przedmiotem zainteresowania fibronektyną o stężeniu 5 μg/^cm2, rozcieńczoną w PBS, aby uzyskać objętość wystarczającą do całkowitego pokrycia całej powierzchni (łącznie 300 μl na basenik w płytkach 12-dołkowych). Przechowywać bez przykrycia w kapturze do hodowli komórkowych i pozostawić do wyschnięcia. Talerze można owijać i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N.
2. W razie potrzeby usunąć obszar ubijania za pomocą szklanej pipety Pasteura i skalpela. Przenieść na płytki pokryte fibronektyną za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
3. Dodać 1 ml EBM-2.
4. Skreślić tabliczkę, aby wskazać obszary, z których usunięto komórki i zmienić podłoże. Talerze można przechowywać do 1 miesiąca, ponieważ inne obszary mogą później zacząć bić.

Uwaga: Jeśli potrzebne są mniejsze grudki, kilkakrotnie pipetuj eksplantowany obszar w górę i w dół pod mikroskopem stereoskopowym, aż rozpadnie się na mniejsze kawałki. Spowoduje to powstanie klastrów składających się z kilku bijących komórek (patrz film 3).

5. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu, aż będzie gotowe do analiz.

Uwaga: Kardiomiocyty uzyskane z tego protokołu posiadają podobne do płodowych cechy morfologiczne i funkcjonalne; dojrzewanie do fenotypu dorosłego można uzyskać poprzez wydłużenie czasu w hodowli w celu dalszego różnicowania tych komórek.

4. Izolacja i analiza pojedynczych komórek bijących

1. Szkiełka dwukomorowe (powierzchnia 4^cm2) lub inne odpowiednie podłoża pokryć fibronektyną o stężeniu 5 μg/^cm2 rozcieńczoną w wystarczającej ilości PBS, aby pokryć całą powierzchnię hodowli. Jeśli używany jest szklany nośnik, pokryj lamininą i fibronektyną (5 μg/^cm2 każdy).
2. Usunąć obszar ubijania pipetą/skalpelem Pasteura z płytek z sekcji 3.
3. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 500 μl kolagenazy II (480 j./ml w PBS z Mg i Ca) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, potrząsając probówką jeden raz podczas inkubacji.
4. Pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Jeśli pozostaną jakieś grudki, przenieś do świeżej kolagenazy II i powtórz krok 4.3.
5. Powtarzaj krok 4.4, aż nie pozostaną żadne duże grudki.
6. Inaktywuj kolagenazę za pomocą 3 ml EBM-2 (bez AA). Dętkę można następnie pozostawić pod maską w podgrzewanym stojaku, aż inne rurki będą gotowe. Wirować przy 1,000 rcf przez 4 min.
7. Zawiesić osad w 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA (rozcieńczony z 0,5% wywaru w 1X PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Połączyć frakcje mineralizacji z tej samej próbki początkowej.
8. Dezaktywuj trypsynę za pomocą 4 ml EBM-2 (bez AA). Przepuścić komórki przez igłę 18G na strzykawce o pojemności 2,5 ml nie więcej niż 7 razy. Wirować przy 1,000 rcf przez 4 min.
9. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml EBM-2 na dołek i płytkę. Komórki można wykorzystać do analiz funkcjonalnych i morfologicznych 2-3 dni po posiewie.

Wyniki

W naszych badaniach wygenerowaliśmy CM z kilku linii komórkowych iPS. Linie te zostały początkowo wygenerowane na warstwie zasilającej MEF, ale natychmiast zostały umieszczone na Matrigel przy użyciu zdefiniowanego podłoża (mTESR1 lub Nutristem). Zastosowano różne testy w celu sprawdzenia zachowania właściwości morfologicznych, ekspresji markerów typowych dla komórek pluripotencjalnych (OCT-4, SSEA4 i TRA1-60) oraz ich stabilności genomu (ryc. 1).

Indukcja do linii serca zosta...

Dyskusja

Pluripotencjalne komórki macierzyste mają potencjał do spontanicznego różnicowania się w CM, aczkolwiek z niską wydajnością i dużą zmiennością między liniami. Opracowanie nowatorskich metod indukcji skupiło się zatem na poprawie wydajności procesu i przejściu na bardziej zdefiniowane protokoły. Jednak większość z tych nowych metod różnicowania jest dość złożona, wymagająca skomplikowanych warunków hodowli, dokładnej kontroli czasu i stężenia odczynników oraz leczenia drogimi cytokinami i czynnikami wzrostu. Ponadto różni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Media i odczynniki
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Rozmrozić butelkę o pojemności 5 ml w temperaturze 4 & C na lodzie O/N, podwielokrotność we wstępnie schłodzonych krioprobówkach na lodzie, zgodnie z instrukcją rozcieńczania w karcie katalogowej i przechowywać w temperaturze -20 °; C .
Fibronektyna, z ludzkiego osocza, 0,1% roztwór	Sigma	F0896-2MG	Stężenie robocze: 5 μ g / cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Stężenie robocze: 5 μ g/cm2
PBS (bez Mg i Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (z Mg i Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, proteaza obojętna, stopień II	Roche	4942078001	Zapas: 10 mg/ml w DMEM-F12 w temperaturze -20 ° C, roztwór roboczy: 1 mg / ml w PBS (bez Mg / Ca)
Trypsyna / EDTA, 0,5%	Sigma	T3924
Kolagenaza typu 2	Worthington	4176	Rozcieńczony do 480 U / ml (np. 1,6 mg / ml) w PBS z Mg i Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Nokaut DMEM	Life Technologies	10829-018
Serum nokautujące Zamiennik (KSR)	Life Technologies	10828-028	Rozmrażanie przy 4 stopniach; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
F– Surowica bydlęca (pochodzenie Ameryka Południowa)	Invitrogen	10270-106	Partie należy przebadać pod kątem ich potencjału kardiogennego. Rozmrażanie w 4 & stopni; C, inaktywacja termiczna w temperaturze 56 &; C przez 30 min, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &; C
PenStrep, penicylina-Streptomycyna, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Suplement Invitrogen	11140-135
N2, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 suplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt– thanol	Invitrogen	31350-010
Żelatyna, ze skóry wieprzowej	Sigma	G1890-100G	Stęż 1% w wodzie, przechowuj w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć do 0,1% w PBS i przechowywać w temperaturze 4 ° C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Połącz suplement 5X z podłożem podstawowym, podwielokrotnością i przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Nie przechowywać pełnego podłoża w temperaturze 4 & stopni; C przez ponad 1 tydzień
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Rozmrozić w temperaturze 4 & C O/N, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia. Podwielokrotności mogą być utrzymywane w temperaturze 4 stopni C nie dłużej niż tydzień.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Kwas askorbinowy	Sigma	A4544-25G	Przygotować bulion w ilości 10 mg/ml w wodzie. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C w ciemności. Dodaj do EBM w końcowym stężeniu (500X)
Plasticware
35 mm Naczynia hodowlane	Becton Dickinson	353001
Skrobak komórkowy	Corning Incorporated	3008
12-dołkowe Becton	Dickinson	353043
Szkiełka 2-dołkowe Permanox	Thermo Fisher Scientific	177437
Szkiełka szklane 2-dołkowe Thermo	Fisher Scientific	177380
Płytki 6-dołkowe, bardzo niska powierzchnia mocowania	Igła Corning Incorporated	3471
18G	Pipety Pasteura Becton Dickinson	304622
Szklane, 230 mm	VWR International	612-1702
2,5 ml	Becton Dickinson	300188
Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomikroskop	Nikon