Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50440

⸱

14 sierpnia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Northwestern University, 2Department of Neurobiology, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Streszczenie

Jaskra, często związana z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym (IOP), jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Staraliśmy się ustalić mysi model nadciśnienia ocznego, aby naśladować ludzką jaskrę wysokiego ciśnienia. W tym przypadku oświetlenie laserowe jest stosowane do rąbka rogówki w celu fotokoagulacji odpływu wodnego, wywołując zamknięcie kąta. Zmiany ciśnienia wewnątrzgałkowego są monitorowane za pomocą tonometru odbicia przed i po zabiegu laserowym. Optomotoryczny test behawioralny służy do pomiaru odpowiednich zmian w zdolności widzenia. Pokazano reprezentatywny wynik dla jednej myszy, u której rozwinął się trwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego po oświetleniu laserowym. U tej myszy z nadciśnieniem ocznym obserwuje się obniżoną ostrość wzroku i wrażliwość na kontrast. Razem nasze badanie wprowadza cenny system modelowy do badania zwyrodnienia neuronów i leżących u jego podstaw mechanizmów molekularnych u myszy z jaskrą.

Protokół

Procedury

myszy C57BL/6J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) są hodowane w Ośrodku Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Northwestern. Wszystkie zwierzęta są wykorzystywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee i są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach neurologicznych.

1. Fotokoagulacja laserowa

Procedura fotokoagulacji laserowej jest zmodyfikowana w stosunku do wcześniej opublikowanych protokołów 5-7.

  1. Znieczulenie 40-60-dniowej myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg / kg, Butler Schein Animal Health, OH) i ksylazyny (10 mg / kg, Lloyd Inc. z Iowa, Shenandoah, IA).
  2. Rozszerz źrenicę prawego oka zwierzęcia doświadczalnego poprzez miejscowe leczenie jedną lub dwiema kroplami 1% roztworu siarczanu atropiny (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
  3. Po rozszerzeniu źrenic spłaszcz przednią komorę, aby zwiększyć indukcję lasera 6. Włóż szklaną mikropipetę z ostrą końcówką (World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) do przedniej przestrzeni pod lampą szczelinową (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ), aby spuścić płyn z przedniej komory.
  4. Utrzymaj mysz w plastikowym uchwycie na stożek (Braintree Sci Inc., MA) i przywiąż do domowej roboty platformy (patrz rysunek 1A). Trzymaj mysz z ogranicznikiem i wystawia prawe oko myszy na źródło światła za lampą szczelinową. Ustaw prawe oko znieczulonej myszy pod lampą szczelinową.
  5. Trzymając obiema rękami ogranicznik myszy, nałóż oświetlenie laserowe na rąbek rogówki za pomocą lasera argonowego (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Dostarczyć około 80-100 plamek laserowych (514 nm, 100 mW, impuls 50 ms i plamka 200 μm) prostopadle do obwodu siatki beleczkowej. Myszy C57BL/6 mają pigmentowaną tęczówkę, która służy jako bariera dla potencjalnej zabłąkanej energii 7.
  6. Wkraplanie miejscowe 0,5% moksyfloksacyny (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) na powierzchnię oka w celu dezynfekcji obszaru poddanego zabiegowi laserowemu oraz 0,5% proparakainy (Bausch & Lomb, Rochester, NY) w celu złagodzenia bólu.
  7. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) w celu regeneracji przez około godzinę, aż w pełni się obudzi.
  8. Lewe oko nie jest traktowane jako kontrola.

2. Pomiary IOP

  1. Umieść obudzoną mysz w tubie, aby załadować ją do plastikowego uchwytu stożka, a następnie przymocuj ją do platformy (patrz Rysunek 2A).
  2. Odczekaj od pięciu do dziesięciu minut, aby mysz przystosowała się do pozycji uchwytu. Zbliż tonometr odbicia (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) do oka myszy, aż końcówka sondy znajdzie się w odległości 2-3 mm od powierzchni rogówki 14.
  3. Naciśnij przycisk pomiaru, aby końcówka sondy delikatnie uderzyła w środkową powierzchnię rogówki. Trzy kolejne zestawy sześciu pomiarów ciśnienia wewnątrzgałkowego tego samego oka są uzyskiwane i uśredniane jako ciśnienie wewnątrzgałkowe oka. Nieleczone oko kontrolne jest zawsze mierzone jako pierwsze, aby uzyskać odczyt wyjściowy dla oka leczonego laserowo, które jest mierzone jako następne.

3. Test optomotoryczny

Ostrość wzroku i wrażliwość na kontrast są testowane 14,15 . Dwoje oczu poszczególnych myszy jest badanych oddzielnie poprzez odwrócenie kierunku dryfującej siatki; tj. krata dryfująca zgodnie z ruchem wskazówek zegara służy do identyfikacji funkcji wzrokowej lewego oka, a krata dryfująca w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara dla prawego oka 16. Każdy test trwa około 15 minut i jest powtarzany przez dwóch obserwatorów niezależnie.

  1. Umieść mysz i pozwól jej swobodnie poruszać się po podwyższonej platformie otoczonej czterema monitorami komputerowymi (Rysunek 3A-B).
  2. Ustaw monitory tak, aby wyświetlały poziomo dryfujące siatki sinusoidalne jako bodźce wizualne o średniej luminancji 39 cd/m2. Kierunek ruchu kraty powinien zmieniać się kolejno zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
  3. Analizuj ruchy zwierzęcia. Ruchy zwierzęcia w zgodzie z dryfującymi kratami są uważane za "pozytywne" w ciągu 15 sekund po włączeniu bodźca wzrokowego, a następnie stopniowo zwiększane. Najwyższy bodziec wzrokowy wywołujący reakcję definiuje się jako ostrość wzroku zwierzęcia 17.
  4. Zbadaj czułość kontrastu przy trzech wstępnie wybranych częstotliwościach przestrzennych: 0,075, 0,16 i 0,3 cykli na stopień (cpd). Próg kontrastu dla każdego oka jest definiowany jako najniższy kontrast, który wywołuje reakcje wzrokowe przy wcześniej ustalonej częstotliwości. Czułość kontrastu jest odwrotnością progu 17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z opisem w procedurach, iluminacja laserowa jest skierowana na siateczkę pręgowatą w obszarze limbalnym w celu fotokoagulacji odpływu cieczy wodnistej, co indukuje zamknięcie kąta oka (Rysunek 1). W większości oczu poddanych laseroterapii nie stwierdzono istotnych uszkodzeń fizycznych, odwarstwienia pigmentu ani infekcji, co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami 6. W przypadku niewielkiej grupy myszy (mniej niż 5% wszystkich zwierząt poddanych laseroterapii), u których wystąpiły fiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Poinformowaliśmy powyżej, że utrzymujące się nadciśnienie oczne może być wywołane przez oświetlenie laserowe w oczach myszy. W porównaniu z modelem wstrzykiwania soli fizjologicznej 18 i kauteryzacją żył model 11 , które wymagają rozległych umiejętności mikrochirurgicznych, oświetlenie laserowe jest stosunkowo proste i łatwe do wykonania. Zazwyczaj możemy wykonać oświetlenie laserowe dla 4-6 myszy w ciągu 2-3 godzin. Krytycznymi krokami do osiągnięcia trwałego podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Autorzy są pełnoetatowymi pracownikami Northwestern University.

Autorzy NIE otrzymali ŻADNEGO dofinansowania, które zostało udzielone przez firmy produkujące odczynniki i przyrządy użyte w tym artykule.

Podziękowania

Praca zawarta w tym artykule została wsparta przez Dr. Douglas H. Johnson Award for Glaucoma Research od American Health Assistance Foundation (XL), William & Mary Greve Special Scholar Award od Research to Prevent Blindness (XL), Illinois Society for the Prevention of Blindness (HC) oraz grant NIH R01EY019034 (XL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik
moksyfloksacynaAlcon Labs, Inc.NDC 0065-4013-030,5 %, tylko Rx
Chlorowodorek proparakainyBausch LombNDC 24208-730-060,5 %, tylko Rx
Roztwór okulistyczny USPBausch LombNDC 24208-730-06,5
Rx ketaminaButler Schein Animal HealthNDC 11695-0550-1100 mg / kg
ksylazynaLLOYD Inc. z IowaNADA 139-23610 mg / kg
roztwór siarczanu atropinyAlcon Labs, Inc.NDC 61314-303-021 %, tylko
Equipment
Slit Lamp, TOPCON Visual Systems IncSL-3Epowered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtualCerebralMechanics Inc.
opto-kinetyczny system testowaniaCerebralMechanics Inc.
Tonometr, TonoLab, dla myszyColonial Medical Supply
Poduszka grzewczaSunbeam Products Inc722-810
Laser argonowy Coherent IncUltima 2000SE
DECAPICONE Plastikowy uchwyt stożka Braintree Sci Inc.MDC-200do myszy
%, tylko Rx

Bibliografia

  1. Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
  2. Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
  3. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
  4. Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
  5. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
  6. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
  7. Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
  8. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
  9. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
  10. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
  11. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
  12. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549(2007).
  13. Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
  14. Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
  15. Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
  16. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
  17. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
  18. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
  19. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
  20. Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
  21. Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
  22. Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
  23. Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fotokoagulacja laserowaci nienie wewn trzga kowetonometr odbiciowytest optokinetycznysiateczka beleczkowaostro wzrokuczu o kontrastowabadania nad jaskr
Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.