Opisujemy procedurę i analizę danych chemicznego systemu przesiewowego sygnalizacji glikokortykosteroidowego hormonu stresu za pomocą larw danio pręgowanego: test aktywności lucyferazy zebry reagujący na glikokortykosteroidy in vivo (GRIZLY). Test z czułością i swoistością wykrywa wpływ związków wymagających metabolizowania lub wpływających na endogenną produkcję glikokortykosteroidów na sygnalizację glikokortykosteroidów.
Artykuł metodologiczny
Chemiczna procedura przesiewowa sygnalizacji glikokortykosteroidów za pomocą systemu reporterowego lucyferazy larw danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glikokortykosteroidowe hormony stresu i ich sztuczne pochodne są powszechnie stosowanymi lekami w leczeniu stanów zapalnych, ale długotrwałe leczenie glikokortykosteroidami może prowadzić do poważnych skutków ubocznych. Systemy testowe są potrzebne do poszukiwania nowych związków wpływających na sygnalizację glikokortykosteroidową in vivo lub do określania niepożądanego wpływu związków na szlak sygnałowy glikokortykosteroidów. Opracowaliśmy transgeniczny test danio pręgowanego, który umożliwia pomiar aktywności sygnalizacyjnej glikokortykosteroidów in vivo i w czasie rzeczywistym, test GRIZLY (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Lucyferase activitY). Test oparty na lucyferazie wykrywa wpływ na sygnalizację glikokortykosteroidową z wysoką czułością i swoistością, w tym wpływ związków, które wymagają metabolizowania lub wpływają na endogenną produkcję glikokortykosteroidów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół przeprowadzania badań przesiewowych chemicznych za pomocą tego testu. Opisujemy pozyskiwanie, normalizację i analizę danych, kładąc nacisk na kontrolę jakości i wizualizację danych. Test zapewnia prosty, rozdzielczy w czasie i ilościowy odczyt. Może być obsługiwana jako samodzielna platforma, ale można ją również łatwo zintegrować z przepływami pracy związanymi z badaniami przesiewowymi o wysokiej przepustowości. Ponadto pozwala na wiele zastosowań poza badaniami chemicznymi, takich jak monitorowanie środowiska pod kątem substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub badania nad stresem.
Wprowadzenie
Glikokortykosteroidy (GCs) to hormony steroidowe wytwarzane przez nadnercza, które odgrywają ważną rolę podczas reakcji na stres i w regulacji metabolizmu1. GC wiążą cytoplazmatyczne receptory glikokortykosteroidowe (GR) z nadrodziny receptorów jądrowych, które po związaniu translokują się do jądra2. W tym przypadku mogą na przykład hamować transkrypcję poprzez interferencję z innymi czynnikami transkrypcyjnymi (transrepresja) lub aktywować transkrypcję genów poprzez elementy odpowiedzi glikokortykosteroidowej (GRE, transaktywacja). Ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne, zarówno naturalne, jak i sztuczne GK są szeroko stosowanymi lekami w leczeniu wielu chorób, takich jak astma czy zapalenie stawów3. Jednak szczególnie długotrwałe stosowanie GKS może prowadzić do poważnych skutków ubocznych, w tym cukrzycy i jaskry4. W związku z tym bardzo poszukiwane są nowe związki ukierunkowane na sygnalizację GC o potencjalnie korzystniejszej skuteczności i tolerancji leczenia. Co ważne, efekty ligandów obserwowane w hodowanych komórkach mogą różnić się od tych obserwowanych in vivo5. Takie efekty mogą zniekształcać wyniki uzyskane za pomocą konwencjonalnych farmaceutycznych testów przesiewowych opartych na hodowlach komórkowych. Ostatnio skupiono się na chemicznych badaniach przesiewowych in vivo, które umożliwił model danio pręgowanego, ponieważ pozwalają one na określenie skutków niewykrywalnych w hodowli komórkowej6,7.
Hormonalne szlaki sygnałowe mogą być również zakłócone przez zanieczyszczenia środowiska. Tak zwane substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) wpływają na różne procesy regulowane hormonalnie8. W ten sposób rozmnażanie i różnicowanie płciowe organizmów wodnych może być modulowane przez substancje o działaniu podobnym do estrogenu. Ostatnio pojawiły się obawy, że zaburzenia metaboliczne mogą być związane z EDC w środowisku9. Jednym ze szlaków, na który ukierunkowane jest takie "zakłócenie metaboliczne", jest szlak glikokortykosteroidowy, który jest również zaangażowany w wpływ ksenobiotyków na rozwój i funkcjonowanie układu odpornościowego10,11. Jednak w porównaniu z dużą ilością dostępnych informacji na temat związków zakłócających działanie steroidowych hormonów płciowych, stosunkowo niewiele wiadomo na temat skutków zaburzeń endokrynologicznych, w których pośredniczy GR. W związku z tym potrzebne są narzędzia, które pozwolą monitorować wpływ zanieczyszczeń na sygnalizację GC in vivo.
Danio pręgowany od dawna jest popularnym modelem w biologii rozwojowej, a ostatnio przyciągnął również badaczy z innych dziedzin, w tym endokrynologii12. W porównaniu z innymi teleostami, system sygnalizacyjny GC danio pręgowanego jest bardziej podobny do systemu ssaków, ponieważ genom danio pręgowanego zawiera tylko jeden gen GR, w przeciwieństwie do zduplikowanych receptorów u wielu innych gatunków ryb13-15. Ponadto oś podwzgórze-przysadka-nadnercza jest już funkcjonalna u 5-dniowych larw danio pręgowanego, które zwiększają endogenną produkcję GC w odpowiedzi na stresory14,16-18.
Niedawno stworzyliśmy transgeniczną linię danio pręgowanego, GRE:Luc, która pozwala na monitorowanie aktywności sygnalizacji GC in vivo i w czasie rzeczywistym18. Linia przenosi konstrukt genu reporterowego lucyferazy pod kontrolą minimalnego promotora TATA box i czterech połączonych GRE (Figura 1a). Bioluminescencję indukowaną GC można zmierzyć na podstawie pojedynczych larw GRE:Luc w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych in vivo przez dłuższy czas. Ten test GRIZLY (dla "Glicocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Lucyferase activitY") może być stosowany w wielu różnych dziedzinach badawczych, takich jak badania nad stresem, monitorowanie środowiska i badania farmakologiczne18. Byliśmy w stanie wykryć endogenny wzrost kortyzolu po stresie osmotycznym od pojedynczych larw i mogliśmy śledzić dojrzewanie odpowiedzi podczas rozwoju. Co więcej, możemy monitorować wpływ na sygnalizację GC organotin, które wymagają metabolizowania przez larwę. Co ważne, linia była w stanie wykryć te efekty w stężeniach istotnych dla środowiska. Wreszcie, w pilotażowym badaniu przesiewowym test z czułością i specyficznością wykrył związki o aktywności GC z biblioteki chemicznej, w tym jeden związek, który stymulował endogenną produkcję kortyzolu u larw. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół badań przesiewowych substancji chemicznych z wykorzystaniem testu GRIZLY.
Protokół
1. Przygotuj robocze rozcieńczenie biblioteki chemicznej
Wstępnie rozcieńcz związki z biblioteki leków, które mają być testowane (np. leki zatwierdzone przez FDA, ENZO Life Science) do E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2) za pomocą zrobotyzowanej stacji obsługi cieczy (np. Multiprobe II, 8 igieł z adapterem końcówki do utylizacji, PerkinElmer). Odpowiednie stężenia to np. 40 μg/ml w 3% DMSO, ale będzie to zależało od rodzaju używanej biblioteki. Ustawienia Multiprobe II odpowiadające krokom opisanym poniżej przedstawiono w Tabeli 1. Protokół opisany w tabeli pozwala na przygotowanie równolegle czterech podwielokrotnych płytek.
- Odpipetować 10 μl podwielokrotności z biblioteki podstawowej (2 mg/ml w DMSO) do płytek głębinowych (np. 96-dołkowa płytka do przechowywania, okrągła studzienka, 0,8 ml, ABgene). Kolumny 1 i 12 należy pozostawić puste - otrzymają one dodatnie i ujemne kontrolki wewnątrz płytki.
- Dozować 490 μl E3 z 1% DMSO do przygotowanych porcji biblioteki za pomocą Multiprobe II. Rozcieńczanie przeprowadza się za pomocą stałych igieł bez końcówek do usuwania.
- Dodać 10 μl DMSO do kolumny 1 i 10 μl 5 mM roztworu deksametazonu (w DMSO) do kolumny 12 jako kontrole wewnątrzpłytkowe. Stężenie DMSO we wszystkich studzienkach wynosi obecnie 3%, stężenie deksametazonu w studzienkach kontroli pozytywnej wynosi 100 μM w E3/3% DMSO.
- Uszczelnij płytę za pomocą klejowych arkuszy uszczelniających odpornych na DMSO. Przechowuj płytki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
2. Hodowla ryb reporterskich
Zbieraj embriony z naturalnego tarła krzyżowania grupowego między transgenicznymi rybami GRE:Luc. Hodować zarodki (nie więcej niż 60) na 9 cm szalkach Petriego zawierających pożywkę E3 uzupełnioną 1 mg/ml fungicydu błękitu metylenowego przez 4 dni po zapłodnieniu (dpf) w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Regularnie zmieniać podłoże E3.
3. Przygotowanie pożywki lucyferazy (E3L)
Przygotuj wodny roztwór podstawowy lucyferyny o objętości 50 mM, dodając dH2O do fiolki zawierającej proszek lucyferyny. Ten roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Rozcieńczyć lucyferynę w pożywce E3 do końcowego stężenia 0,5 mM, aby uzyskać pożywkę E3L.
4. Rozmieść larwy na 96 płytkach dołkowych
- Przygotować końcówki do pipet o pojemności 1 ml z szerokim otworem, odcinając około 5 mm końcówki i krótko podpalając ostre krawędzie.
- Zbierz larwy z kilku krzyżówek, ostrożnie wlewając je z szalek Petriego do zlewki. Zbierz jednorazowo około 50 larw, delikatnie wysypując je na sito (porów o średnicy 0,25 mm) i natychmiast umieść sitko na małej szalce Petriego (średnica 5,5 cm) wypełnionej podłożem E3L.
- Za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze przenieść 225 μl pożywki zawierającej po jednej larwie do studzienek na białej płytce 96-dołkowej (OptiPlate, PerkinElmer).
- Uszczelnić płytki za pomocą samoprzylepnych arkuszy uszczelniających (np. TopSeal-A, PerkinElmer) i inkubować je w temperaturze 28 °C przez noc. Ta preinkubacja zapobiega rejestrowaniu przejściowych zmian w bioluminescencji bezpośrednio po dodaniu lucyferyny, zjawiska, które występuje również w hodowanych komórkach19.
5. Leczenie farmakologiczne
- Wyjąć płytkę zawierającą robocze rozcieńczenie biblioteki z zamrażarki w temperaturze -80 °C na około 4 godziny przed użyciem. Delikatnie zwiruj płytkę i krótko obróć ją w wirówce, aby zebrać płyn na dnie płytki.
- Usuń samoprzylepne arkusze uszczelniające z płytek larw.
- Za pomocą ręcznego 96-kanałowego urządzenia pipetującego (np. Liquidator, Steinbrenner) należy odpipetować roztwór leku 3 razy w górę i w dół. Następnie podamy 25 μl roboczego rozcieńczenia biblioteki chemicznej do studzienek zawierających larwy (w powyższym przykładzie daje to końcowe stężenie 4 μg/ml w E3 przy 0,3% DMSO). Przygotuj 10 (minimum: 5) replik płytek z larwami na płytkę biblioteczną.
- Uszczelnij tabliczki samoprzylepnymi arkuszami uszczelniającymi i oznacz każdą płytę naklejką z kodem kreskowym.
6. Zapis luminescencji
- Umieść płytki zawierające larwy w jednostkach układających czytnik bioluminescencji EnVision o zwiększonej czułości luminescencji (PerkinElmer). Alternatywnie można użyć zrobotyzowanego systemu inkubatora, takiego jak te stosowane w systemach badań przesiewowych hodowli komórek ssaków w połączeniu z czytnikiem.
- Rejestruj bioluminescencję przez dwa dni przy użyciu ustawień czytnika analogicznych do opisanych w Tabeli 2 dla czytnika EnVision. Dostosuj liczbę powtórzeń testu do liczby płytek w serii, aby dopasować ją do wymaganego czasu trwania.
- Po zakończeniu cyklu należy sprawdzić płytki pod kątem obecności martwych larw, aby ocenić ogólną toksyczność związków.
7. Analiza danych
Wszystkie analizy danych są wykonywane w statystycznym środowisku programowania R przy użyciu niestandardowych skryptów.
- Obliczanie AUC
W celu identyfikacji związków aktywujących sygnalizację GC niezależnie od ich właściwości kinetycznych, należy określić obszar pod krzywą (AUC) zarejestrowanych śladów luminescencji (liczba surowych bioluminescencji w funkcji czasu) jako parametr przesiewowy. AUC są aproksymowane za pomocą reguły trapezowej (patrz rysunki 2a i a'). - Normalizacja
Log przekształca wartości AUC, aby zapewnić wyższą normalność danych (rysunki 2b i b'). Następnie znormalizuj wartości AUC przekształcone logarytmicznie dla każdej płytki bibliotecznej za pomocą solidnej metody Z-score (patrz 20). Ta normalizacja daje w wyniku wartości reprezentujące liczbę odchyleń standardowych od mediany wszystkich punktów danych. W ten sposób błędy systematyczne, takie jak zmienność między przebiegami, są usuwane z danych. Dane można teraz wizualizować, wykreślając średni solidny wskaźnik Z replik dla każdego dołka (rysunki 2c i c'). - Wskaźniki jakości
- Mapa cieplna
Aby zobrazować efekty związane z płytą, należy wykreślić dane dla każdej płyty jako mapę cieplną, korzystając np. z funkcji heatmap.2 pakietu gplot21. W ten sposób można łatwo wykryć efekty krawędziowe lub przeniesienie związków (np. porównaj rysunek 3a z rysunkiem 3b). Wyklucz nieoptymalne płyty z dalszej analizy. - Krzywa ROC
Aby określić czułość i swoistość testu, należy obliczyć krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), np. za pomocą pakietu bioprzewodników ROC22, korzystając z wartości Z-score określonych w 7.2 (rysunek 3c). Następnie należy określić wartość AUC tej krzywej. Wartość AUC bliska 1 wskazuje na wysoką czułość i swoistość testu.
- Mapa cieplna
- Identyfikacja trafienia
Aby zoptymalizować wartość odcięcia dla identyfikacji związków aktywnych, należy określić indeks Youdena. Aby obliczyć indeks, odejmij szacowany odsetek wyników prawdziwie dodatnich (TPR) od wskaźnika wyników fałszywie dodatnich (FPR) krzywej ROC w celu zwiększenia solidnych wartości odcięcia Z-score. Jako punkt odcięcia przyjmij solidny wskaźnik Z z najwyższym indeksem Youden (TPR minus FPR). TPR/FPR można oszacować poprzez wykrycie studzienek kontroli pozytywnej lub znanych związków czynnych w bibliotece. Korzystając ze studzienek kontroli pozytywnej, upewnij się, że są one zgodne z przewidywaną siłą trafienia.
8. Ponowne testowanie
- Ponowna ocena związków o dodatnim trafieniu poprzez traktowanie larw seryjnymi rozcieńczeniami związków uzyskanych od innego dostawcy, przy użyciu tego samego zestawu do rejestrowania, który opisano powyżej. Prawdziwe trafienia powinny indukować luminescencję również w tym teście, najlepiej w sposób zależny od dawki.
Wyniki
W poprzedniej publikacji18 przeprowadziliśmy wstępne przesiewanie biblioteki 640 leków zatwierdzonych przez FDA, aby ocenić wydajność testu GRIZLY. Biblioteka ta zawierała 12 potwierdzonych bona fide GC, co pozwoliło nam określić wskaźniki jakościowe dla czułości i swoistości testu.
Rysunek 2 przedstawia typowe przykłady analizy danych surowych i normalizacji uzyskanych z tego ekranu. Typowy wynik z studni kontrolnej z deksametazonem przedstawiono na Rysunku 2a, co ilustruje informacje czasowe dostarczone przez dane. Szczyt bioluminescencji, który występuje około 12 hr po zastosowaniu preparatu, powoli maleje przez kolejne 36 hr pomiaru. Rysunek 2a' wyróżnia przybliżenie wartości AUC przy użyciu metody trapezów. Obliczenie to jest wykonywane dla wszystkich studni i każdego powtórzenia technicznego. Wynik transformacji logarytmicznej przedstawiono na Rysunkach 2b i b'. Tutaj średnie z kontroli pozytywnych są naniesione na normalny wykres Q-Q. Transformacja logarytmiczna prowadzi do lepszego przybliżenia punktów danych do teoretycznych wartości o rozkładzie normalnym, wskazanych przez czerwone przekątne. Transformacja w celu uzyskania normalności danych zwiększa moc statystyczną późniejszych analiz. Na koniec, Rysunki 2c i 2c' pokazują wpływ normalizacji robust Z-score na zmienność między płytkami: różne wartości bazowe uzyskane z różnych płytek (Rysunek 2c) zostały znormalizowane na wykresie robust Z-score na Rysunku 2c'.
Wartości odpornych wskaźników Z-score mogą być wykorzystane do identyfikacji błędów systematycznych w danych poprzez wizualizację rozkładu trafień na płytkach. Rysunek 3a przedstawia przykład mapy ciepła płytki biblioteki, na której wartości odpornych wskaźników Z-score są naniesione w formie kolorystycznej w pozycjach studni. Łatwo zidentyfikować kolumnę 12 z dodatnimi kontrolami wewnątrz płytki. Związki biblioteczne z dodatnim wynikiem widoczne są w studni F8 oraz, choć w mniejszym stopniu, w E2. Rysunek 3b przedstawia płytkę, w której występuje błąd systematyczny. Obserwuje się serię związków o malejących wartościach Z-score w rzędach A i E w obrębie kilku kolumn. Żaden ze związków w tych studniach nie uzyskał wyniku dodatniego podczas ponownego testowania. Ponieważ studnie z taką malejącą aktywnością w teście GRIZLY znajdują się wzdłuż ścieżki, po której porusza się robot pipetujący podczas dozowania płytki biblioteki, wzorzec ten wskazuje na przeniesienie związku dodatniego podczas procesu automatycznego pipetowania.
Solidna normalizacja Z-score wraz z obecnością znanych GC w bibliotece pozwoliły nam również na wykreślenie krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla przesiewu18. Rysunek 3c przedstawia wykres szacowanej odsetki wyników prawdziwie dodatnich w funkcji szacowanej odsetki wyników fałszywie dodatnich dla różnych wartości odcięcia solidnego Z-score. Szacowana odsetka wyników prawdziwie dodatnich jest definiowana jako procent trafień prawdziwie dodatnich (w tym przypadku znanych glikokortykoidów obecnych w bibliotece), które zostaną zidentyfikowane przy danej wartości odcięcia solidnego Z-score. Odpowiadająca jej szacowana odsetka wyników fałszywie dodatnich wskazuje procent związków niepozytywnych uznanych za trafienia przy tej wartości odcięcia. AUC tej krzywej wynosi 0,95, co wskazuje na wysoką czułość i swoistość przesiewu oraz doskonałą wydajność testu. Krzywa AUC została również wykorzystana do oszacowania optymalnej wartości odcięcia dla identyfikacji trafień poprzez obliczenie indeksu Youdena dla różnych wartości solidnego Z-score. Ustaliliśmy, że wartość solidnego Z-score wynosząca 1,49 posiada najwyższy indeks Youdena. Wartość odcięcia ta jest zaznaczona na Rysunku 2c' jako czarna linia oddzielająca trafienia od pozostałej części związków.
W naszym przesiewie18 zdołaliśmy zidentyfikować niemal wszystkie znane GC obecne w bibliotece. Tylko trzy z 12 rzeczywistych (bona fide) GC nie zostały wykryte. W przypadku octanu melengestrolu był to wynik fałszywie ujemny, ponieważ związek ten dał wynik dodatni w teście powtórnym przy zastosowaniu wyższego stężenia niż to użyte w bibliotece. Pozostałe dwa GC dały wynik negatywny również w teście powtórnym. Kortykosteron jest głównym GC u gryzoni, ale nie u ryb ani ludzi1, natomiast prolek prednizon może nie być dobrze metabolizowany przez system larwalny. Co ciekawe, w przesiewie zidentyfikowano również dwa leki nieopisane jako GC, z których jeden nie został potwierdzony w teście powtórnym (spironolakton, antagonista receptora mineralokortykoidowego). Drugi związek, pregnenol, jest prekursorem w biosyntezie steroidów, który jest przekształcany w kortyzol przez nadnercza. Rzeczywiście, zastosowanie pregnenolu stymulowało produkcję kortyzolu u larw18. Wszystkie te wyniki potwierdzają wysoką wydajność analizy: wśród wyników pierwotnego przesiewu znalazł się tylko jeden związek fałszywie ujemny i jeden fałszywie dodatni, a 10 z 11 potwierdzonych związków o aktywności stymulującej sygnalizację GC zostało zidentyfikowanych już w przesiewie pierwotnym.
Rysunek 1. Ogólna zasada testu i schemat procedury przesiewowej. a) Schemat konstruktu reporterowego testu GRIZLY. Ekspresja lucyferazy (żółta) jest kontrolowana przez minimalny promotor (Pmin, pomarańczowy) oraz cztery zconcatemeryzowane elementy GRE ((GRE)4, białe), z którymi wiążą się aktywowane ligandem homodimery GR (GR, niebieskie). Czerwone pola oznaczają miejsca transposazy Tol2, które ułatwiają integrację konstruktu z genomem. Różowy obszar reprezentuje miejsce poliadenylacji (pA). Larwy transgeniczne niosące ten konstrukt są umieszczane w nieprzezroczystych płytkach mikrotitracyjnych 96-dołkowych w celu pomiaru bioluminescencji. b) Schemat reakcji lucyferazowej. Lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny do oksylucyferyny, co prowadzi do emisji światła (hν). Reakcja wymaga również ATP i Mg2+, które są dostarczane przez larwę. PPi, pirofosforan. c) Schemat procesu przesiewowego. Rozcieńczenia roztworów roboczych są przygotowywane z biblioteki leków zatwierdzonych przez FDA w płytkach 96-dołkowych, gdzie jedna kolumna zawiera wewnątrz płytkową kontrolę negatywną (sam DMSO, zielony), a jedna kolumna kontrolę pozytywną (deksametazon, czerwony) (projekt biblioteki). Larwy GRE:Luc są rozmieszczone w płytkach 96-dołkowych (5-11 powtórzeń) i traktowane związkami z biblioteki (aplikacja leku). Krzywe bioluminescencji są rejestrowane za pomocą czytnika bioluminescencji przez dwa dni (gromadzenie danych). Krzywe bioluminescencji są całkowone (obliczenia AUC), poddawane transformacji logarytmicznej i normalizowane za pomocą odpornego Z-score (normalizacja). Znormalizowane dane służą do wyznaczania wskaźników jakości i identyfikacji trafień (analiza danych). Wybrane trafienia są ponownie testowane pod kątem aktywności zależnej od dawki w teście (retest). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Rysunek 2. Analiza danych zilustrowana danymi z przesiewu biblioteki leków zatwierdzonych przez FDA. a) Reprezentatywny zapis z dołka kontroli pozytywnej. a') Pole pod krzywą (AUC) jest przybliżane za pomocą reguły trapezów. Trapezy wykorzystane do obliczeń są przedstawione w różnych odcieniach czerwieni. b) Normalny wykres Q-Q surowych wartości AUC dla studni kontroli dodatniej (oś y) w zestawieniu z populacją standardową o rozkładzie normalnym (oś x) przed transformacją logarytmiczną. b') Normalny wykres Q-Q wartości AUC po transformacji logarytmicznej. Rozkład normalny jest wskazany przez liniowość punktów danych po transformacji logarytmicznej. c) Wykres logarytmicznie przekształconych surowych danych dla wszystkich związków przetestowanych w badaniu przesiewowym. Niebieski, w dobrej wierze glikokortykosteroidy; szary, wszystkie pozostałe związki. c') Wykres danych z przesiewu po zastosowaniu metody robust Znormalizacja wyników. Z danych usunięto błędy systematyczne, takie jak różnice między płytkami. Czerwone linie wskazują średnią ± s.e.m. dla dodatnich kontrol wewnętrznych danej płytki. Linia czarna: wartość odcięcia dla identyfikacji hitów, wyznaczona poprzez optymalizację indeksu Youdena (Rycina 3). Powielono za zgodą14, 2012 ACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.
Rysunek 3. Wyniki przesiewania. a) Mapa ciepła wyników przesiewania. Wartości robust Z-score związków z biblioteki są naniesione na odpowiadające im pozycje studzienek. Widoczne są kontrole pozytywne w kolumnie 12 oraz dwa pozytywne związki hit w studzienkach F8 i E2. b) Mapa ciepła płytki pokazująca przeniesienie związku pozytywnego podczas przygotowania biblioteki za pomocą robota pipetującego. Wzdłuż ścieżki pipetowania robota widoczny jest gradient aktywności. c) Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla przesiewania. Szacowane wskaźniki wyników prawdziwie dodatnich (lewa oś y) i wyników fałszywie dodatnich (oś x) są naniesione dla rosnących wartości odcięcia robust Z-score (oznaczone kolorami, prawa oś y). Wartość AUC wynikowej krzywej jest bliska 1, co wskazuje na dobrą wydajność testu. Reprodukowano za zgodą 14, 2012 ACS. d) Tabela przedstawiająca związki aktywne (żółte) lub nieaktywne (niebieskie) w przesiewaniu pierwotnym (prim.) lub w powtórnym teście. Glikokortykosteroidy bona fide nie zawsze były testowane ponownie (białe). Prerysowano za zgodą 14, 2012 ACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
| Ustawienia ogólne: | |||
| Krok 1.1 | |||
| Procedura | typ: | pojedynczy ciecz | |
| tryb: | wydmuchanie | ||
| liczba dozowań na aspirację: | 1 | ||
| optymalizacja szybkości: | Tak | ||
| system przerw powietrznych: | 10 μl | ||
| transport: | 0 | ||
| Płukanie/Mycie | Nie | ||
| Aspiracja | Typ ustawienia | Wartość | Uwagi |
| Pozycja | B7, B10, B13, B16 | ||
| Obj. aspiracji | 10 μl | ||
| Szybkość | 200 μl/sec | ||
| Śledzenie cieczy | 60% | ||
| Wysokość aspiracji | Domyślna dla naczynia | 22.28 | |
| Dozowanie | Typ ustawienia | Wartość | Uwagi |
| Pozycje | D7, D10, D13, D16 | ||
| Obj. dozowania | 10 μl | ||
| Szybkość | 200 μl/sec | ||
| Śledzenie cieczy | 100 μl | ||
| Wysokość dozowania | Domyślna dla naczynia | 17.01 | |
| Krok 1.2 | |||
| Procedura | typ: | odczynnik | |
| tryb: | odpady | ||
| liczba dozowań na aspirację: | 3 | ||
| optymalizacja szybkości: | Tak | ||
| system przerw powietrznych: | 15 μl | ||
| transport: | 0 | ||
| Płukanie/Mycie | Nie | ||
| Aspiracja | Typ ustawienia | Wartość | Uwagi |
| Pozycja | A4 | ||
| Obj. aspiracji | 3 x 490 μl | ||
| Przerwy powietrzne | 15 i 0 | ||
| Szybkość | 200 μl/sec | ||
| Śledzenie cieczy | 400% | ||
| Wysokość aspiracji | Powierzchnia cieczy | ||
| Dozowanie | Typ ustawienia | Wartość | Uwagi |
| Pozycja | D7, D10, D13, D16 | ||
| Obj. dozowania | 490 μl | ||
| Przerwy powietrzne | 15 i 0 | ||
| Szybkość | 200 μl/sec | ||
| Śledzenie cieczy | 100% | ||
| Wysokość dozowania | Domyślna dla naczynia | 17.01 | |
Tabela 1. Ustawienia dla Multiprobe II. Protokół w Tabeli 1 opisuje przygotowanie 4 płytek (każda po 96 dołków). Płytki znajdują się na adapterach w obszarze roboczym w pozycjach określonych przez robota (np. B7, B10, B13, B16).
| Ustawienia ogólne: | |||
| Liczba powtórzeń analizy | zależna od czasu trwania pomiaru | ||
| Liczba płytek | nieograniczona | ||
| Kontrola temperatury | 28 °C | ||
| Protokół | Obliczenia | ||
| Odczyt US Lum 96 (cps) | |||
| Czas pomiaru | 2,5 sec | Korekcja przenikania sygnału (crosstalk) | |
| Odległość między płytką a detektorem | 0 mm | ||
| Współczynnik korekcji Glow (CT2) | 0 % | ||
Tabela 2. Ustawienia EnVision zastosowane podczas przesiewania.
Dyskusja
Poniżej przedstawiamy przebieg pracy i analizę danych dla chemicznego badania przesiewowego mierzącego aktywność GC in vivo przy użyciu testu GRIZLY18. Test ma cechy kontroli jakości i wskaźniki wydajności, które są porównywalne z konwencjonalnymi badaniami przesiewowymi opartymi na komórkach, co jest ważną zaletą do stosowania w warunkach wysokiej przepustowości. Ponadto jednak test in vivo wykrywa również związki, które nie są dostępne dla badań przesiewowych in vitro . Przykładem tego jest obecność prohormonu pregnenolonu wśród hitów. W ten sposób test GRIZLY rozszerza zakres badań przesiewowych ukierunkowanych na aktywność sygnalizacyjną GC.
Znaczenie wykrywania efektów in vivo za pomocą naszego testu ilustrują również wyniki, które uzyskaliśmy z zanieczyszczeniami organicznymi DBT i TBT18. Wykazano, że DBT, ale nie TBT, hamuje sygnalizację GC w hodowli komórek ssaków i zaobserwowaliśmy to samo w kulturach komórkowych danio pręgowanego wyrażających reporter GRE: Luc. Co jednak ważne, w teście GRIZLY TBT wykazywał działanie hamujące na szlaku GC, ponieważ może zostać przekształcony w DBT przez metabolizm larw. Hamowanie to zaobserwowano już przy stężeniach TBT istotnych dla środowiska. Wyniki te dodatkowo ilustrują potencjał testu GRIZLY w wykrywaniu efektów złożonych na podstawie przesłuchów międzynarządowych i modyfikacji metabolicznych związków u żywego zwierzęcia. Podkreślają również potencjał aplikacyjny testu GRIZLY w monitorowaniu środowiska. W związku z tym działanie substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego można badać na poziomie sygnalizacji receptora, gdzie substancja zakłócająca zakłóca aktywność sygnalizacyjną GC indukowaną przez agonistę GR, takiego jak deksametazon. Inną możliwością jest badanie wpływu związków na syntezę GC stymulowaną pregnenolonem. Wysoka jakość przepustowości testu powinna umożliwić szybkie badanie przesiewowe bibliotek próbek środowiskowych.
Zastosowanie lucyferazy jako genu reporterowego pozwala na wysoki zakres dynamiki wykrywania aktywności sygnalizacyjnej23. Rzeczywiście, czułość testu umożliwia wykrycie produkcji GC wywołanej stresem osmotycznym z pojedynczych larw18. Wysoka rozdzielczość czasowa osiągnięta za pomocą reportera lucyferazy pozwala nam śledzić działania sygnalizacyjne w czasie, co umożliwia również analizę kinetyki danych.
Potencjalną wadą niektórych zastosowań jest ograniczona przydatność tego systemu reporterowego do monitorowania przestrzennego. Fluorescencyjne systemy reporterowe mogą być lepiej przystosowane do testów, które wymagają monitorowania określonych obszarów larw. Jednak takie testy mogą mieć niższą czułość ze względu na efekty tła spowodowane światłem wzbudzającym, co również stwarza ograniczenia w wykrywaniu związków fluorescencyjnych. Ponadto mogą zapewniać mniejszą rozdzielczość kinetyczną ze względu na ogólnie wyższą stabilność białek fluorescencyjnych23. Ponadto stanowią one wyzwania w zakresie sprzętu do obrazowania, analizy i przechowywania danych, które mogą ograniczać ich wykorzystanie w mniejszych laboratoriach badawczych.
Konfiguracja testu GRIZLY jako testu opartego na płytce mikromiareczkowej pozwala na łatwą integrację z typowymi przepływami pracy przesiewowej. Test jest łatwy do zastosowania również w mniejszych laboratoriach badawczych ze względu na prostą obsługę i analizę danych. Jednocześnie pozwala na znaczny stopień automatyzacji, np. zautomatyzowane nakładanie leków za pomocą robotów pipetujących lub zautomatyzowaną dystrybucję zarodków za pomocą urządzeń do sortowania zarodków24,25. Prosty odczyt nie wymaga zautomatyzowanych mikroskopów przesiewowych ani zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazu, a mimo to dostarcza bogatego zestawu danych na temat czasowych i ilościowych aspektów badanego szlaku sygnałowego.
Podsumowując, przedstawiamy krok po kroku protokół dla stosunkowo niedrogiego, solidnego i łatwego w obsłudze chemicznego testu przesiewowego pod kątem aktywności sygnalizacyjnej GC in vivo i w czasie rzeczywistym. Test umożliwia określenie wpływu in vivo związków na sygnalizację GC niewykrywalnych w testach opartych na hodowlach komórkowych. Wśród wielu zastosowań testu znajdują się np. określanie wpływu genetycznego na sygnalizację glikokortykosteroidową, monitorowanie środowiskowe wpływu substancji zaburzających gospodarkę hormonalną na syntezę glikokortykosteroidów i aktywność sygnalizacyjną oraz badania przesiewowe związków pod kątem niepożądanego wpływu na sygnalizację GC lub nowych modulatorów in vivo tego ważnego szlaku sygnałowego.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy S. Burkhartowi, C. Hofmannowi i Simone Gräßle za doskonałą pomoc techniczną i jesteśmy wdzięczni M. Fergowi za pomoc w analizie danych. Dziękujemy również S. Rastegarowi za krytyczne uwagi do manuskryptu. Potwierdzamy finansowanie przez Studienstiftung des deutschen Volkes (do MW), DFG (DI913/4-1) oraz Helmholtz Program BioInterfaces w KIT.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kompozycja buforowa + odczynniki | |||
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Biblioteka leków zatwierdzona przez FDA | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Metylen Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| E3 | N/A | N/A | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 |
| Instruments | |||
| Multiprobe II | PerkinElmer | 8-kanałowy, wyposażony w jednorazowy adapter końcówki | |
| Liquidator 96 | pipeta 96-kanałowa | Steinbrenner Laborsysteme | |
| Czytnik płyt EnVision XCite Multilabel | PerkinElmer | Wyposażony w automatyzację układarki, kontrolę temperatury, czytnik kodów kreskowych i ulepszony detektor | |
| Wyroby z tworzyw sztucznych + materiały eksploatacyjne | |||
| 96-dołkowa płyta do przechowywania | ABgene | AB-0765 | okrągła, 0,8 ml |
| Folie osłonowe, | 6018412 ratiolab | , odporne na DMSO | |
| Końcówki do pipet | Steinbrenner Laborsysteme | LRF-200L | do likwidatora 96, 200 μ l, niska retencja |
| TopSeal-A | PerkinElmer | 6005185 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005299 | biała, nieprzezroczysta, 96-dołkowa mikropłytka |
| Etykiety z kodami kreskowymi | PerkinElmer | 1608182 | |
| filtrowane polipropylenowe końcówki do pipet IsoTip | Corning | S058.4809 | |
| Animals | |||
| GRE:Luc fish | N/A | ZDB-TGCONSTRCT-120920-1 | dostępny w Europejskim Centrum Zasobów Danio Pręgowanego EZRC, Karlsruhe |
Bibliografia
- Norris, D. O. Vertebrate Endocrinology. , 4, Elsevier Academic Press. (2007).
- Kassel, O., Herrlich, P. Crosstalk between the glucocorticoid receptor and other transcription factors: molecular aspects. Mol Cell Endocrinol. 275, 13-29 (2007).
- Baschant, U., Tuckermann, J. The role of the glucocorticoid receptor in inflammation and immunity. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 69-75 (2010).
- Schacke, H., Docke, W. D., Asadullah, K. Mechanisms involved in the side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther. 96, 23-43 (2002).
- De Bosscher, K. Selective Glucocorticoid Receptor modulators. J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 96-104 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nat Protoc. 4, 1422-1432 (2009).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 3, 454-460 (2010).
- Casals-Casas, C., Desvergne, B. Endocrine disruptors: from endocrine to metabolic disruption. Annu Rev Physiol. 73, 135-162 (2011).
- Grun, F., Blumberg, B. Minireview: the case for obesogens. Mol Endocrinol. 23, 1127-1134 (2009).
- Odermatt, A., Gumy, C., Atanasov, A. G., Dzyakanchuk, A. A. Disruption of glucocorticoid action by environmental chemicals: potential mechanisms and relevance. J Steroid Biochem Mol Biol. 102, 222-231 (2006).
- Odermatt, A., Gumy, C. Glucocorticoid and mineralocorticoid action: why should we consider influences by environmental chemicals. Biochem Pharmacol. 76, 1184-1193 (2008).
- Lohr, H., Hammerschmidt, M. Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease. Annu Rev Physiol. 73, 183-211 (2011).
- Schaaf, M. J. Discovery of a functional glucocorticoid receptor beta-isoform in zebrafish. Endocrinology. 149, 1591-1599 (2008).
- Schaaf, M. J., Chatzopoulou, A., Spaink, H. P. The zebrafish as a model system for glucocorticoid receptor research. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 75-82 (2009).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. Gen Comp Endocrinol. 161, 62-66 (2009).
- Alsop, D., Vijayan, M. M. Molecular programming of the corticosteroid stress axis during zebrafish development. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 153, 49-54 (2009).
- Schoonheim, P. J., Chatzopoulou, A., Schaaf, M. J. The zebrafish as an in vivo model system for glucocorticoid resistance. Steroids. 75, 918-925 (2010).
- Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical Screening System for Glucocorticoid Stress Hormone Signaling in an Intact Vertebrate. ACS Chem Biol. 7, (2012).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20746-20751 (2008).
- Birmingham, A. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Warnes, G. R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W. H. A. gplots: Various R programming tools for plotting data. 2.11.0, (2012).
- Carey, V., Redestig, H. ROC: utilities for ROC, with uarray focus. , Boston, MA, USA. (2013).
- Fan, F., Wood, K. V. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol. 5, 127-136 (2007).
- Graf, S. F., Hotzel, S., Liebel, U., Stemmer, A., Knapp, H. F. Image-based fluidic sorting system for automated Zebrafish egg sorting into multiwell plates. J Lab Autom. 16, 105-111 (2011).
- Letamendia, A. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS ONE. 7, e36690(2012).
Przedruki i uprawnienia
