System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Podsumowanie

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ₄₂ w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

Streszczenie

Amylopatia to termin opisujący nieprawidłową syntezę i akumulację beta amyloidu (Aβ) w tkankach w czasie. Aβ jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera (AD) i występuje w otępieniu z ciałami Lewy'ego, zapaleniu mięśni inkluzyjnych i mózgowej angiopatii amyloidowej ^1-4. Amylopatie rozwijają się stopniowo z czasem. Z tego powodu proste organizmy o krótkiej długości życia mogą pomóc w wyjaśnieniu molekularnych aspektów tych schorzeń. W tym miejscu opisujemy eksperymentalne protokoły badania neurodegeneracji zależnej od Aβ przy użyciu robaka Caenorhabditis elegans. W ten sposób konstruujemy transgeniczne robaki, wstrzykując DNA kodujące ludzkie Aβ₄₂ do syncytialnych gonad dorosłych hermafrodytów. Linie transformacyjne są stabilizowane przez integrację wywołaną mutagenezą. Nicienie są zsynchronizowane z wiekiem poprzez zbieranie i wysiewanie jaj. Funkcja neuronów wyrażających Aβ₄₂ jest testowana w odpowiednich testach behawioralnych (testy chemotaksji). Pierwotne kultury neuronalne uzyskane z zarodków są wykorzystywane do uzupełniania danych behawioralnych i testowania neuroprotekcyjnego działania związków antyapoptotycznych.

Wprowadzenie

Amyloid beta (Aβ) to peptyd składający się z 36-43 aminokwasów, który powstaje po sekwencyjnym rozszczepieniu białka prekursorowego amyloidu (APP) przez β i γ sekretazy ¹. Sekretaza γ przetwarza C-końcowy koniec peptydu Aβ i jest odpowiedzialna za jego zmienne długości ⁵. Najczęstszymi formami Aβ są Aβ₄₀ i Aβ₄₂, przy czym ta ostatnia jest częściej związana ze stanami patologicznymi, takimi jak AD ⁵. W wysokich stężeniach Aβ tworzy β-arkusze, które agregują się, tworząc fibryle amyloidowe ⁶. Złogi włókienek są głównym składnikiem blaszek starczych otaczających neurony. Uważa się, że zarówno blaszki maziowe, jak i dyfuzyjne, nieblaszkowane oligomery Aβ stanowią podstawowe formy chorobotwórcze Aβ.

Laboratoryjne badanie amylopatii neuronalnych komplikuje fakt, że te warunki postępują z czasem. Dlatego ważne jest, aby opracować genetycznie podatne modele zwierzęce - uzupełniające myszy - o krótkiej długości życia. Modele te mogą być wykorzystane do wyjaśnienia konkretnych aspektów amylopatii - zazwyczaj komórkowych i molekularnych - a dzięki swojej prostocie pomagają uchwycić istotę problemu. Robak Caenorhabditis elegans falls należy do tej kategorii. Ma krótką żywotność, ~ 20 dni, a ponadto podstawowe procesy komórkowe, w tym regulacja ekspresji genów, transport białek, łączność neuronalna, synaptogeneza, sygnalizacja komórkowa i śmierć są podobne do ssaków ⁷. Unikalne cechy robaka to silna genetyka i brak systemu naczyń krwionośnych, co umożliwia badanie uszkodzeń neuronów niezależnie od uszkodzeń naczyń krwionośnych. Z drugiej strony, brak mózgu ogranicza stosowanie C. elegans do badania wielu aspektów neurodegeneracji. Ponadto w tym organizmie nie można przeprowadzić reprodukcji i identyfikacji anatomicznego rozmieszczenia zmian chorobowych. Inne ograniczenia obejmują trudności w ocenie zarówno różnic w profilach ekspresji genów, jak i upośledzenie złożonego zachowania i funkcji pamięci. Tutaj opisujemy metody generowania modeli amylopatii C. elegans.

Protokół

1. Konstrukcja transgenicznych nicieni

1. Transformacja.
   1. Przygotowanie podłoży do iniekcji. Nanieść kroplę gorącej, 2% agarozy rozpuszczonej w wodzie na szklaną lamellkę. Szybko nałożyć drugą lamellkę na kroplę i lekko ją stuknąć. Po zastygnięciu agarozy rozsunąć lamellki, a przygotowane podłoże wysuszyć w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C przez noc (O/N).
   2. Wytwarzanie pipet. Do wyciągania kapilar borokrzemianowych o średnicy zewnętrznej/wewnętrznej (O.D./I.D.) 1/0,5 mm używamy wyciągacza Sutter P-97 z włóknem. Pipety są formowane z zamkniętą końcówką, która zostaje otwarta na późniejszym etapie.
   3. Przygotowanie mieszaniny do iniekcji. Przygotować mieszaninę do iniekcji zawierającą interesujące DNA (20 ng/μl na konstrukt) oraz puste DNA plazmidowe do końcowego stężenia 150 ng/μl. Odwirować mieszaninę do iniekcji w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Krok ten jest kluczowy, ponieważ zanieczyszczenia obniżają wydajność transformacji. Przenieść górne 5 μl (osady i inne zanieczyszczenia gromadzą się na dnie) do nowej probówki przeznaczonej do iniekcji.
   4. Napełnianie mieszaniną do iniekcji metodą kapilarną. Zanurzyć końcówkę pipety w mieszaninie do iniekcji. Zazwyczaj 0,5 μl jest wystarczające do iniekcji 100 nicieni.
   5. Przygotowanie pipety do iniekcji. Umieścić pipetę w uchwycie mikromanipulatora i otworzyć jej końcówkę, pocierając ją o krawędź lamellki zamocowanej na szkiełku podstawowym lub alternatywnie o osad na podłożu agarowym. Jest to kluczowy etap, ponieważ zbyt duże końcówki uszkadzają nicienia, a zbyt małe łatwo się zatykają. Jakość otwartej końcówki można ocenić po jej kształcie, a przede wszystkim po szybkości przepływu. Szybkość przepływu można ocenić na podstawie wielkości pęcherzyków wypływających z otwartej końcówki zanurzonej w kropli oleju halowęglowego 700 w odpowiedzi na ciśnienie iniekcyjne.
   6. Przeniesienie nicieni na podłoże do iniekcji. Nanieść kroplę oleju halowęglowego 700 na podłoże do iniekcji i przenieść kilka nicieni (1 lub 2 dla osób początkujących) do oleju. Użyć igły do nicieni, aby docisnąć je do podłoża, aż przylgną do agarozy. Nicienie powinny być ustawione w rzędach, stronami brzusznymi skierowanymi w tym samym kierunku. Unikać dotykania głowy nicienia. Jeśli po kilku próbach nicienie nie przylegają do podłoża, należy je zastąpić nowym podłożem lub zwiększyć grubość i/lub stężenie agarozy.
   7. Wprowadzenie pipety do nicienia. Przesuwając stolik, ustawić nicienia pod pipetą. Umieścić pipetę w rdzeniu gonady, ponieważ jej cytoplazma jest wspólna dla wielu jąder komórek linii zarodkowej. Zwiększa to prawdopodobieństwo dostarczenia wstrzykniętego DNA do wielu potomstwach. Pipeta powinna leżeć niemal równolegle do nicienia (kąt ~15°-25°). Docisnąć pionowo końcówkę pipety do ciała nicienia, aż skóra zostanie wciśnięta. Następnie delikatnie stuknąć w manipulator, aby wprowadzić końcówkę do środka. Dla uzyskania najlepszych wyników należy wstrzyknąć DNA do obu gonad.
   8. Iniekcja roztworu DNA. Przyłożyć ciśnienie do pipety, aż gonada spuchnie. Przerwać przepływ i zdjąć nicienia z pipety. Sprawdzić przepływ w igle, a następnie przejść do następnego nicienia i powtórzyć etapy iniekcji.
   9. Regeneracja nicieni: Dodać kroplę (~10 μl) buforu regeneracyjnego na nicienie i inkubować, aż zaczną pływać. Dodać taką samą objętość M9, odczekać, aż nicienie wznowią pływanie i powtórzyć czynność kilka razy, aż roztwór będzie składał się głównie z M9. Przenieść pojedynczo nicienie na wysiane płytki.
2. Integracja.
   1. Umieścić 40 zdrowych, dobrze odżywionych nicieni w stadium L4 na świeżej płytce.
   2. Naświetlać promieniami γ dawką 4 000 rad przez 40 min. Przenieść naświetlone nicienie (P0) na świeże płytki wysiane szczepem OP50 (4 nicienie/płytka). Alternatywnie nicienie można naświetlać dawką UV 300 J/m².
   3. Przenieść 10-20 transformantów F1 z każdej płytki na oddzielne płytki, opisując płytki zgodnie z pochodzeniem z P0.
   4. Wyodrębnić 2-4 transformantów F2 dla każdego F1 na oddzielne płytki. Sprawdzić potomstwo F3 pod kątem 100% transmisji markera transformacji. Zazwyczaj 1-3% potomstwa naświetlonego nicienia wykaże zdarzenie integracji.
   5. Utworzyć banki trzech lub więcej niezależnych linii transformantów.

2. Testy behawioralne

1. Synchronizacja wieku.
   1. Hodować nicienie na standardowych płytkach NGM 10 cm + E. coli OP50 aż do uzyskania dużej populacji dorosłych osobników z jajami (3-5 dni).
   2. Zebrać nicienie do probówek Falcon 50 ml, zawieszając je w 1 ml buforu M9.
   3. Dodać 5 ml buforu M9 i wirować przy 450 x g przez 3 min. Odlać nadsącz. Powtórzyć 3-4x.
   4. Po ostatnim wirowaniu usunąć nadsącz i dodać do osadu z nicieni 10 objętości zasadowego roztworu podchlorynu (świeżo wymieszane 0,5 M NaOH, 1% podchlorynu). Inkubować w RT przez ok. 10 min. Reakcję lizy można monitorować, umieszczając kroplę mieszaniny na szkiełku nakrywnym i badając nicienie pod mikroskopem. Reakcję należy przerwać, gdy rozpadnie się około 80% nicieni.
   5. Przerwać reakcję lizy, dodając taką samą objętość sterylnego buforu do jaj.
   6. Zebrać jaja (oraz resztki ciał) poprzez wirowanie przy 450 x g przez 5 min.
   7. Przemyć jaja sterylnym buforem do jaj 2-3x.
   8. Inkubować jaja O/N w buforze M9, a następnie wysiać je na standardowe płytki NGM.
2. Test chemotaksji.
   1. Przygotować kilka kawałków agaru o wymiarach ok. 0,5x0,5x0,5 cm. Agar osadzamy na płytce 10 cm, z której następnie wycinamy kostki agaru.
   2. Namoczyć kostkę agaru w roztworze zawierającym wybrany atraktant (w stężeniach nasycających lub bliskich nasyceniu) przez 2 h. Typowymi atraktantami są lizyna (0,5 M) i biotyna (0,2 M).
   3. Umieścić kostkę agaru na 10-cm płytce testowej, na której zaznaczono miejsce na punkt testowy i punkt kontrolny (Rysunek 1A). Pozostawić O/N w celu wyrównania i uformowania gradientu (Rysunek 1B). Przygotować 5 płytek do jednego eksperymentu.
   4. Przed eksperymentem dodać 10 μl 20 mM NaN₃ (środka znieczulającego) do każdego punktu.
   5. Umieścić 20 zsynchronizowanych wiekowo nicieni w centrum płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 20 °C.
   6. Po 1 h policzyć zwierzęta w punktach testowym i kontrolnym, a następnie obliczyć indeks chemotaksji (C.I.) według następującego wzoru: gdzie N, N_test i N_Cnt. oznaczają odpowiednio całkowitą liczbę zwierząt, liczbę zwierząt w punkcie testowym oraz liczbę zwierząt w punkcie kontrolnym.

3. Podstawowa hodowla komórek embrionalnych

1. Przeprowadzić lizę nicieni zgodnie z opisem w sekcji synchronizacji wieku.
2. Zatrzymać reakcję lizy poprzez dodanie takiej samej objętości sterylnego buforu do jaj i wirować przy 450 x g przez 5 min. Ostrożnie odlać nadsącz, uważając, aby nie zgubić osadu z jajami. Powtórzyć 2-3 krotnie lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny.
3. Resuspendować osad z jajami (i resztkami tkanek) w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodać 2 ml sterylnej 60% sacharozy w buforze do jaj. Mieszać roztwór ręcznie lub za pomocą wortexa aż do całkowitego resuspendowania jaj (ponieważ mają one tendencję do tworzenia grudek podczas wirowania).
4. Wirować przy 450 x g przez 15 min.
5. Ostrożnie przenieść nadsącz (zawierający jaja) do sterylnej probówki. Odrzucić osad zawierający resztki tkanek i inne produkty uboczne lizy.
6. Usunąć resztkową sacharozę poprzez resuspendowanie jaj w buforze do jaj i wirowanie przy 450 x g przez 5 min. Ostrożnie zebrać i odlać nadsącz. Powtórzyć 3 krotnie.
7. W komorze z laminarnym przepływem powietrza resuspendować osad z jajami w sterylnym buforze do jaj zawierającym 1 U/ml chitynazy w RT w celu strawienia skorup jaj. Po 30 min rozpocząć monitorowanie reakcji (pod inwertowanym mikroskopem do hodowli komórkowych). Każda partia chitynazy ma nieco inną aktywność. Zazwyczaj trawienie kończy się w ciągu 1 hr.
8. Gdy chitynaza strawi około 70-80% skorup jaj, dodać CM-15 (pożywka do hodowli komórkowych L-15 zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny). Rozdzielić komórki za pomocą strzykawki z igłą 27 G. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez filtr 5.0 μm, aby usunąć nienaruszone embriony, grudki komórek oraz larwy.
9. Ssedymentować rozdzieloną zawiesinę komórkową poprzez wirowanie przy 450 x g przez 15 min. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w pożywce do hodowli komórkowych CM-15.
10. Wysiać rozdzielone komórki na szkiełka zakrywkowe uprzednio pokryte lektyną arachidową (0.1 mg/ml) rozpuszczoną w wodzie. Uwaga: komórki muszą przylgnąć do podłoża, aby mogły ulec różnicowaniu.
11. Komórki można utrzymywać w RT (16-20 °C) w powietrzu przez ponad 2 tygodnie.

Wyniki

W naszych protokołach badamy wpływ ludzkiego oligomeru Aβ₄₂ na funkcję neuronalną ⁸. Fragment kodujący ludzki Aβ₄₂ oraz sztuczną sekwencję peptydowego sygnału wektora Fire pPD50.52 został namnożony z konstruktu PCL12 ⁹ przy użyciu starterów wprowadzających miejsca restrykcyjne dla endonukleazy Sma 1 na końcach. Następnie fragment ten wstawiono do konstruktu zawierającego 2 481-pb sekwencję promotora flp-6 w wektorze Fire pPD95.75 pomiędzy unikalne miejsce Sma 1 ^10...

Dyskusja

Tutaj opisujemy podejście łączone do badania komórkowych i molekularnych aspektów amylopatii przy użyciu C. elegans. Zalety tego podejścia to: 1) niski koszt. C.elegans jest utrzymywany na normalnej szalce Petriego obsianej bakteriami, w temperaturze pokojowej. 2) Potężna genetyka. Zwierzęta transgeniczne można uzyskać w ciągu kilku miesięcy, a szeroki wachlarz sekwencji promotorowych jest dostępny do napędzania ekspresji pożądanego genu w określonych neuronach. 3) Prosty, dobrze scharakteryzowany układ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. NGM
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Agar bakteriologiczny	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-pepton	AMRESCO	J636	2,5 g
Woda			Doprowadzić do 975 ml
Sterylizowane w autoklawie, następnie dodaj następujące elementy i dobrze wymieszaj
: Siarczan	magnezuSigma-Aldrich	M2643	1 ml 1 M bulionu
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml 1 M bulionu
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml 5 mg / ml bulionu
		Bufor fosforanu potasu	25 ml 1M zapasu
2. Bufor fosforanu potasu
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Woda			Doprowadzić do 1 L
Sterylizowane przez autoklawowanie
3. M9 bufor
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml bulionu 1 M
Woda			Doprowadzić do 1 l
Sterylizowane przez autoklawowanie
4. Bufor jaj (pH 7,3, 340 mOsm)
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
		destylowana	Doprowadź do 1 L
Sterylizowane przez autoklawowanie
5. CM-15
L-15 pożywka hodowlana	Gibco	11415	450 ml
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437-028	50 ml
Penicylina	Gibco	15140	50 jednostek/ml
Streptomycyna	Gibco	15140	50 g/ml
Dostosuj do 340 mOsm z sacharozą, a następnie sterylnie przefiltruj do autoklawowanych butelek i przechowuj w temperaturze 4 &stopni; C
6. Inne odczynniki< / mocny>
olej Halocarbon 700	Produkty halowęglowe	9002-83-9
5 μ m Filtr strzykawkowy Acrodisc PALL	Co.	4199
Chitynaza	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lektyna (orzechy ziemne)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	S320
Lizyna	Sigma-Aldrich	L5501
Biotyna	Sigma-Aldrich	B4639
Roztwór	podchlorynu soduSigma-Aldrich	425044
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	71289
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389

destylowana (w etanolu) destylowana destylowana Woda