Artykuł metodologiczny

Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

DOI:

10.3791/50451

⸱

11 kwietnia 2013

 , 
1Electrical Engineering Department, University of California, Los Angeles , 2Bioengineering Department, University of California, Los Angeles , 3California NanoSystems Institute (CNSI), University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeglądamy nasze ostatnie wyniki dotyczące integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te urządzenia do mikroanalizy oparte na telefonach komórkowych mogą być przydatne do analizy cytometrycznej, takiej jak wykonywanie różnych zadań związanych z liczeniem komórek, a także do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, np. próbek wody w warunkach ograniczonych zasobów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa są szeroko stosowanymi narzędziami w badaniach biomedycznych i diagnostyce klinicznej. Jednak urządzenia te są na ogół stosunkowo nieporęczne i kosztowne, co czyni je mniej skutecznymi w ustawieniach o ograniczonych zasobach. Aby potencjalnie rozwiązać te ograniczenia, niedawno zademonstrowaliśmy integrację szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonach komórkowych przy użyciu kompaktowych, lekkich i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. W naszej konstrukcji cytometrii przepływowej komórki znakowane fluorescencyjnie są przepłukiwane przez kanał mikroprzepływowy, który jest umieszczony nad istniejącą kamerą telefonu komórkowego. Zasilane bateryjnie diody elektroluminescencyjne (LED) są sprzężone doczołowo z boku tego mikroprzepływowego chipa, który skutecznie działa jak wielomodowy falowód płytowy, w którym światło wzbudzenia jest kierowane w celu równomiernego wzbudzenia celów fluorescencyjnych. Kamera telefonu komórkowego nagrywa film poklatkowy komórek fluorescencyjnych przepływających przez kanał mikroprzepływowy, w którym przetwarzane są cyfrowe klatki tego filmu w celu zliczenia liczby oznaczonych komórek w roztworze docelowym będącym przedmiotem zainteresowania. Korzystając z podobnej konstrukcji opto-fluidycznej, możemy również zobrazować te fluorescencyjnie znakowane komórki w trybie statycznym, np. umieszczając cząstki fluorescencyjne między dwoma szklanymi szkiełkami i przechwytując ich fluorescencyjne obrazy za pomocą kamery telefonu komórkowego, która może osiągnąć rozdzielczość przestrzenną np. ~ 10 μm przy bardzo dużym polu widzenia ~ 81 mm2. Ta oparta na telefonie komórkowym platforma do obrazowania fluorescencyjnego, cytometrii przepływowej i mikroskopii, może być przydatna szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów, np. do liczenia limfocytów T CD4 + w celu monitorowania pacjentów z HIV + lub do wykrywania pasożytów przenoszonych przez wodę w wodzie pitnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia i cytometria przepływowa są szeroko stosowanymi technikami1-12 w badaniach biomedycznych i naukowych, a także w diagnostyce klinicznej do liczenia i charakteryzowania różnych typów komórek. Jednak konwencjonalne mikroskopy i przyrządy do cytometrii przepływowej są stosunkowo skomplikowane i drogie, co ogranicza ich zastosowanie głównie do renomowanych laboratoriów centralnych. Niedawno opracowaliśmy kompaktowe i lekkie urządzenie do obrazowania fluorescencyjnego, cytometryczne i mikroskopijne zintegrowane z telefonem komórkowym,13,14 które daje nadzieję na ekonomiczne przełożenie mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i powiązanych technik mikroanalizy na środowiska o ograniczonych zasobach do różnych zastosowań telemedycznych mających wpływ na zdrowie na całym świecie.

W konfiguracji optofluidycznej cytometrii przepływowej (patrz np. Rysunek 1C i 1D), specjalnie zaprojektowany kanał mikroprzepływowy oparty na polidimetysiloksanach (PDMS) jest umieszczony przed modułem kamery telefonu komórkowego, gdzie diody elektroluminescencyjne (LED) są sprzężone z krawędziami kanału. Ten mikroprzepływowy chip, wraz z znajdującą się w nim próbką cieczy, tworzy opto-fluidyczny falowód planarny (składający się na przykład z PDMS-ciecz-PDMS) tak, że światło wzbudzenia jest kierowane w celu równomiernego pompowania próbek znakowanych fluorescencyjnie do wnętrza mikrokanału. Emisja fluorescencji z tych oznaczonych obiektów, np. komórek, jest dalej obrazowana przez dodatkową soczewkę umieszczoną zaraz za kamerą telefonu komórkowego i jest odwzorowywana na czujniku obrazu CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) telefonu komórkowego. Ponieważ emisja fluorescencyjna jest zbierana prostopadle do ścieżki światła wzbudzenia, niedrogi plastikowy filtr absorpcyjny jest wystarczający do usunięcia rozproszonego światła wzbudzenia i może zapewnić przyzwoite tło ciemnego pola wymagane do obrazowania fluorescencyjnego. Korzystając z podobnej konstrukcji opto-fluidycznej, możemy również obrazować obiekty fluorescencyjne w trybie statycznym (patrz rysunek 1A i 1B), w którym cząstki fluorescencyjne są umieszczone między dwoma szklanymi szkiełkami zamiast przepływać przez kanał mikroprzepływowy, a emisja fluorescencyjna z tych fluorescencyjnych cząstek jest przechwytywana przez czujnik obrazu CMOS w telefonie komórkowym w celu zliczenia i scharakteryzowania cząstek. W zależności od różnych wymagań aplikacji można wybrać cytometrię przepływową lub szerokokątną mikroskopię fluorescencyjną. Na przykład urządzenie do cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym może być szczególnie przydatne do badań przesiewowych dużych objętości próbek cieczy (np. kilku ml) w celu wykrycia rzadkich komórek lub patogenów.

W tym manuskrypcie przeglądamy niektóre z naszych ostatnich wyników dotyczących integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te oparte na telefonach komórkowych platformy mikroanalizy, cytometrii obrazowej i czujników mogą zapewnić różne możliwości w zakresie telemedycyny i diagnostyki przyłóżkowej, szczególnie wpływając na naszą walkę z globalnymi wyzwaniami zdrowotnymi w regionach świata o ograniczonych zasobach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej sekcji przedstawiamy eksperymentalne protokoły dla naszej szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej opartej na telefonie komórkowym13 i platformy cytometrii obrazowania optofluidycznego14. Użyjemy fluorescencyjnych kulek i znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek do przetestowania tych platform obrazowania.

A. Przygotowanie szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego opartego na telefonie komórkowym i cytometru przepływowego do obrazowania optofluidycznego

Mikroskop fluorescencyjny lub cytometr przepływowy oparty na telefonie komórkowym składa się z dwóch głównych części: telefonu z kamerą i kompaktowej dodatkowej przystawki opto-fluidycznej.

1. Telefon z aparatem

Chociaż przedstawione techniki mają zastosowanie do prawie każdego telefonu z aparatem, wybraliśmy Sony Erickson Aino jako podstawę dla tych urządzeń. Ten telefon komórkowy ma zainstalowaną matrycę CMOS RGB o rozdzielczości ~ 8 megapikseli oraz wbudowany obiektyw o ogniskowej (f1) ~ 4,65 mm.

2. Przystawka opto-fluidyczna do szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej

Przystawka optyczna została zaprojektowana przez Autodesk i jest drukowana przez drukarkę 3D Dimension Elite przy użyciu materiału termoplastycznego ABSplus. W tym procesie drukowania materiały modelowe i pomocnicze są podgrzewane w głowicy wytłaczającej w drukarce i są osadzane warstwa po warstwie na podstawie modelarskiej. Po zakończeniu tego etapu materiał nośny można rozpuścić, pozostawiając solidny model 3D pożądanego prototypu Nasz projekt mocowania optycznego składa się z diod LED (środkowa długość fali przy ~ 470 nm, Digikey), plastikowego filtra (#NT54-46, Edmund Optics), tacki na próbki i soczewki płasko-wypukłej f2=15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Wszystkie diody LED i plastikowe filtry można łatwo wymienić w oparciu o widma fluoroforów. Kroki montażu tej nasadki optofluidycznej obejmują:

  1. Umieść obiektyw w nasadce w określonej pozycji uchwytu obiektywu.
  2. Umieść plastikowy filtr na tacy filtra i wsuń go do nasadki lub przyklej plastikowy filtr przed obiektywem aparatu telefonu komórkowego.
  3. Włóż tacę LED do nasadki.
  4. Umieść szkiełka podstawowe w tacce na próbki. Wsuń tacę na próbki do nasadki. Skieruj diody LED w stronę sample.
  5. Przypnij nasadkę do telefonu komórkowego tak, aby dodatkowy obiektyw stykał się bezpośrednio z obiektywem aparatu telefonu komórkowego.
  6. Użyj przełącznika na nasadce, aby włączyć diody LED.
  7. Wyobraź sobie interesującą próbkę za pomocą aparatu w telefonie komórkowym, korzystając z jego "trybu nocnego".

3. Przystawka opto-fluidyczna do cytometrii obrazowania fluorescencyjnego

Gdy zachodzi potrzeba badania dużych ilości próbek cieczy w celu wykrycia rzadkich zdarzeń, preferowane może być urządzenie do optofluidycznej cytometrii przepływowej. Możemy zmodyfikować naszą konstrukcję mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia i przekształcić go w cytometr przepływowy, w którym kanał mikroprzepływowy oparty na PDMS jest używany do ciągłego dostarczania próbki cieczy przez objętość obrazowania. Nasadka optyczna została również zaprojektowana przez Autodesk i wydrukowana na drukarce 3D Dimension Elite. Składa się również z diod LED (środkowa długość fali przy ~ 470 nm, Digikey), plastikowego filtra (#NT54-46, Edmund Optics), tacki na próbki i soczewki asferycznej (f = 4,5 mm) (produkt # C230TME-A; Thorlab). Kroki montażu tej nasadki optofluidycznej obejmują:

  1. Umieść soczewkę asferyczną w nasadce.
  2. Umieść plastikowy filtr na tacy filtra i wsuń go do nasadki lub przyklej plastikowy filtr przed obiektywem aparatu telefonu komórkowego.
  3. Wsuń kanał mikroprzepływowy do tej samej nasadki opto-fluidycznej.
  4. Przypnij nasadkę do telefonu komórkowego tak, aby dodatkowy obiektyw stykał się bezpośrednio z obiektywem aparatu telefonu komórkowego.
  5. Użyj przełącznika na nasadce, aby włączyć diody LED.
  6. Podłączyć kanał mikroprzepływowy do pompy strzykawkowej i dostarczyć próbkę cieczy do urządzenia mikroprzepływowego ze stałym natężeniem przepływu.
  7. Uchwyć film z fluorescencyjnymi komórkami/cząstkami przepływającymi przez kanał mikroprzepływowy w trybie wideo kamery telefonu komórkowego.

B. Przygotowanie próbki

4. Przygotowanie próbek mikrocząstek fluorescencyjnych

  1. Koraliki fluorescencyjne o średnicy 10 μm (kulki czerwone: produkt #F8834 wzbudzeniu/emisji 580nm/605nm; kulki zielone: produkt #F8836: wzbudzenie/emisja 505nm/515nm) kupowane są w firmie Invitrogen (Karlowe Wary, Kalifornia).
  2. Zmieszaj 10 μl zielonych kulek fluorescencyjnych, 10 μl czerwonych kulek fluorescencyjnych z 40 μl wody DI.
  3. Umieść 10 μl tej mieszanki kulek na szkiełku podstawowym za pomocą mikropipety i umieść na niej kolejne szkiełko podstawowe, aby uzyskać strukturę warstwową.
  4. Włóż tę strukturę kanapkową do tacki na próbki i wsuń ją do nasadki telefonu komórkowego.

5. Przygotowanie znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek

  1. Wyjmij zestaw do znakowania fluorescencyjnego kwasów nukleinowych SYTO16 (#S7578, Life Technology) i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej.
  2. Przenieś 200 μl próbki krwi pełnej z probówki do pobierania krwi EDTA do probówki polistyrenowej o pojemności 1,5 ml (# 05-408-129, Fisher Scientific).
  3. Dodać 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (# R7757, Sigma-Aldrich) do próbki 200 μl krwi pełnej i dokładnie wymieszać.
  4. Po 5 minutach odwirować próbkę krwi poddanej lizie i usunąć roztwór sklarowany nad osadem.
  5. Zawiesić osad białych krwinek w buforze PBS o pojemności 200 μl i delikatnie wymieszać.
  6. Dodać 5 μl 1 mM roztworu SYTO16 do próbki białych krwinek. Owinąć próbkę folią aluminiową i inkubować w ciemnym otoczeniu przez ~ 30 min.
  7. Ponownie odwirować próbkę. Supernatant jest usuwany, a znakowane białe krwinki są ponownie zawieszane w buforze PBS.
  8. Umieść 5-10 μl znakowanej próbki płynnych krwinek białych na szkiełku nakrywkowym i umieść drugą szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.
  9. Włóż szkiełko z próbką umieszczoną warstwowo do tacki na próbki i zobrazuj je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w telefonie komórkowym.

Alternatywnie

  1. Ciągłe dostarczanie znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek przez kanał mikroprzepływowy za pomocą automatycznej pompy strzykawkowej, jednocześnie rejestrując fluorescencyjny film mikroskopowy przepływających komórek za pomocą kamery telefonu komórkowego w trybie wideo. Powinniśmy również podkreślić, że przenośna pompa strzykawkowa zasilana bateryjnie, a nawet siła grawitacji może być wykorzystana do napędzania przepływu przez kanał mikroprzepływowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki naszemu schematowi optofluidycznego pompowania/wzbudzania (Rysunki 1C i 1D), fluorescencyjnie znakowane komórki mogą być w sposób ciągły dostarczane do kanału mikroprzepływowego za pomocą pompy strzykawkowej, podczas gdy kamera w telefonie komórkowym rejestruje poklatkowy fluorescencyjny film mikroskopowy przepływających komórek. Te fluorescencyjne filmy mogą być następnie szybko analizowane za pomocą algorytmów wykrywania i śledzenia konturów14,15 w celu automatycznego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy nasze ostatnie wyniki dotyczące szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej opartej na telefonach komórkowych i obrazowania optofluidycznego cytometrii przepływowej przy użyciu lekkich i kompaktowych nasadek opto-fluidycznych do aparatów w telefonach komórkowych. Korzystając z tej technologii, zobrazowaliśmy obiekty fluorescencyjne, w tym mikrocząsteczki i oznaczone białe krwinki w próbkach krwi pełnej. Dlatego ten kompaktowy i ekonomiczny zestaw narzędzi do obrazowania fluorescencyjnego oparty na telefoni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Ozcan jest założycielem start-upu, którego celem jest komercjalizacja narzędzi do obrazowania obliczeniowego i mikroskopii.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Ozcan z wdzięcznością dziękuje za wsparcie Prezydenckiej Nagrody Wczesnej Kariery dla Naukowców i Inżynierów (PECASE), Nagrody Młodego Badacza Biura Badań Wojskowych (ARO), Nagrody KARIERY Narodowej Fundacji Nauki (NSF), Nagrody Młodego Badacza Biura Badań Marynarki Wojennej (ONR) oraz Nagrody Dyrektora Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) dla Nowych Innowatorów DP2OD006427 przyznanej przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Telefon komórkowySonySony Ericsson Aino
Plano-wypukły obiektywEdmund Optics# NT45-302
Soczewka asferycznaThorlab# C230TME-A
FiltrEdmund Optics#NT54-46
Niebieska dioda LEDDigikey#365-1201-ND
BateriaDigikey#P032-ND
Rurka polistyrenowaFisher Scientific#05-408-129
Bufor do lizy czerwonych krwinekSigma AldrichR7757
SYLGARD 184 ZESTAW ELASTOMERÓW SILIKONOWYCHDow Corning
Red fluorescencyjne koraliki (10 μ m)Life Technologies#F8834
Zielone koraliki fluorescencyjne (10 μ m)Life Technologies#F8836
Fluorescencyjne oznakowanie kwasów nukleinowych SYTO16Life Technologies# S7578

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
  2. Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
  3. Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
  6. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
  7. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801(2006).
  11. Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
  12. Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
  13. Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
  14. Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
  15. Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
  16. Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
  17. Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
  18. Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia smartfonowaprzystawka optofluidycznakana mikroprzep ywowywzbudzenie LEDmikroskopia szerzeniakulki fluorescencyjneleukocytydiagnostyka w punkcie opieki Point of Care

Powiązane artykuły