Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50444

⸱

31 lipca 2013

 ,  ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Engineering and Industrial Science, Swinburne University of Technology, 2Department of Otolaryngology, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Stymulacja nerwów w podczerwieni została zaproponowana jako alternatywa dla stymulacji elektrycznej w wielu typach nerwów, w tym związanych z układem słuchowym. Protokół ten opisuje metodę patch clamp do badania mechanizmu stymulacji nerwów w podczerwieni w kulturze pierwotnych neuronów słuchowych.

Streszczenie

W ostatnich latach wykazano, że pulsacyjne, podczerwone światło laserowe może być używane do wywoływania reakcji elektrycznych w tkance nerwowej, niezależnie od jakiejkolwiek dalszej modyfikacji tkanki docelowej. Stymulacja neuronalna w podczerwieni została opisana w różnych obwodowych i czuciowych tkankach nerwowych in vivo, ze szczególnym zainteresowaniem wykazano stymulację neuronów w nerwie słuchowym. Jednakże, chociaż wykazano, że INS działa w tych warunkach, mechanizm (lub mechanizmy), za pomocą których światło podczerwone powoduje pobudzenie neuronalne, nie jest obecnie dobrze poznany. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę zaciskania całej komórki, zaprojektowaną w celu ułatwienia badania stymulacji neuronalnej w podczerwieni w hodowanych pierwotnych neuronach słuchowych. Dzięki dokładnemu scharakteryzowaniu reakcji tych komórek na oświetlenie laserowe w podczerwieni in vitro w kontrolowanych warunkach, możliwe będzie lepsze zrozumienie podstawowych procesów fizycznych i biochemicznych leżących u podstaw stymulacji neuronalnej w podczerwieni.

Wprowadzenie

Dziedziny neurofizjologii i bioniki medycznej polegają głównie na technikach, które pozwalają na kontrolowaną stymulację reakcji elektrycznych w tkance nerwowej. Chociaż stymulacja elektryczna pozostaje złotym standardem w pobudzeniu neuronalnym, cierpi na szereg wad, takich jak obecność artefaktów stymulacji podczas rejestrowania odpowiedzi neuronalnych oraz brak specyficzności stymulacji spowodowany rozprzestrzenianiem się prądu do otaczającej tkanki 1.

W ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił rozwój technik stymulacji za pośrednictwem optycznie 2. Niektóre z tych technik wymagają modyfikacji tkanki docelowej, albo poprzez dodanie określonej cząsteczki (np. cząsteczek w klatce)" 3 lub jakąś formę manipulacji genetycznej (np. optogenetykę) 4 , z których żadna nie jest łatwa do zastosowania poza środowiskiem badawczym. Szczególnie interesująca jest zatem stymulacja neuronalna w podczerwieni (INS), w której tkanka nerwowa jest pobudzana przez pulsacyjne światło lasera w podczerwieni. INS ma potencjał, aby przezwyciężyć wiele wad stymulacji elektrycznej, umożliwiając wysoce specyficzną, bezkontaktową stymulację tkanki nerwowej 2. Jednakże, chociaż INS został z powodzeniem zademonstrowany w różnych warunkach in vivo, dokładny mechanizm wzbudzenia pozostaje niepewny.

Niektóre ostatnie publikacje wykazały postęp w odkrywaniu mechanizmu stojącego za INS 5-7. Szybkie nagrzewanie spowodowane absorpcją światła laserowego przez wodę wydaje się odgrywać kluczową rolę. Jednak poza tym konsensus nie został jeszcze osiągnięty. Shapiro i wsp. 7 proponują bardzo ogólny mechanizm, w którym szybkie nagrzewanie powoduje zaburzenia w rozmieszczeniu naładowanych cząstek przylegających do błony komórkowej, co prowadzi do zmiany pojemności błony komórkowej i późniejszej depolaryzacji. Ponadto Albert i wsp. 5 Twierdzą, że ogrzewanie indukowane laserem aktywuje określoną klasę kanałów jonowych wrażliwych na temperaturę (kanały waniloidowe o potencjale przejściowym receptora), umożliwiając jonom przejście przez błonę komórkową. Na tym etapie nie jest jasne, w jaki sposób te mechanizmy się łączą, ani czy istnieją jeszcze inne czynniki, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane.

Chociaż niewielka liczba publikacji (odnośniki 5,7-9) badała INS in vitro, zdecydowana większość prac opublikowanych w tej dziedzinie została przeprowadzona in vivo (np. referencje 1,6,10-18). Stymulacja neuronów słuchowych w podczerwieni jest obszarem szczególnego zainteresowania ze względu na potencjalne zastosowania w implantach ślimakowych 10,14-18. Podczas gdy eksperymenty in vivo są ważne dla zweryfikowania skuteczności tej techniki w różnych warunkach, oczekuje się, że zwiększony poziom kontroli zapewniony przez badania in vitro doprowadzi do bardziej szczegółowego zrozumienia mechanizmu odpowiedzialnego za INS. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie hodowanych neuronów spiralnych zwojów do badań nad klamrami łatkowymi, ponieważ można je wykorzystać do badania podstawowych mechanizmów, a jednocześnie połączyć się z dużą ilością istniejących danych z układu słuchowego.

Technika zacisku krosowego jest doskonałym narzędziem do badania zjawisk elektrofizjologicznych, dostarczając środków do rejestrowania aktywności elektrycznej w pojedynczych komórkach i badania wkładu poszczególnych prądów bazowych19. Kiedy technika ta jest stosowana do stabilnego przygotowania in vitro pierwotnych neuronów, takich jak hodowane spiralne neurony zwojowe, daje możliwość dogłębnego zbadania mechanizmów, za pomocą których aktywność neuronalna jest kontrolowana i manipulowana.

Protokoły określone w tej pracy opisują metody badania wpływu stymulacji laserowej na właściwości elektryczne neuronów spiralnych zwojów poprzez zapisy patch clamp. Podejście to opiera się na laserze sprzężonym ze światłowodem, a nie na laserze w wolnej przestrzeni, co pozwala na bezpieczniejszą pracę, a także łatwiejsze i bardziej powtarzalne wyrównanie bez konieczności modyfikowania standardowej konfiguracji mikroskopu. Na podstawie tych protokołów powinno być możliwe przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów w celu dokładniejszego określenia mechanizmu lub mechanizmów stojących za INS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kultura neuronów spiralnych zwojów

  1. Sterylizuj małe okrągłe (np. o średnicy 10 mm) szklane szkiełka nakrywkowe i zakrzywione kleszcze w autoklawie. Przenieść wysterylizowane szkiełka nakrywkowe do pojedynczych dołków sterylnej 4-pierścieniowej płytki Petriego 35 mm lub 4-dołkowej płytki, używając wysterylizowanych kleszczy. Nanieść 150 μl poli-L-ornityny (500 μg/ml) i mysiej lamininy (0,01 mg/ml) na wierzchnią powierzchnię szkiełka nakrywkowego i umieścić w inkubatorze (37 °C) na maksymalnie 48 godzin. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe nie odpływają od dna studni.
  2. Przygotuj 50 ml sterylnych pożywek neuropodstawowych (NBM) dla każdej hodowli nerwowej: 47,5 ml neurobazalu A, 0,5 ml suplementuN2, 1 ml suplementu B27, 0,5 ml L-glutaminy i 0,5 ml penicyliny-streptomycyny. Uwaga: Suplementy można zamrażać, przechowywać w temperaturze -20 °C i dodawać do podłoża w wymaganym dniu.
  3. Dysocjacja neuronów spiralnych od 4-7 dni po urodzeniu szczeniąt szczurów, jak opisano wcześniej 20,21, przy użyciu zarówno technik enzymatycznych (0,025% trypsyny i 0,001% DNazy I), jak i mechanicznych. Patrz Whitlon i wsp. 22 oraz Vieira i wsp. 23 dla szczegółowych procedur hodowli neuronów zwoju spiralnego, lub Parker i wsp. 24 w celu wykazania izolacji modiolus.
  4. Odessać pozostały roztwór poli-L-ornityny/lamininy ze szkiełek nakrywkowych i krótko przemyć NBM.
  5. Dodać 150-200 μl zdysocjowanej zawiesiny neuronów spiralnego zwoju do szkiełek nakrywkowych i umieścić w inkubatorze (37 °C, 10% CO2 ). Uwaga: z przeciętnego miotu 8 szczeniąt szczurów można przygotować do 20 szkiełek nakrywkowych.
  6. Cztery godziny po posianiu neuronów odessać roztwór, aby usunąć resztki komórek i zastąpić 150-200 μl ogrzanego świeżego NBM. Uwaga: podłoże może wymagać codziennego uzupełniania, aby uniknąć odwodnienia.
  7. Szkiełka nakrywkowe należy umieścić z powrotem w inkubatorze do czasu, gdy będą potrzebne do zapisów elektrofizjologicznych. Uwaga: zdysocjowane hodowle neuronów zwojowych spiralnych można wykorzystać do eksperymentów elektrofizjologicznych cztery godziny po dysocjacji i do dwóch dni po niej. Podczas analizy wyników należy wziąć pod uwagę czas spędzony in vitro. Uzupełniaj NBM co 24-48 godzin.

2. Przygotowanie do nagrań z użyciem zacisków krosowych

  1. Przygotowywanie roztworów
    1. Roztwór wewnątrzkomórkowy (mikropipeta): 115 mM K-glukonian, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na2ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2GTP (dostosować do pH 7,3 za pomocą KOH; dostosować do 295 mOsmol/kg z sacharozą). Przepuścić roztwór przez sterylny filtr (0,2 μm) i podzielić na 200 μl porcji, które będą przechowywane w temperaturze -20 °C do dnia rejestracji.
    2. Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpielowy): 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy (dostosować do pH 7,4 za pomocą NaOH; dostosować do 300-310 mOsmol/kg z sacharozą). To rozwiązanie jest wykonywane w dniu nagrania.
  2. Przygotować mikropipety rejestrujące o rezystancji 2-6 MΩ. Używamy ściągacza laserowego CO2 (P-2000; Sutter Instruments) i szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,58 mm; długość 75 mm).
  3. Przygotuj laser. Protokół ten jest przeznaczony do użytku z laserem sprzężonym ze światłowodem, takim jak stymulator nerwów na podczerwień 1,870 nm firmy OptoTech P/L. Światłowód używany do dostarczania światła w naszych eksperymentach to włókno krzemionkowe o średnicy rdzenia/okładziny 200/220 μm o aperturze numerycznej 0,22 i złączach FC-PC na obu końcach (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0,22). krosowe zostały przecięte na pół, aby wytworzyć dwa warkocze światłowodowe (tj. złączone na jednym końcu i rozcięte na drugim). Wpływ średnicy rdzenia światłowodu i apertury numerycznej na zmiany temperatury wywołane laserem został szczegółowo omówiony przez Thompsona i wsp. 25
    1. Rozciąć końcówkę światłowodu doprowadzającego światło przy użyciu standardowych technik i upewnić się, że uzyskana końcówka jest wysokiej jakości poprzez obserwację za pomocą mikroskopu optycznego (tj. końcówka powinna być prostopadła do osi włókna i wydawać się płaska po oględzinach). Podłącz światłowód dostarczający światło do sprzężonego ze światłowodem wyjścia lasera stymacyjnego za pomocą odpowiedniego złącza przelotowego (np. Thorlabs ADAFC2).
    2. Zmierz moc wyjściową lasera z rozszczepionej końcówki światłowodu dostarczającego światło za pomocą odpowiedniego przyrządu (np. Coherent FieldMate z głowicą detektora LM-3). Zaleca się sprawdzanie mocy lasera za każdym razem, gdy włókno doprowadzające światło jest rozszczepiane lub dokonywana jest znacząca regulacja lasera (np. transport z jednego laboratorium do drugiego).
    3. Włóż światłowód doprowadzający światło do uchwytu światłowodowego lub równoważnego urządzenia i przymocuj uchwyt do odpowiedniego mikropozycjonera. Ważne jest, aby móc dokładnie określić kąt θ, jaki światłowód tworzy ze szkiełkiem nakrywkowym. Kąt ten można zmierzyć, wykonując zdjęcie układu doświadczalnego i używając oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. ImageJ) w celu uzyskania kąta. Kąt θ (lub zakres możliwych kątów) jest ograniczony przede wszystkim przez ograniczenia przestrzenne układu doświadczalnego - w szczególności mikroskopu. Typowe wartości θ w naszych eksperymentach (na podstawie mikroskopu pionowego) wynoszą około 36°, jednak optymalny kąt może się znacznie różnić w przypadku alternatywnych ustawień (np. z użyciem mikroskopu odwróconego).
    4. Wykonaj połączenia między laserem a systemem gromadzenia danych z zacisku krosowego (np. Digidata 1440A, Molecular Devices), jak pokazano na rysunku 2. Wyjście cyfrowe z systemu akwizycji danych patch clamp powinno być podłączone do lasera za pomocą zewnętrznego generatora funkcyjnego, co umożliwia określenie parametrów impulsu laserowego niezależnie od systemu akwizycji danych. Alternatywnie wyjście to można podłączyć bezpośrednio do sterownika laserowego (co wymaga ustawienia długości impulsu i częstotliwości powtarzania przez oprogramowanie do akwizycji danych). W obu przypadkach sygnał używany do wyzwolenia lasera powinien być podłączony z powrotem do wejścia systemu akwizycji danych, aby zapewnić, że czas i długość impulsów laserowych mogą być rejestrowane jednocześnie z sygnałem elektrofizjologicznym.

3. Nagrania z zaciskiem krosowym do badania INS

  1. Napełnij odpowiedni pojemnik systemu perfuzyjnego roztworem zewnątrzkomórkowym i dostosuj szybkość przepływu, aby zapewnić perfuzję kąpieli z szybkością 1-2 ml/min. Używamy systemu zasilanego grawitacyjnie (butelka aspiratora, zawór zaciskowy i rurka PE) z wbudowaną grzałką umożliwiającą szybkie podgrzanie roztworu oraz pompą perystaltyczną do usuwania zużytego roztworu przez odsysanie.
  2. Umieścić szkiełko nakrywkowe z hodowanymi komórkami w komorze rejestracyjnej (kąpieli) mikroskopu pionowego. Korzystając z obiektywu zanurzonego w wodzie o dużym powiększeniu (np. 40X) i kontrastu fazowego (np. kontrast interferencyjny różnicowy lub kontrast gradientu Dott), wizualnie zlokalizuj neurony zwoju spiralnego w hodowli. Typowy neuron zwojowy spiralny jest jasny fazowo, okrągły i ma średnicę około 15 μm z wyraźnym jądrem, jak pokazano na rysunku 1a.
  3. Po zlokalizowaniu neuronu przełącz się na obiektyw o mniejszym powiększeniu (np. 10X) i zlokalizuj docelowy neuron w polu widzenia.
  4. Przesuń światłowód doprowadzający światło na miejsce, wykonując następującą procedurę (lub równoważną):
    1. Użyj mikropozycjonera, aby przesunąć światłowód wyjściowy, aż końcówka znajdzie się blisko docelowego neuronu zarówno w płaszczyźnie poziomej, jak i pionowej. Pionowe położenie końcówki światłowodu można zweryfikować, przesuwając obiektyw w górę i w dół (skanowanie ostrości).
    2. Przełącz się z powrotem na obiektyw o dużym powiększeniu i umieść końcówkę światłowodu w przeznaczonej pozycji obok neuronu (patrz wstawka na rysunku 2). Podczas regulacji pionowego położenia włókna ważne jest, aby dolna krawędź włókna spoczywała na (tj. tylko dotykała) szkiełka nakrywkowego, aby zminimalizować niepewność co do położenia włókna. Optymalne wyrównanie w płaszczyźnie poziomej będzie zależało od kąta θ, jaki włókno tworzy ze szkiełkiem nakrywkowym i promienia włókna r. Aby ustawić włókno tak, aby środek neuronu docelowego leżał wzdłuż osi włókna, odległość pozioma między górną krawędzią włókna a komórką docelową powinna wynosić
      Δcel = r (cosec θ - 2 sin θ),
      gdzie wartości ujemne wskazywałyby, że światłowód wystaje poza ogniwo. Podczas wyrównywania włókna, odległośćcelu Δ między górną krawędzią włókna a środkiem neuronu można w przybliżeniu osiągnąć przez oględziny. Jednakże cel Δ został zaprojektowany jako jedynie przybliżona wytyczna. Ustawienie włókna w taki sposób, aby rzeczywista odległość Δ między górną krawędzią włókna a środkiem neuronu różniła się mierzalnie odcelu Δ (jak na rysunku 1) może zapewnić wgląd w efekt zarówno przemieszczenia promieniowego (tj. od środka wiązki), jak i przemieszczenia osiowego (tj. wzdłuż osi włókna) wiązki względem docelowego neuronu. Na przykład ustawienie Δ ≈ 0 powinno spowodować wzrost lokalnej temperatury w pobliżu ogniwa - tj. ponieważ profil wiązki dla typowych światłowodów wielomodowych jest dobrze przybliżony przez rozkład cylindra 26, spadek lokalnie pochłanianej energii (temperatury) spowodowany przemieszczeniem od środka wiązki jest minimalny w porównaniu ze wzrostem pochłoniętej energii wynikającej z przesunięcia czoła światłowodu bliżej ogniwa.
      Chociaż należy zachować ostrożność, aby ustawić włókno tak dokładnie i powtarzalnie, jak to możliwe za pomocą wskazówek wizualnych, precyzyjny pomiar położenia włókna względem docelowego neuronu (np. Δ) ma większe znaczenie niż ustawienie go w określonej odległości. Δ można wyznaczyć (z szacowaną maksymalną niepewnością wynoszącą ±3 μm) za pomocą analizy obrazu, jak opisano w kroku 3.8.2 protokołu. W niektórych eksperymentach 5,8 źródła białego światła zostały sprzężone przez światłowód w celu skierowania na pożądaną komórkę. Podejście to okazało się nieskuteczne w ustawieniu mikroskopu pionowego, ponieważ intensywność światła rozproszonego z obszaru docelowego była stosunkowo niska w tych płytkich kątach (θ).
    3. Gdy włókno znajdzie się na swoim miejscu, odsuń je o znaną ilość, aby umożliwić proste ustawienie mikropipety. Włókno można następnie przywrócić do pierwotnej pozycji, gdy zostanie osiągnięty zapis neuronowy.
  5. Napełnij mikropipetę roztworem wewnątrzkomórkowym i bezpiecznie zamontuj na miejscu na płycie głównej wzmacniacza (np. Multiclamp 700B, Molecular Devices). Używając rurki przymocowanej z boku uchwytu mikroelektrody, zastosuj niewielką ilość nadciśnienia, aby zapobiec zatkaniu mikropipety.
  6. Za pomocą mikromanipulatora przesuń mikropipetę na pozycję tuż nad docelowym neuronem.
  7. Protokół dla zapisów całej komórki:
    1. Zastosować impuls prostokątny o długości 10 ms, +10 mV (np. test uszczelnienia) w trybie cęgowym wzmacniacza i wyregulować potencjał mikropipet (przesunięcie pipety) sygnału linii podstawowej na 0 nA. Test szczelności powinien być również stosowany w celu określenia, czy rezystancja mikroelektrody mieści się w pożądanym zakresie (np. 2 - 6 MΩ).
    2. Monitorując rezystancję, użyj precyzyjnych regulacji mikromanipulatora, aby delikatnie ustawić mikropipetę na powierzchni docelowego neuronu. Gdy mikropipeta styka się z neuronem, rezystancja wzrośnie (o ~ 0,5 do 1 MΩ). Natychmiast po wzroście oporu usuń dodatnie ciśnienie płynu i zastosuj niewielkie podciśnienie. Gdy rezystancja przekroczy 10 - 20 MΩ, ustal potencjał membrany na poziomie zatrzymania (np. około -60 mV).
    3. Rezystancja elektrody powinna nadal rosnąć, aż przekroczy 1 GΩ, co oznacza, że między błoną komórkową a mikropipetą powstało skuteczne uszczelnienie (określane jako "gigaseal"). W tym momencie usuń całe ciśnienie płynu z mikropipety.
    4. Po uformowaniu gigaseal użyj krótkich impulsów prądowych (od 25 do 100 μs; +1 V) lub krótkich impulsów ujemnego ciśnienia płynu, aby rozerwać błonę komórkową i uzyskać konfigurację całej komórki.
    5. Zapisać pojemność membrany, rezystancję szeregową i rezystancję wejściową wyznaczoną na podstawie krzywej wykładniczej dopasowanej do prądu podczas impulsu testowego uszczelnienia. Zminimalizuj stany przejściowe pojemności, regulując elementy sterujące CpFast i CpSlow na wzmacniaczu, a następnie przełącz wzmacniacz w tryb całego ogniwa i skompensuj pojemność i rezystancję, aż podczas testu uszczelnienia zostanie zaobserwowany płaski prąd. Zastosuj kompensację rezystancji szeregowej (~70% korekty; 70% predykcji), dostosowując kontrolę pojemności i rezystancji, aby utrzymać płaską reakcję uszczelnienia testowego.
    6. Przełącz na tryb cęgów prądowych we wzmacniaczu. Zwróć uwagę na spoczynkowy potencjał błony (przy braku wtrysku prądu). Ustaw prąd podtrzymania, aby ustabilizować potencjał membrany na żądanym poziomie (np. -60 mV). Zneutralizuj pojemność pipety i wyreguluj balans mostka, aby zrównoważyć spadek napięcia.
    7. Sprawdź właściwości wypalania neuronu, stymulując go prądem depolaryzującym (+10 do +200 pA w krokach co +10 pA; czas trwania 300 ms).
    1. Przesuń światłowód z powrotem na miejsce obok neuronu. Korzystając z oprogramowania do obrazowania sprzężonego z kamerą CCD, uchwyć obrazy położenia światłowodu w stosunku do docelowego neuronu, skupiając się najpierw na płaszczyźnie neuronu, a następnie na górnej krawędzi światłowodu (patrz rysunek 1).
    2. Poprzez późniejszą analizę uzyskanych obrazów (np. rys. 1b i 1c) możliwe jest precyzyjne określenie Δ (położenie górnej krawędzi światłowodu względem środka docelowego neuronu). Gdy Δ jest znane, parametry, takie jak odległość od czoła końca włókna do docelowego neuronu (wzdłuż osi włókna) z oraz promieniowe przemieszczenie neuronu od środka wiązki δr można obliczyć za pomocą prostych zależności trygonometrycznych:
      z = r sin 2θ + Δ cos θ
      δr = ((r cos 2θ - Δ sin θ)2 + δy2)1/2,
      gdzie δy jest odległością między osią włókna a środkiem neuronu widzianym z góry (np. patrz rysunek 1).
      Analiza powinna uwzględniać różnice w położeniu między komórkami, ponieważ dokładna wiedza na temat tych parametrów lokalizacji może być wymagana do rozwiązania ewentualnych różnic między procesami stymulacji 25.

4. Eksperymenty INS

  1. Podczas rejestrowania danych elektrofizjologicznych w konfiguracji cęgów prądowych lub napięciowych, należy uruchomić laser stymulacyjny z żądanymi parametrami (np. mocą, długością impulsu, częstotliwością powtarzania itp.). W przypadku naszego lasera moc optyczna jest kontrolowana za pomocą bezpośredniego sygnału wejściowego do sterownika lasera i jest określana ręcznie przed każdym nagraniem. Długość impulsu i częstotliwość powtarzania mogą być kontrolowane przez zewnętrzny generator sygnału lub oprogramowanie do akwizycji danych (zgodnie z opisem w kroku 2.3.4). Upewnij się, że dane są rejestrowane zarówno z kanału zacisku krosowego, jak i kanału wyzwalacza laserowego.

Impulsy laserowe o długości od około 500 μsec do 15 ms i energiach ~0,25-5 mJ na impuls zazwyczaj dają mierzalne odpowiedzi elektryczne. Ustawienie częstotliwości powtarzania impulsów laserowych na 1 Hz lub mniej może być przydatne w początkowych eksperymentach, ponieważ zminimalizuje wpływ tego parametru. Typowe wyniki obrazujące zmianę rejestrowanego sygnału przedstawiono w poniższym rozdziale.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Neurony zwoju spiralnego reagują na naświetlanie laserowe powtarzalnymi przebiegami falowymi zarówno w konfiguracji pomiarowej voltage-clamp, jak i current-clamp. Rysunek 3a przedstawia typowe zmiany przepływu prądu przez błonę komórkową w odpowiedzi na impuls laserowy o czasie trwania 2,5 msec i energii 0,8 mJ (średnia odpowiedź z 6 impulsów laserowych, powtarzanych w odstępach 1 sec), przy potencjale błony utrzymanym na poziomie -70 mV, -60 mV i -50 mV. W odpowiedzi na impulsy laserowe konsekwentnie wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Korzystając z protokołów opisanych w tym artykule, możliwe jest wyodrębnienie i hodowla neuronów zwojowych spirali oraz zbadanie aktywności elektrycznej wywołanej laserem poprzez przeprowadzanie eksperymentów z klamrą całej komórki. W przypadku stosowania in vitro, technika patch clamp zapewnia poziom kontroli nad parametrami eksperymentalnymi, który nie jest osiągalny in vivo. Parametry stymulacji laserowej, takie jak długość fali, energia impulsu, długość impulsu, kształt impulsu i sekwencje powtarzan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu Linkage Project LP120100264.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały i sprzęt do hodowli komórkowych
Szkiełka nakrywkoweLomb ScientificCSC 10 1 GP
4-pierścieniowe naczynie do hodowli komórkowych VWR International82050-542
Roztwór poli-L-ornitynySigma-AldrichP4957
LamininInvitrogen23017-015
Zakrzywiony kleszczeWPI14101Pęseta Dumont #5 (końcówka kątowa 45°)
CO2 InkubatorThermoScientificHeracell 150i
Tabela 1. Materiały i sprzęt do hodowli komórkowych.
Neurobasemedia
Neurobasal AGibco10888-022
Suplement N-2Invitrogen17502-048
B27 suplement bez surowicyInvitrogen17504-044
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140-148
L-GlutaminaInvitrogen25030-149
Roztwór wewnątrzkomórkowy
Chlorek potasuSigma-AldrichP4504
HEPESSigma-AldrichH4034
D-glukonian potasuSigma-AldrichG4500
EGTASigma-AldrichE3889
Na2ATPSigma-AldrichA2383
MgATPSigma-AldrichA9187
NaGTPSigma-AldrichG8877
Wodorotlenek potasuLabServBSPPL738.500
SacharozaSigma-AldrichS8501
Roztwór zewnątrzkomórkowy
Chlorek soduSigma-Aldrich310166
Chlorek potasuSigma-AldrichP4504
HEPESSigma-AldrichH4034
Chlorek wapniaSigma-Aldrich383147
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
D-GlukozaSigma-AldrichG8270
Wodorotlenek soduLabServBSPSL740.500
SacharozaSigma-AldrichS8501
Tabela 2. Roztwory do hodowli komórkowych i patch clamp. a) Pożywki neuropodstawne. b) Roztwór wewnątrzkomórkowy. c) Roztwór zewnątrzkomórkowy.
Mikroskop pionowyZeissAxioExaminerD1Wyposażony w kontrastowy obiektyw Dodt
Zanurzenie w wodziePlatforma ZeissW Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
i stolik X-Y ThorLabsBurleigh Gibraltar
Komora nagraniowaWarner InstrumentsRC-26G
Stół do tłumienia drgańTMCMicro-g 63-532
Przyrządy diagnostycznedo kamer CCDOprogramowanie kamery RT1200
Przyrządy diagnostyczneSPOT Basic
Grzejnik liniowyWarnerSH-27B
Regulator temperaturyWarnerTC-324B
Wzmacniacz zacisków krosowychUrządzenia molekularneMulticlamp 700B
Zacisk krosowy system akwizycji danychUrządzenia molekularneDigidata 1440A
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
Szkło do mikropipetSutter InstrumentsGBF100-58-15Szkło borokrzemianowe z żarnikiem
Ściągacz do mikropipetOprogramowanie do nagrywania Sutter InstrumentsP2000
Pakiet AxoGraphLab i Narzędzia do elektrofizjologii
Butelka z aspiratoremSigma-AldrichCLS12201L1 L Butelka aspiratora Pyrex, z wylotem na rurkę
Rurka PEHarvardPolyE #340
Pompa perystaltyczna MasterflexCole-ParmerHV-07554-85
Tabela 3.Sprzęt do zacisków krosowych.
1,870 nm dioda laserowaOptotech
200/220 μ Wielomodowy światłowodowy o średnicy m (FC/PC)AFW TechnologiesMM1-FC2-200/220-5-C-0.22Światłowód dostarczający światło, rdzeń krzemionkowy i okładzina, 0,22 NA
Światłowód przez złącze (FC/PC)ThorlabsADAFC2
Obcinak do światłowodówEREMFO1
Narzędzie do zdejmowania izolacji z włókien (0,25 - 0,6 mm) Siemensświatłowodu
Narzędzie do zdejmowania izolacji ze światłowodów (0,6 - 1,0 mm)SiemensDo usuwania zewnętrznej powłoki krosowego
GeneratorKażdy generator sygnału, który może wyprowadzać niezbędne kształty impulsów i może być wyzwalany zewnętrznie
PozycjonerNiestandardowy pozycjoner. Może zastąpić standardowym mikropozycjonerem używanym do eksperymentów z zaciskami krosowymi
Uchwyt światłowodowyNewportFPH-DJ
Miernik mocy lasera i głowica detektoraCoherentFieldMate (miernik mocy) z LM-3 (głowica detektora)
Tabela 4. Sprzęt laserowy.
Do zdejmowania osłony sygnału światłowodowy

Bibliografia

  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
  3. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
  4. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  5. Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  6. Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
  7. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736(2012).
  8. Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
  9. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
  10. Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
  11. Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
  12. Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
  13. Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
  14. Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
  15. Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).
  16. Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
  17. Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
  18. Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  20. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
  21. Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
  22. Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
  23. Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
  24. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).
  25. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).
  26. Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
  27. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
  28. Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony słuchoweneurony zwoju spiralnegonapromieniowanie laseroweukład patch-clamppozycjonowanie światłowodupojemność błonykompensacja rezystancji szeregowejtryb clamp prądowy
Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.