Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans

21.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50447

⸱

25 czerwca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Cell, Developmental, and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów z C. elegans za pomocą LC-MS/MS.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans wyłania się jako potężny model zwierzęcy do badania biologii lipidów1-9. Prostaglandyny są ważną klasą eikozanoidów, które są sygnałami lipidowymi pochodzącymi z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA)10-14. Te cząsteczki sygnałowe są trudne do zbadania ze względu na ich niską liczebność i reaktywny charakter. Cechą charakterystyczną prostaglandyn jest struktura pierścienia cyklopentanowego zlokalizowana w obrębie szkieletu kwasów tłuszczowych. U ssaków prostaglandyny mogą być tworzone przez szlaki zależne od enzymów i niezależne od cyklooksygenazy10,15. C. elegans syntetyzuje szeroki wachlarz prostaglandyn niezależnie od cyklooksygenaz6,16,17. Zidentyfikowano dużą klasę prostaglandyn serii F, ale badania nad eikozanoidami są na wczesnym etapie i jest dużo miejsca na nowe odkrycia. Tutaj opisujemy procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów. Naładowane lipidy są ekstrahowane z masowych kultur robaków przy użyciu techniki ekstrakcji ciecz-ciecz i analizowane za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją elektronrozpylania (LC-ESI-MS/MS). Do analizy ilościowej zaleca się włączenie deuterowanych analogów prostaglandyn, takich jak PGF2 α-d 4 jako wzorzec wewnętrzny. Monitorowanie wielu reakcji lub MRM może być stosowane do ilościowego określania i porównywania określonych typów prostaglandyn między zwierzętami dzikimi i zmutowanymi. Dekompozycja wywołana zderzeniem lub MS/MS może być wykorzystana do uzyskania informacji o ważnych cechach strukturalnych. Skany badawcze spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej (LC-MS) wybranego zakresu mas, takiego jak m/z 315-360, mogą być wykorzystane do oceny globalnych zmian poziomów prostaglandyn. Podajemy przykłady wszystkich trzech analiz. Metody te dostarczą naukowcom zestawu narzędzi do odkrywania nowych eikozanoidów i wyznaczania ich szlaków metabolicznych.

Wprowadzenie

Prostaglandyny (PGs) to ważna klasa hormonów lipidowych, które zostały dokładnie zbadane i zaangażowane w regulację reprodukcji, odporności i rozwoju w szerokim wachlarzu organizmów12-14. PG idealnie nadają się do kompleksowych analiz biologii systemowej, ponieważ zawierają szereg lipidów pochodzących ze wspólnego prekursora (prekursorów). Nicień C. elegans jest jednym z najczęściej używanych organizmów modelowych do rozwiązywania podstawowych pytań w genetyce i biologii systemowej.

Wykazaliśmy, że C. elegans syntetyzuje PG serii F, które kierują ruchliwe plemniki do oocytów3,6,16. PG serii F pochodzące z 20-węglowych PUFA z trzema, czterema i pięcioma wiązaniami podwójnymi, obejmującymi odpowiednio klasy F1, F2 i F3, zostały zidentyfikowane3,16. Te PG są syntetyzowane niezależnie od enzymów cyklooksygenazy, ale stereoizomery PGF1α i PGF2α są nadal generowane. Do analiz jakościowych i ilościowych PG C. ELEGANS LC-MS/MS jest potężną i czułą techniką analityczną. Przed wykonaniem tej analizy ważne jest opracowanie zoptymalizowanej metody ekstrakcji, ponieważ wydajność procesu analitycznego w dużym stopniu zależy od jakości ekstraktu. Chromatografia cieczowa i spektrometria mas mogą zapewnić jedynie przewidywany stosunek masy do ładunku (m/z), a także pożądany kształt piku i czas retencji jonu macierzystego PG. Profilowanie metaboliczne PG u C. elegans jest trudnym zadaniem wymagającym różnych strategii nabywania SM.

Pełne skanowanie LC-MS lub skanowanie ankietowe (skanowanie Q1) ma tę zaletę, że zapewnia, że większość jonizowalnych PG wygeneruje odpowiedź spektrometrii mas. Podczas gdy skan ankietowy dostarcza użytecznych informacji na temat całkowitego profilowania PG w odniesieniu do dzikich i zmutowanych C. elegans, wykrywanie mniejszych PG jest utrudnione ze względu na niską czułość. Niemniej jednak, skanowanie ankietowe LC-MS może dać globalny wgląd w PG i jest szczególnie przydatne do analizy mutantów, które według przewidywań wpływają na metabolizm dużej populacji PG.

W identyfikacji metabolitów, najpierw przeprowadza się analizę LC-MS/MS chemicznie syntetyzowanych wzorców PG w celu uzyskania widm jonów produktu jako związków odniesienia. Widma te można porównać z widmem nieznanego metabolitu. Tryb monitorowania wielu reakcji (MRM) jest używany w celu zwiększenia czułości i swoistości. Eksperyment MRM przeprowadza się poprzez określenie przejścia masy jonu macierzystego/jonu produktu w związku. Znając masę i strukturę docelowych analitów, możliwe jest przewidzenie teoretycznych przejść MRM dla wielu nieznanych metabolitów.

Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do profilowania izomerycznych PG u C. elegans nie została zgłoszona. Tutaj opisujemy ekstrakcję i zintegrowane podejście do spektrometrii mas składające się z metod LC-MS i LC-MS/MS do wykrywania, oznaczania ilościowego i badania metabolitów PG C. elegans. Podejście to można zastosować do innych eikozanoidów.

Protokół

Protokół opisany poniżej jest podzielony na trzy sekcje: hodowla robaków, ekstrakcja prostaglandyn i analiza prostaglandyn. Jak już wspomniano, istnieje wiele momentów, w których próbki mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -80 °C lub -20 °C.

1. Kultura robaków

Zalecamy około 6 g robaków w fazie mieszanej dla kompleksowych LC-MS/MS. Powinno to zapewnić wystarczającą ilość materiału do wykrycia co najmniej sześciu oddzielnych wstrzyknięć. Do ilościowego określenia znanych PG za pomocą MRM w jednym lub dwóch wstrzyknięciach wystarczą 1-2 g. Możliwa jest również analiza ekstraktów z kultur zsynchronizowanych składających się z określonego etapu. Jednocześnie można uprawiać do 4 różnych odmian. Na przykład kontrola typu dzikiego i trzy różne zmutowane szczepy.

  1. Przygotuj 65 bardzo dużych (16 cm) płytek NGM i skoncentrowanych bakterii do dodatkowego karmienia. Do wysiewu użyj bakterii NA22. Aby wytworzyć skoncentrowane bakterie do dokarmiania, hoduj co najmniej cztery litry NA22 w podłożu LB przez 16-24 godziny. Odkręcić, usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 100 ml buforu M9. Dla każdego szczepu robaków może być wymagane od 200 do 400 ml tego stężonego roztworu bakteryjnego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozpocznij hodowle robaków na 5 bardzo dużych płytkach. Hoduj robaki przez około 3 do 4 pokoleń, aż talerze będą pełne grawitacyjnych dorosłych. W razie potrzeby skoncentrowane bakterie należy dodać do talerzy, aby zapobiec głodowi (~ 1 ml / talerz i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed założeniem pokrywki).
  3. Zmyj grawitacyjne hermafrodyty z płytek buforem M9 i zbierz robaki do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  4. Pozwól grawitacyjnym hermafrodytom osiąść na dnie (zwykle około 3-5 minut). Usuń supernatant, w tym bakterie, jaja i robaki w stadium larwalnym. Zawiesić w 15 ml buforu M9 i delikatnie wymieszać.
  5. Przenieś 200 μl zawiesiny ślimakowej na każdą z 60 płytek NGM z nasionami. Rozprowadź robaki po płytach. Utrzymuj roztwór robaka dobrze wymieszany, aż wszystkie płytki zostaną wysiane, aby upewnić się, że otrzymają mniej więcej równą liczbę robaków.
  6. W razie potrzeby uzupełnij skoncentrowanymi bakteriami (~1 ml / talerz / okres od 12 do 24 godzin), aby zapobiec głodowi. Pozostaw talerze do wyschnięcia na powietrzu przed założeniem pokrywek. Hoduj robaki przez 2-4 pokolenia, w zależności od pierwotnej liczby wysianych robaków lub do momentu, gdy talerze będą pełne grawitacyjnych dorosłych.
  7. Zbieraj płytki robaków po jednej odmianie na raz. Zmyj robaki z płytek buforem M9 i zbierz w 50 ml probówkach polipropylenowych (np. 6 probówek). Użyj bufora M9, aby umyć płytkę, a następnie przenieś wypełniony robakami bufor na następną płytkę. Po umyciu pewnej liczby płytek (np. 10tysięcy) należy przenieść bufor wypełniony robakami do probówki o pojemności 50 ml. Napełnij rurkę do góry buforem M9. Powtórz pranie dla pozostałych płytek.
  8. Gdy ciężarne dorosłe osobniki osiądą na dnie w ciągu 5-6 minut, usuń supernatant (~ 35 ml) i skonsoliduj w jednej lub dwóch probówkach. Napełnij probówki do 50 ml świeżym buforem M9, odstaw na 3-5 minut i usuń supernatant pozostawiając ciężkie dorosłe osobniki. Powtórzyć 3 razy lub do momentu, gdy supernatant stanie się przezroczysty.
  9. Za pomocą pipety Pasteura o dużym otworze przenieś jak najwięcej robaków do dwóch stożkowych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 1,000 rcf (~3,500 obr./min w CentraSL2) przez 5 minut w wirówce klinicznej. Usunąć supernatant i powtarzać, aż wszystkie robaki zostaną przeniesione i granulowane w tej samej probówce. Usunąć jak najwięcej supernatantu i przechowywać robaki w temperaturze -80 °C. Czynność powtórzyć dla wszystkich szczepów.

2. Ekstrakcja prostaglandyn

Odczynniki potrzebne do ekstrakcji są pokazane poniżej. Metoda jest zmodyfikowana w stosunku do metody Golovko i Murphy'ego17 i obejmuje ekstrakcję acetonem, a następnie oczyszczanie ciecz-ciecz, co zwiększa czułość LC-MS/MS. W procedurze używany jest homogenizator Bullet Blender 5, chociaż podobne wyniki można uzyskać za pomocą homogenizatora Dounce. Butylowany hydroksytoluen (BHT) i odparowanie w gazowym azocie (N2) są stosowane w celu zapobieżenia utlenianiu. Wszystkie naczynia szklane powinny być silikonowane (Sigmacote) w celu zmniejszenia wiązania lipidów. Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi powinna odbywać się w kapturze chemicznym.

  1. Zważyć stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml. Przenieść około 6,0 g zamrożonych robaków z probówki stożkowej o pojemności 15 ml przechowywanej w temperaturze -80 °C, przecinając probówkę gorącą żyletką w pobliżu oznaczenia 6,5 ml. Szpatułka oczyszczona metanolem może być użyta do usunięcia zamrożonego granulatu robaka z dna tuby. Przecinając osad w celu odzyskania dolnej części, pozostawia się mniej gęstych larw robaków i szczątków bakterii z górnej części osadu.
  2. Przenieść zamrożone robaki do wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Jeśli przetwarzanych jest wiele próbek, należy użyć tej samej ilości (6,0 g) tkanki do badań porównawczych. Gdy robaki rozmrażają się w pastę, dodaj lub usuń robaki za pomocą szpatułki, aby uzyskać pożądaną masę. Opcjonalnie: dodać 1,00 ng wzorca PGF2α-d4 jako wewnętrzną kontrolę wydajności ekstrakcji.
  3. Dodać 12 ml lodowatego acetonu/soli fizjologicznej w proporcji 2:1 z 0,005% BHT do zawiesiny ślimakowej i dobrze wymieszać przez wirowanie. Dozuj 1,5 ml gnojowicy robaków do każdej z dwunastu wolnostojących plastikowych probówek o pojemności 5 ml do użytku w Bullet Blenderze.
  4. Dodać 0,7-0,8 ml kulek z tlenku cyrkonu stabilizowanego tlenkiem cyrkonu o średnicy 0,5 mm do każdej probówki o pojemności 5 ml. Zamknij szczelnie nakrętki i załaduj 12 probówek do homogenizatora Bullet Blender 5. Uruchom blender na 3 minuty z prędkością 8-9 i umieść rurki na lodzie. Pamiętaj, aby bardzo szczelnie zamknąć nakrętki, w przeciwnym razie zawartość może się wylać. Sprawdzić 10 μl homogenatu z jednej probówki na szkiełku za pomocą stereoskopu. Powinno pozostać bardzo niewiele nienaruszonych robaków. W razie potrzeby powtarzaj z tą samą prędkością przez kolejną minutę.
  5. Równomiernie przenieść homogenaty do czterech stożkowych szklanych probówek o pojemności 10 ml za pomocą 9-calowej pipety Pasteura. Unikaj przenoszenia koralików. Umyj koraliki z trzech probówek kolejno 1 ml acetonu/soli fizjologicznej w stosunku 1:2 zawierającego BHT. Powtarzaj dla innych tubek, aż wszystkie koraliki zostaną umyte. Przenieś pozostały roztwór (~ 4 ml) do szklanych probówek o pojemności 10 ml i umieść je na lodzie.
  6. Odwirować szklane probówki o pojemności 10 ml w temperaturze 4 °C w wirówce klinicznej przy ~1 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant z każdej probówki do czystej szklanej probówki stożkowej o pojemności 10 ml.
  7. W kapturze chemicznym dodaj równą objętość heksanu do każdej szklanej probówki o pojemności 10 ml. Na przykład dodaj 3,5 ml heksanu do 3,5 ml roztworu acetonu/soli fizjologicznej. Wiruj z maksymalną prędkością przez 30 sekund.
  8. Odwirować szklane probówki o pojemności 10 ml w temperaturze 4 °C w wirówce klinicznej przy ~1 000 x g przez 10 minut. Odrzucić górną fazę zawierającą heksan i obojętnie naładowane lipidy.
  9. Zakwasić dolną fazę do pH 3,5 za pomocą 2 M kwasu mrówkowego (około 100 - 150 μl). Przetestuj pH za pomocą pasków pH.
  10. Dodać równą objętość chloroformu do każdej probówki. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 sekund i odwirowywać probówki w temperaturze 4 °C w wirówce klinicznej przy ~1,000 x g przez 10 minut.
  11. Usuń i wyrzuć górną fazę wodną. Wprowadzić końcówkę pipety przez resztkową interfazę mleczną do dolnej fazy chloroformowej, unikając interfazy. Zebrać dolną fazę z każdej z 4 probówek do czystej stożkowej szklanej probówki o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 24 godziny. W tym momencie ekstrakt można przechowywać w temperaturze -20 °C do dwóch tygodni.
  12. Wyjmij ekstrakt z zamrażarki i wyrzuć pozostałą mleczną wodną warstwę wierzchnią, jeśli jest dostępna. Przenieść fazę chloroformową do znakowanej fiolki ze szkła 1/2-Dram wyłożonej teflonem za pomocą nowej pipety Pasteura. W okapie chemicznym odparować frakcję rozpuszczalną w chloroformie do sucha pod delikatnym przepływem gazuN2. Wysuszony ekstrakt można przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni. Ogólny schemat stosowany do ekstrakcji i analizy PG pokazano na rysunku 1.

3. Analiza prostaglandyn

  1. Przygotować roztwory podstawowe poszczególnych referencyjnych prostaglandyn, takich jak PGF2α lub PGF2 α-d4 (1 μg/ml) w metanolu i rozcieńczyć metanolem: wodą (8:2 v/v) w celu uzyskania roztworu roboczego. Przygotować serię rozcieńczeń (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng/ml) w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.
  2. Dodać 200 μl metanolu:wody (8:2 v/v) do wysuszonego ekstraktu lipidowego C. elegans i dokładnie wymieszać. Jeśli wyekstrahowano mniej niż 6 g tkanki robaka, wysuszony ekstrakt powinien być ponownie zawieszony w mniejszej objętości roztworu metanol:woda.
  3. Przygotować fazę ruchomą składającą się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie [A] i acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego [B].
  4. Ustawić automatyczny podajnik próbek w temperaturze 4 °C i umieścić fiolki z próbkami w stojaku na fiolki o pojemności 1,5 ml z 70 zliczeniami.
  5. Równoważyć kolumnę Synergy hydro RP-C18 z 0,1% kwasem mrówkowym przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min przez około 5 minut.
  6. Wstrzyknąć próbkę (20-50 μl) do kolumny. Wykonuj elucję gradientową zaczynając od 10% B i przechodząc do 80% B od 0-11 min, 80-100% B od 11-14 min i wracając do 10% B po 16 min. Całkowity czas pracy wynosi 20 minut. Czasy przechowywania 13 autentycznych wzorców przedstawiono w tabeli 1 dla odniesienia3.
  7. Wprowadzić ścieki z kolumny do spektrometru mas za pomocą interfejsu ESI działającego w trybie jonów ujemnych. Azot jest stosowany jako nebulizator i gaz kurtynowy (CUR = 10). Gaz zderzeniowy, energia zderzenia i temperatura są ustawione odpowiednio na 10, -35 eV i 600 °C. Potencjał deklastrowania (DP), energia zderzenia (CE) i potencjał wyjścia komórki (CXP) są ustawione odpowiednio na -90, -35 i -10.
  8. W przypadku skanów pomiarowych (skany Q1) należy użyć trybu jonów ujemnych w zakresie mas m/z 315-360 dla większości PG (Rysunek 2). Zakres może być zmieniany w zależności od masy interesującego związku (związków). Ekstrahuj jony z całkowitego prądu jonowego (TIC) chromatogramów jonowych LC-MS i określ, czy wyekstrahowane jony odpowiadają jonom deprotonowanym lub adduktom, czy też jonom fragmentacyjnym
    9. .
  9. W przypadku eksperymentów MRM przejście masy m/z 355/311 służy do wykrywania klasy F1, m/z 353/193 jest używane do klasy F2, a m/z 351/193 lub 351/191 jest używane do klasy F3 (rysunek 3). MRM jest również używany do wykrywania wzorca wewnętrznego (na przykład m/z 357/197 dla PGF2α-d4) i do generowania krzywej wzorcowej. Zobacz Murphy et al., aby uzyskać dodatkowe informacje na temat przejść masy PG18.
  10. W przypadku eksperymentów MS/MS należy użyć m/z 355 dla klasy F1, m/z 353 dla klasy F2 i m/z 351 dla klasy F3 PG. Dane C. elegans MS/MS dla PG serii F są dostępne na rysunku 4 i w tabeli 23,16. Dane MS/MS dotyczące eikozanoidów ssaków są dostępne pod adresem www.lipidmaps.org.
  11. Przetwarzaj dane analityczne za pomocą oprogramowania analitycznego (wersja 1.4.2, Applied Biosystems).

Wyniki

Przygotowanie próbek przeprowadzono metodą ekstrakcji ciecz-ciecz zaadaptowaną z Golovko i Murphy17. Zapewniła ona doskonały odzysk standardu wewnętrznego (PGF2α-d4). Ogólny schemat ekstrakcji PG z C. elegans przedstawiono na Rysunku 1. Warunki chromatograficzne zoptymalizowano tak, aby uzyskać rozdzielenie do linii bazowej dla >30 standardów eikosanoidów (Tabela 1 przedstawia 13 standardów). Najlepszą rozdzielczość i czułość zapewniła kolumna Hydro-Rp (250 x 2,0 mm i.d) z wodą i acetonitrylem zawierającym 0,1% kwasu mrówkowego. Skanowania przeglądowe ekstraktów typu dzikiego oraz mutantów fat-3 pokazane na Rysunku 2 dokumentują globalne poziomy jonów w zakresie mas atomowych 315-360. Mutanty fat-3(wa22) nie posiadają większości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) o długości 20 atomów węgla. Zaznaczono PG klasy F3. Na Rysunku 3 analizy MRM ekstraktu typu dzikiego wykazują wiele izomerów PG klas F1 (Rysunek 3A), F2 (Rysunek 3B) oraz F3 (Rysunki 3C i 3D). Klasę F3 można wykryć za pomocą jednego z dwóch przejść masowych, m/z 351/193 lub m/z 351/191. CePGF2 składa się głównie z enancjomeru PGF2α. CePGF1 jest prawdopodobnie PGF1α lub jego enancjomerem. Rysunek 4 przedstawia rozkład indukowany zderzeniem CePGF2 (RT=11,8) w porównaniu ze standardem PGF2α (RT=11,8). Niewielkie różnice w jonach produktowych wynikają prawdopodobnie z niskiej zawartości CePGF2 i współeluujących związków w ekstrakcie.

Ekstrakcja i oczyszczanie lipidów; schemat rozdziału chloroformowego; wirowanie; chromatografia cieczowa; analiza MS/MS.
Rycina 1. Schemat ekstrakcji PG z C. elegans oraz analiz LC-MS. Należy zwrócić uwagę, że zarówno aceton/sól fizjologiczna, jak i chloroform zawierają 0,005% BHT w celu zminimalizowania utleniania lipidów. Szczegóły znajdują się w tekście. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Schemat widm chromatografii masowej; intensywność w funkcji czasu retencji dla typu dzikiego i porównania fat-3(wa22).
Rysunek 2. Skanowania przeglądowe m/z 315-360 ekstraktów typu dzikiego i mutantów fat-3(wa22). Czas retencji (RT) w chromatografii cieczowej przedstawiono na panelu [A]. Ekstrahowane jony przy RT = 11,3 przedstawiono dla ekstraktów typu dzikiego [B] oraz fat-3(wa22) [C]. Zaznaczono PG z klasy F3 o masie m/z 351. Cps, zliczenia/sek; a.m.u., jednostka masy atomowej.

Chromatogramy spektrometrii mas; intensywność w funkcji czasu retencji; piki identyfikacji związków; analiza.
Rycina 3. Analizy MRM ekstraktów typu dzikiego. PG klasy F1 są wykrywane przy przejściu masy m/z 355/311 [A]. Należy zauważyć, że kilka związków hydrofobowych (RT > 14 min), które prawdopodobnie nie są PG, jest również wykrywanych przy tym przejściu. PG klasy F2 są wykrywane przy przejściu masy m/z 353/193 [B]. PG klasy F3 są wykrywane przy przejściu masy m/z 351/193 [C] lub m/z 351/191 [D]. Należy zauważyć, że ekstrakty zawierają wiele izomerów PG z każdej klasy. Numery odpowiadają PG przedstawionym w Tabeli 2. Stężenie CePGF2 wynosi 1.8 ng/ml. RT, czas retencji; cps, zliczenia/s.

Mass spectrometry data and chemical structure analysis diagram; lipid identification process.
Rysunek 4. Rozpad wywołany zderzeniami chemicznie syntetyzowanego PGF2α oraz CePGF2. Strzałki w panelu [A] wskazanie wspólnych jonów produktowych lub fragmentacyjnych dla PGF2α oraz CePGF2 (RT=11,8). Jony produktowe przy m/z 309 i m/z 193 są generowane z wskazanych miejsc cięcia (wyróżnionych a i b), odpowiadają przedstawionym strukturom i są charakterystyczne dla prostaglandyn serii F [B]cps, zliczeń/s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

StandardRT (min)[M-H]- m/zKluczowe jony produktu w MS/MS
20-hydroksy PGE29.43367349, 331, 287, 234, 189, 129, 109
PGF3-11.26351333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111
Tromboksan B211.66369289, 191, 177, 169, 151
PGF2-11.80353335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111
PGF1-11.79355337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195
Lipoksyna B412.38351201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59
PGD212.56351315, 271,203, 189
5(S), 6(R)- Lipoksyna A412.83351235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59
PGA214.02333315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109
Δ12-PGJ214.20333271, 189, 123
Leukotrien B414.73335181, 109, 93, 71, 69, 59, 57
15d-Δ12,14-PGJ216.80315297, 271, 217, 203, 158
5(S)-HpETE17.8833597, 83, 81, 57

Tabela 1. Czasy retencji i kluczowe jony produktów dla 13 wzorców eikozanoidów z metody LC-MS/MS3 . Do opracowania programu LC-MS/MS wykorzystano ponad 30 wzorców. Chromatograficzne czasy retencji (RT) różnią się od siebie, nawet w przypadku bardzo podobnych prostaglandyn (PG). Wyjątkiem są PGF1α oraz PGF2α. Niemniej jednak, prostaglandyny te można rozróżnić na podstawie mas jonów prekursorowych ([M-H]- m/z) oraz widm dysocjacji indukowanej kolizyjnie (MS/MS).

Klasa prostaglandynNr na rysunku 3[M-H]- m/zKluczowe jony produktowe w MS/MS
F1 (CePGF1)1355319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157
F12355311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157
F2 (CePGF2)3353309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127
F24353309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113
F35351315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139
F36351333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163

Tabela 2. Jony produktów rozpadu indukowanego zderzeniami dla kilku głównych PGs F1, F2 i F3 C. elegans przedstawionych na rysunku 3. Nie przedstawiono widm MS/MS innych, mniej obfitych izomerów. Dane te pochodzą z wielu analiz i nie wszystkie jony produktów mogą być widoczne w danym pomiarze. Ze względu na złożoność ekstraktów, niektóre mniej obfite jony produktów mogą pochodzić od innego jonu prekursorowego o podobnym czasie retencji lub wynikać z interferencji. Pik 2 jest prawdopodobnie stereoisomerem CePGF1, a pik 4 prawdopodobnie stereoisomerem CePGF2. Dodatkowe dane znajdują się w pracy Edmonds, et al. (2010)3.

Dyskusja

Opisujemy procedurę ekstrakcji i analizy eikozanoidów, koncentrując się na PG serii F. Istnieje kilka części procedury, które mogą być problematyczne. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby kultury robaków nie głodowały, ponieważ głód może zmienić metabolizm PG. Do dokarmiania zaleca się bakterie NA22 zamiast częściej stosowanych bakterii OP50, ponieważ NA22 osiąga większą gęstość. Jednak szczep NA22 nie ma oporności na antybiotyki i jest bardziej podatny na zanieczyszczenie. Po drugie, robaki syntetyzują pojedyncze izomery PG w niewielkiej obfitości w stosunku do tkanek ssaków. Może to być częściowo spowodowane redundancją wśród licznych izomerów. Zalecamy około 6 g tkanki do kompleksowej analizy i silniejszych sygnałów. Mniej tkanki (1-2 g) można użyć, jeśli wysuszony ekstrakt zostanie ponownie zawieszony w roztworze mniejszej ilości metanolu: wody w celu zwiększenia stężenia PG. Można jednak wykonać tylko jedno lub dwa wstrzyknięcia. Granica wykrywalności naszego systemu LC-MS/MS wynosi około 10 pg PGF2α /ml. Jeden ml gęsto upakowanych robaków w stadium mieszanym (około 1 g) daje około 25-50 pg CePGF2. Bardziej czułe systemy spektrometrii mas mogą zmniejszyć ilość tkanki robaka wymaganej do analizy. Po trzecie, różnice w wydajności ekstrakcji PG między próbkami mogą powodować różne wyniki. Odkryliśmy, że wydajność ekstrakcji jest bardzo podobna, gdy tkanki są ekstrahowane równolegle. Aby określić wydajność, dodaj 1,0 ng PGF2α-d 4 na etapie homogenizacji jako kontrolę wewnętrzną. MRM z zastosowaniem przejścia masowego m/z 357/197 służy do pomiaru stężenia PGF2α-d4 w stosunku do roztworu wzorcowego 1 ng/ml. Następnie oblicza się ilość PGF2α-d 4 utraconego podczas ekstrakcji.

Uwzględnione przez nas parametry chromatograficzne i przejścia masowe mogą być zmieniane w celu wykrycia innych PG i eikozanoidów. Pomimo znacznych wysiłków nie udało nam się zidentyfikować PG serii D lub E w ekstraktach17. Ponadto nie wykryliśmy 8-iso PGF2α i 8-iso PGE2 , które są charakterystyczne dla peroksydacji inicjowanej przez wolne rodniki, która generuje nieselektywną mieszaninę stereoizomerów PG19. Nie wiadomo, czy robaki syntetyzują inne typy PG. W ekstraktach z C. elegans 5,7,20,21 znaleziono endokannabinoidy oraz różne epoksydowe i hydroksymetabolity kwasów arachidonowego i eikozapentaenowego. Zalecamy stosowanie zarówno MRM, jak i MS/MS w porównaniu z autentycznymi standardami odpowiednio do oznaczania ilościowego i identyfikacji. W przypadku nowych eikozanoidów analizy te powinny być połączone z badaniem porównawczym mutantów tłuszczów , które mają niedobór enzymów syntetyzujących PUFA22, a także, jeśli to możliwe, z testem funkcjonalnym. Zastrzeżeniem do analizy mutantów tłuszczowych jest to, że niewielkie ilości PUFA obecnych w robakach są wystarczające do syntezy PG. Na przykład mutanty tłuszczu-2 (wa17) mają niewielką aktywność desaturazy D12 (~ 5% dzikiego typu22) i te mutanty nadal wytwarzają PGs6. mutanty tłuszczu-3(wa22) i tłuszczu-4(wa14) nie syntetyzują PG pochodzących z kwasów arachidonowych i eikozapentaenowych16. Odkryliśmy również, że mutanty tłuszczowe kompensują utratę klas PUFA poprzez zwiększenie syntezy PG z pozostałych klas. Na przykład mutanty tłuszczu-3(wa22) nie syntetyzują większości PG pochodzących z 20-węglowych PUFA. Zamiast tego wydaje się, że regulują w górę nowe PG pochodzące z 18-węglowych PUFA16. Do tej pory nie zidentyfikowaliśmy szczepu C. elegans , który byłby całkowicie pozbawiony syntezy PG. Możliwe, że PG są niezbędne dla wzrostu lub rozwoju.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Laboratorium Ukierunkowanej Metabolomiki i Proteomiki UAB, które było częściowo wspierane przez Centrum Badań nad Chorobami Skóry UAB (P30 AR050948 do C. Elmetsa), Centrum Ostrego Uszkodzenia Nerek UAB-UCSD O'Brien (P30 DK079337 do A. Agarwala) oraz Centrum Zdrowia Płuc UAB (R01 HL114439, R01 HL110950 do J.E. Blalocka). Wsparcie dla spektrometru mas pochodziło z grantu NCRR Shared Instrumentation (S10 RR19261 dla S. Barnesa). Dziękujemy również Rayowi Moore'owi za wsparcie techniczne. C. Szczepy elegans zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez NIH. Prace te były wspierane przez NIH (R01GM085105 do MAM, w tym suplement administracyjny ARRA).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
X-duże (16 cm) płytkiFisher Scientific0875714
E. coli szczep NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC)NA22http://www.cgc.cbs.umn.edu
Aceton, 399,5%Fisher ScientificA928-4
Butylowany hydroksytoluenMP Biomedicals101162
Heksan, klasa HPLCFisher ScientificH302-1
Kwas mrówkowy, 399%AcrosAC27048-0010Dostępne za pośrednictwem Fisher Scientific
Chloroform, klasa HPLCAcrosAC26832-0010Dostępne za pośrednictwem Fisher Naukowy
PGF2α -d4Cayman Chemicals316010Cayman posiada szeroką gamę standardów dostępnych do zakupu
Sterylna zakrętka wolnostojąca tubka 5 mlFisher Scientific14-222-651Do użytku z kulkami
z tlenku cyrkonu Bullet Blender 0,5 mmNastępny> > > AdvanceZrOB05
10 ml szklane, stożkowe, wytrzymałe probówki wirówkowe z podziałkąKimble Kimax45200-10Dostępne w szklanych
probówkach stożkowych Fisher Scientific 15 mlCorning Pyrex8082-15Dostępne przez Fisher Scientific
Sigmacote (odczynnik silikonowyzujący)Sigma-AldrichSL2-100ML
Fiolka ze szkła 1/2 Dram z nakrętką wyłożoną teflonemFisher ScientificV1235C-TFE
EQUIPMENT
CentraSL2 Wirówka klinicznaThomas Scientific2517N92-TS
Bullet Blender 5 niebieski homogenizatorNastępny > > > AdvanceBBY5MBHomogenizator Dounce o pojemności 40 ml może być stosowany jako alternatywa
Synergi 4 μ m Hydro-RP 80 i #197; Kolumna LC 250 x 2,0 mmPhenomenenex00G-4375-B0Kolumna HPLC
Wkłady SecurityGuard AQ C18 4 x 2,0 mmPhenomenenexAJ0-7510
SecurityGuard Zestaw nabojówPhenomenenexKJ0-4282
Shimadzu Prominence HPLC z chłodzonym automatycznym sampleremShimadzu Scientific Instruments, Inc.Każdy standardowy system HPLC sprzężony z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym powinien być wystarczający
API 4000 potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy AppliedBiosystems/MDS SCIEX
M9 receptura bufora (4 litry)
12 g KH2PO4
24 gNa2HPO4
20 gNaCl
Do 4 litrówWoda dejonizowana
Porcja do ośmiu butelek o pojemności 1 litra. Autoklaw i schłodzić.
0,5 ml/butelka1 M MgSO4
Zestaw wkładów SecurityGuard

Bibliografia

  1. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
  2. Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
  3. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  4. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
  5. Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
  6. Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
  7. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
  8. Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
  9. Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
  10. Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
  11. Wang, D., Dubois, R. N. Eicosanoids and cancer. Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).
  12. Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
  13. Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
  14. Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
  15. Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
  16. Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).
  17. Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
  18. Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
  19. Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. Human biochemistry of the isoprostane pathway. J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).
  20. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
  21. Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chromatografia cieczowatandemowa spektrometria masekstrakcja ciecz-cieczanaliza eikozanoidówanalogi deuterowanemonitorowanie wielu reakcjidysocjacja indukowana zderzeniemskany przeglądowe
Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.