System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Podsumowanie

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ₄₂ w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

Streszczenie

Amylopatia to termin opisujący nieprawidłową syntezę i akumulację beta amyloidu (Aβ) w tkankach w czasie. Aβ jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera (AD) i występuje w otępieniu z ciałami Lewy'ego, zapaleniu mięśni inkluzyjnych i mózgowej angiopatii amyloidowej ^1-4. Amylopatie rozwijają się stopniowo z czasem. Z tego powodu proste organizmy o krótkiej długości życia mogą pomóc w wyjaśnieniu molekularnych aspektów tych schorzeń. W tym miejscu opisujemy eksperymentalne protokoły badania neurodegeneracji zależnej od Aβ przy użyciu robaka Caenorhabditis elegans. W ten sposób konstruujemy transgeniczne robaki, wstrzykując DNA kodujące ludzkie Aβ₄₂ do syncytialnych gonad dorosłych hermafrodytów. Linie transformacyjne są stabilizowane przez integrację wywołaną mutagenezą. Nicienie są zsynchronizowane z wiekiem poprzez zbieranie i wysiewanie jaj. Funkcja neuronów wyrażających Aβ₄₂ jest testowana w odpowiednich testach behawioralnych (testy chemotaksji). Pierwotne kultury neuronalne uzyskane z zarodków są wykorzystywane do uzupełniania danych behawioralnych i testowania neuroprotekcyjnego działania związków antyapoptotycznych.

Wprowadzenie

Amyloid beta (Aβ) to peptyd składający się z 36-43 aminokwasów, który powstaje po sekwencyjnym rozszczepieniu białka prekursorowego amyloidu (APP) przez β i γ sekretazy ¹. Sekretaza γ przetwarza C-końcowy koniec peptydu Aβ i jest odpowiedzialna za jego zmienne długości ⁵. Najczęstszymi formami Aβ są Aβ₄₀ i Aβ₄₂, przy czym ta ostatnia jest częściej związana ze stanami patologicznymi, takimi jak AD ⁵. W wysokich stężeniach Aβ tworzy β-arkusze, które agregują się, tworząc fibryle amyloidowe ⁶. Złogi włókienek są głównym składnikiem blaszek starczych otaczających neurony. Uważa się, że zarówno blaszki maziowe, jak i dyfuzyjne, nieblaszkowane oligomery Aβ stanowią podstawowe formy chorobotwórcze Aβ.

Laboratoryjne badanie amylopatii neuronalnych komplikuje fakt, że te warunki postępują z czasem. Dlatego ważne jest, aby opracować genetycznie podatne modele zwierzęce - uzupełniające myszy - o krótkiej długości życia. Modele te mogą być wykorzystane do wyjaśnienia konkretnych aspektów amylopatii - zazwyczaj komórkowych i molekularnych - a dzięki swojej prostocie pomagają uchwycić istotę problemu. Robak Caenorhabditis elegans falls należy do tej kategorii. Ma krótką żywotność, ~ 20 dni, a ponadto podstawowe procesy komórkowe, w tym regulacja ekspresji genów, transport białek, łączność neuronalna, synaptogeneza, sygnalizacja komórkowa i śmierć są podobne do ssaków ⁷. Unikalne cechy robaka to silna genetyka i brak systemu naczyń krwionośnych, co umożliwia badanie uszkodzeń neuronów niezależnie od uszkodzeń naczyń krwionośnych. Z drugiej strony, brak mózgu ogranicza stosowanie C. elegans do badania wielu aspektów neurodegeneracji. Ponadto w tym organizmie nie można przeprowadzić reprodukcji i identyfikacji anatomicznego rozmieszczenia zmian chorobowych. Inne ograniczenia obejmują trudności w ocenie zarówno różnic w profilach ekspresji genów, jak i upośledzenie złożonego zachowania i funkcji pamięci. Tutaj opisujemy metody generowania modeli amylopatii C. elegans.

Protokół

1. Budowa transgenicznych robaków

1. przekształcenie.
   1. Przygotować podkładki do wstrzykiwań. Umieść kroplę gorącej, 2% agarozy rozpuszczonej w wodzie na szklanym szkiełku nakrywkowym. Szybko umieść drugie szkiełko nakrywkowe na kropli i lekko ją postukaj. Po zestaleniu się agarozy rozsunąć szkiełka nakrywkowe i upiec szkiełko nakrywkowe w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C O/N.
   2. Pociągnij pipety. Za pomocą ściągacza Sutter P-97 wyciągamy kapilary borokrzemianowe 1/0,5 mm O.D./I.D. z filamentem. Pipety są kute z zamkniętą końcówką, która jest otwierana na późniejszym etapie.
   3. Przygotować mieszankę do wstrzykiwań. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań zawierającą interesujące nas DNA (20 ng/μl na konstrukt) oraz puste plazmidowe DNA do końcowego stężenia 150 ng/μl. Odwirować mieszaninę iniekcyjną, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ zanieczyszczenia zmniejszają wydajność transformacji. Przenieść górne 5 μl (zanieczyszczenia i inne zanieczyszczenia gromadzą się na dnie) do świeżej probówki do użycia w iniekcji.
   4. Mieszanka iniekcyjna obciążenia według kapilarności. Dno pipety zanurza się w mieszance iniekcyjnej. Zazwyczaj 0,5 μl wystarcza do wstrzyknięcia 100 robaków.
   5. Załaduj pipetę iniekcyjną. Włożyć pipetę do uchwytu mikromanipulatora i rozbić ją, pocierając jej końcówką o krawędź szkiełka nakrywkowego zamontowanego na szkiełku podstawowym lub alternatywnie o zanieczyszczenia na waciku agarozowym. Jest to kluczowy krok, ponieważ zbyt duże końcówki uszkadzają robaka, a zbyt małe końcówki łatwo się zapychają. Jakość złamanej końcówki można ocenić po kształcie, a przede wszystkim po natężeniu przepływu. Natężenie przepływu można ocenić na podstawie wielkości pęcherzyków wypływających z otwartej końcówki zanurzonej w kropli oleju halocarbon 700 w odpowiedzi na ciśnienie wtrysku.
   6. Przenieść robaki do podkładki iniekcyjnej. Umieść kroplę 700 oleju halowęglowego na podkładce iniekcyjnej i przenieś kilka (1 lub 2 dla początkujących) robaków do oleju. Użyj wykałaczki do robaków, aby wepchnąć robaki na podkładkę, aż przylgną do agarozy. Robaki powinny być zorientowane w rzędach z brzusznymi bokami skierowanymi w tym samym kierunku. Unikaj dotykania głowy robaka. Jeśli po kilku próbach robaki nie przylgną do podkładki, wymień ją na świeżą podkładkę lub zwiększ grubość i/lub stężenie agarozy.
   7. Włóż pipetę do ślimaka. Przesuwając stolik, umieść robaka pod pipetą. Umieść pipetę w centralnym rdzeniu gonady, ponieważ jej cytoplazma jest wspólna dla wielu jąder komórek rozrodczych. Zwiększa to prawdopodobieństwo dostarczenia wstrzykniętego DNA wielu potomkom. Pipeta powinna leżeć prawie równolegle do ślimaka (kąt ~15°-25°). Wciśnij pionowo końcówkę pipety w dół korpusu robaka, aż skóra zostanie wciśnięta. Następnie delikatnie postukaj w manipulator, aby wywołać włożenie końcówki. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wstrzyknij obie gonady.
   8. Wstrzyknąć roztwór DNA. Naciskaj pipetę, aż gonada pęcznieje. Zatrzymaj przepływ i ściągnij robaka z pipety. Sprawdzić przepływ w igle, a następnie przejść do następnego ślimaka i powtórzyć kroki wstrzykiwania.
   9. Odzyskaj robaki: Dodaj kroplę (~10 μl) buforu regeneracyjnego na robaki i inkubuj, aż robaki zaczną pływać. Dodaj równą objętość M9, poczekaj, aż robaki wznowią pływanie i powtórz kilka razy, aż roztwór będzie w większości M9. Pojedynczo przenieś robaki na talerze z nasionami.
2. integracja.
   1. Umieść 40 zdrowych, dobrze odżywionych robaków L4 na świeżym talerzu
   2. Naświetlać promieniami γ promieniami 4 000 radów przez 40 min. Napromieniowane robaki (P0) przenieść na świeże płytki z nasionami OP50 (4 robaki/płytkę). Robaki mogą być alternatywnie naświetlane dawką 300 J/^m2 UVs.
   3. Przenieś 10-20 transformantów F1 z każdej płytki na poszczególne płytki, oznacz płytki odpowiednim początkiem P0.
   4. Wyodrębnij 2-4 transformatory F2 dla każdego F1, aby oddzielić płyty. Sprawdź potomstwo F3 pod kątem 100% transmisji markera transformacji. Zazwyczaj 1-3% potomstwa napromieniowanego robaka będzie miało zdarzenie integracyjne.
   5. Zrób zapasy trzech lub więcej niezależnych linii transformatorowych.

2. Testy behawioralne

1. Synchronizacja wieku.
   1. Hoduj robaki na standardowych 10 cm płytkach NGM + OP50 E. coli, aż do osiągnięcia dużej populacji grawitacyjnych dorosłych osobników (3-5 dni).
   2. Zbierz robaki do probówek Falcon o pojemności 50 ml, zawieszając je w 1 ml buforze M9.
   3. Dodać 5 ml buforu M9 i odwirować przy 450 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant. Powtórz 3-4 razy.
   4. Pod koniec ostatniego wirowania usunąć supernatant i dodać 10 objętości zasadowego roztworu podchlorynu (0,5 M NaOH, 1% świeżo wymieszanego podchlorynu) do granulowanych robaków. Inkubować w temperaturze pokojowej przez ~10 min. Reakcję lizy można monitorować, umieszczając kroplę reakcji lizy na szkiełku nakrywkowym i badając robaki pod mikroskopem. Gdy około 80% robaków zostanie uszkodzonych, reakcję należy zatrzymać.
   5. Zatrzymaj reakcję lizy, dodając taką samą objętość sterylnego buforu jajowego.
   6. Zebrać jaja (i tusze) przez odwirowanie przy 450 x g przez 5 minut.
   7. Umyj jajka sterylnym buforem do jaj 2-3x.
   8. Inkubować jaja O/N w buforze M9 i wysiać je na standardowych płytkach NGM.
2. Test chemotaksji.
   1. Przygotuj kilka kawałków agaru o wymiarach około 0,5x0,5x0,5 cm. Agar umieszczamy na 10-centymetrowej płytce i stamtąd kroimy kawałki agaru.
   2. Namocz kawałek agaru w roztworze zawierającym pożądany atraktant (w stężeniach nasyconych, bliskich nasycenia) przez 2 godziny. Typowymi atraktantami są lizyna (0,5 M), biotyna (0,2 M).
   3. Umieścić kawałek agaru na 10-centymetrowej płytce testowej, na której zaznaczono położenie miejsca testowego i punktu kontrolnego (rysunek 1A). Umożliwić zrównoważenie i utworzenie gradientu O/N (rysunek 1B). Przygotuj 5 talerzy do jednego eksperymentu.
   4. Przed eksperymentem dodaj 10 μl 20 mM NaN₃ (środka znieczulającego) do każdego miejsca.
   5. Umieść 20 robaków zsynchronizowanych z wiekiem na środku płytki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 20 °C.
   6. Po 1 godzinie policz zwierzęta w miejscach testowych/kontrolnych i oblicz wskaźnik chemotaksji (C.I.) w następujący sposób: gdzie N, N_test i N_Cnt., wskazują całkowitą liczbę zwierząt, liczbę zwierząt w miejscu testowym i liczbę zwierząt w miejscu kontroli.

3. Pierwotna hodowla komórek embrionalnych

1. Robaki lizują zgodnie z opisem w synchronizacji wieku.
2. Zatrzymać reakcję lizy, dodając taką samą objętość sterylnego buforu jaj i odwirować w stężeniu 450 x g przez 5 minut. Delikatnie wyrzucić supernatant, uważając, aby nie stracić granulowanych jaj. Powtórzyć 2-3 razy lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny.
3. Zawiesić jaja granulowane (i tusze) w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodać 2 ml sterylnej 60% sacharozy do buforu jaj. Mieszać ten roztwór, aż jaja zostaną całkowicie ponownie zawieszone (ponieważ mają tendencję do tworzenia grudek podczas wirowania) ręcznie lub przez wirowanie.
4. Wirować przy 450 x g przez 15 min.
5. Ostrożnie przenieść supernatant (zawierający jaja) do sterylnej probówki. Wyrzucić osady, które zawierają tusze i inne produkty uboczne lizy.
6. Usunąć pozostałości sacharozy poprzez ponowne zawieszenie jaj w buforze jaj i odwirowanie przy 450 x g przez 5 minut. Delikatnie zebrać i wyrzucić supernatant. Powtórz 3 razy.
7. Pod kapturem laminarnym ponownie zawiesić granulowane jaja w sterylnym buforze jajowym zawierającym 1 U/ml chitynazy w temperaturze pokojowej w celu strawienia skorupek jaj. Po 30 minutach rozpocząć monitorowanie reakcji (pod mikroskopem hodowli komórek odwróconych). Każda partia chitynazy ma nieco inną aktywność. Zazwyczaj trawienie kończy się w ciągu 1 godziny.
8. Gdy około 70-80% skorupek jaj zostanie strawionych przez chitynazę, dodaj CM-15 (pożywka do hodowli komórkowych L-15 zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny). Oddziel komórki za pomocą strzykawki z rozmiarem 27. Przefiltruj zawiesinę komórkową za pomocą filtra 5,0 μm, aby usunąć nienaruszone zarodki, grudki komórek i larwy.
9. Zawiesinę zdysocjowanych komórek osadzać przez odwirowanie przy 450 x g przez 15 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli komórek CM-15.
10. Płytki zdysocjowanych komórek na szklanych szkiełkach nakrywkowych uprzednio pokrytych lektyną z orzeszków ziemnych (0,1 mg/ml) rozpuszczoną w wodzie. Uwaga: komórki muszą przylegać do podłoża, aby się różnicować.
11. Komórki mogą być utrzymywane w temperaturze pokojowej (16-20 °C) w powietrzu przez ponad 2 tygodnie.

Wyniki

Dzięki naszym protokołom badamy wpływ ludzkiego oligomeru Aβ₄₂ na funkcję neuronów ⁸. Fragment kodujący ludzki Aβ₄₂ i sztuczną sekwencję kodującą peptyd sygnałowy wektora ognia pPD50.52 amplifikowano z konstruktu PCL12 ⁹ przy użyciu starterów, które wprowadziły miejsce endonukleazy restrykcyjnej Sma 1 na końcach. Fragment został następnie umieszczony w konstrukcie zawierającym sekwencję promotora flp-6 o długości 2 481 pz w wektorze pożaru pPD95.75 między unikalnym mie...

Dyskusja

Tutaj opisujemy podejście łączone do badania komórkowych i molekularnych aspektów amylopatii przy użyciu C. elegans. Zalety tego podejścia to: 1) niski koszt. C.elegans jest utrzymywany na normalnej szalce Petriego obsianej bakteriami, w temperaturze pokojowej. 2) Potężna genetyka. Zwierzęta transgeniczne można uzyskać w ciągu kilku miesięcy, a szeroki wachlarz sekwencji promotorowych jest dostępny do napędzania ekspresji pożądanego genu w określonych neuronach. 3) Prosty, dobrze scharakteryzowany układ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. NGM
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Agar bakteriologiczny	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-pepton	AMRESCO	J636	2,5 g
Woda			Doprowadzić do 975 ml
Sterylizowane w autoklawie, następnie dodaj następujące elementy i dobrze wymieszaj
: Siarczan	magnezuSigma-Aldrich	M2643	1 ml 1 M bulionu
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml 1 M bulionu
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml 5 mg / ml bulionu
		Bufor fosforanu potasu	25 ml 1M zapasu
2. Bufor fosforanu potasu
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Woda			Doprowadzić do 1 L
Sterylizowane przez autoklawowanie
3. M9 bufor
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml bulionu 1 M
Woda			Doprowadzić do 1 l
Sterylizowane przez autoklawowanie
4. Bufor jaj (pH 7,3, 340 mOsm)
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
		destylowana	Doprowadź do 1 L
Sterylizowane przez autoklawowanie
5. CM-15
L-15 pożywka hodowlana	Gibco	11415	450 ml
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437-028	50 ml
Penicylina	Gibco	15140	50 jednostek/ml
Streptomycyna	Gibco	15140	50 g/ml
Dostosuj do 340 mOsm z sacharozą, a następnie sterylnie przefiltruj do autoklawowanych butelek i przechowuj w temperaturze 4 &stopni; C
6. Inne odczynniki< / mocny>
olej Halocarbon 700	Produkty halowęglowe	9002-83-9
5 μ m Filtr strzykawkowy Acrodisc PALL	Co.	4199
Chitynaza	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lektyna (orzechy ziemne)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	S320
Lizyna	Sigma-Aldrich	L5501
Biotyna	Sigma-Aldrich	B4639
Roztwór	podchlorynu soduSigma-Aldrich	425044
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	71289
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389