Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50455

⸱

13 sierpnia 2013

 , 
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

W tym artykule

Podsumowanie

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Streszczenie

Limfocyty T regulatorowe (Treg) są niezbędne do zapewnienia odporności na siebie oraz na niektóre obce antygeny. Tregi mogą być generowane z naiwnych limfocytów T CD4 in vitro z TCR- i kostymulacją w obecności TGFβ i IL-2. Ma to ogromny potencjał dla przyszłych terapii, jednak cząsteczki i szlaki sygnałowe, które kontrolują różnicowanie, są w dużej mierze nieznane.

Pierwotne limfocyty T mogą być manipulowane poprzez ektopową ekspresję genów, ale powszechne metody nie są w stanie ukierunkowanym na najważniejszy naiwny stan limfocytu T przed rozpoznaniem pierwotnego antygenu. Tutaj przedstawiamy protokół ekspresji genów ektopowych w naiwnych limfocytach T CD4 in vitro przed indukcją różnicowania Treg. Stosuje transdukcję z adenowirusem z niedoborem replikacji i wyjaśnia jego powstawanie i produkcję. Adenowirus może zajmować duże insercje (do 7 kb) i może być wyposażony w promotory w celu osiągnięcia wysokiej i przejściowej nadekspresji w limfocytach T. Skutecznie transdukuje naiwne mysie limfocyty T, jeśli wyrażają one transgeniczny receptor adenowirusa Coxsackie (CAR). Co ważne, po zakażeniu limfocyty T pozostają naiwne (CD44 niskie, CD62Lwysokie) i spoczynkowe (CD25-, CD69-) i mogą być aktywowane i różnicowane w limfocyty Treg podobnie jak komórki niezakażone. Metoda ta umożliwia więc manipulację różnicowaniem limfocytów T CD4 od samego początku. Zapewnia, że ektopowa ekspresja genów jest już na miejscu, gdy wczesne zdarzenia sygnalizacyjne początkowej stymulacji TCR indukują zmiany komórkowe, które ostatecznie prowadzą do różnicowania Treg.

Wprowadzenie

Tregi są kluczowe dla utrzymania tolerancji immunologicznej i tłumienia nadmiernych odpowiedzi immunologicznych. Tregi hamują aktywację limfocytów T osób postronnych. W konsekwencji ablacja limfocytów Treg prowadzi do śmiertelnej autoimmunizacji i samozniszczenia napędzanego przez aktywowane limfocyty T1. Tregi rozwijają się w grasicy podczas negatywnej selekcji pojedynczych dodatnich prekursorów CD4, ale mogą również różnicować się na obrzeżach od naiwnych limfocytów T CD4 po stymulacji antygenem w niskich dawkach z nieoptymalną kostymulacją 1,2. Tregi grasicy wydają się hamować autoimmunizację tkanek przed własnymi antygenami, podczas gdy obwodowe Tregi są zaangażowane w zapewnianie tolerancji w jelitach lub płucach. Te indukowane limfocyty Treg silnie zapobiegają aktywacji limfocytów T po rozpoznaniu obcych antygenów w błonie śluzowej, w tym antygenów środowiskowych z żywności i powietrza, bakterii komensalnych i alergenów 3,4. Ponadto limfocyty Treg mają kluczowe znaczenie dla ustalenia matczynej tolerancji na peptydy płodowe 5 i zapobiegania chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi 6. W tym samym czasie limfocyty Treg pośredniczą również w niepożądanych skutkach poprzez osłabienie nadzoru immunologicznego nad komórkami nowotworowymi 7,8. Cechą charakterystyczną limfocytów Treg jest ekspresja czynnika transkrypcyjnego Foxp3 określającego podzbiór, czynnika transkrypcyjnego zawierającego domenę widełkową, który jest niezbędny i wystarczający do nadania funkcji Treg 9,10. Znane są pewne szlaki sygnałowe, które mogą indukować ekspresję Foxp3. Jednak procesy molekularne, które kontrolują, regulują lub modulują różnicowanie limfocytów Treg w odpowiedzi na wyzwalanie receptora limfocytów T, są mniej dobrze poznane.

Treg mogą być bardzo skutecznie indukowane in vitro poprzez stymulację naiwnych limfocytów T CD4 przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 w obecności TGFβ i IL-2 11. Ponieważ pojawiające się limfocyty Treg są funkcjonalne in vivo, manipulacja cząsteczkami, które promują różnicowanie limfocytów Treg, niesie ze sobą ogromny potencjał dla przyszłych terapii, na przykład leczenia astmy, choroby Leśniowskiego-Crohna i transplantacji 11,12. I odwrotnie, terapeutyczna modulacja cząsteczek w celu zablokowania różnicowania Treg może przynieść korzyści w przyszłych podejściach do skojarzonego leczenia pacjentów z nowotworami.

Testy różnicowania in vitro odegrały kluczową rolę w opisie zmian molekularnych związanych z różnicowaniem podzbiorów limfocytów T. W chwili obecnej eksperymentalne próby poszukiwania lub badań przesiewowych produktów genowych, które kontrolują różnicowanie limfocytów T, są utrudnione przez fakt, że najpowszechniejsze metody ektopowej ekspresji genów zawodzą w naiwnych limfocytach T. Na przykład elektroporacja i transdukcja retrowirusowa są skuteczne tylko w aktywowanych limfocytach T. W przeciwieństwie do początkowych oczekiwań, transdukcja lentiwirusowa, która jest zwykle skuteczna w komórkach w stanie spoczynku, wymaga wstępnej aktywacji naiwnych limfocytów T przez cytokiny13. Co więcej, transfer cDNA lub mRNA podczas elektroporacji wiąże się z depolaryzacją błony plazmatycznej, która sama w sobie nadaje cechy aktywacji limfocytów T, a nawet może mobilizować sygnalizację Ca2 + i aktywować białka NFAT (niepublikowana obserwacja i odnośnik 14). Podobnie, w przypadku transdukcji retrowirusowej, naiwne limfocyty T muszą być aktywowane przez 18 - 40 godzin. W tym czasie dochodzi do rozpadu błony jądrowej w trakcie podziału komórki i pozwala na późniejszą integrację genomową wektora retrowirusowego 15. Metody te nie są zatem w stanie zająć się wczesną regulacją molekularną początkowego spotkania limfocytów T z antygenem, co jest decydującą fazą różnicowania limfocytów T pomocniczych.

Transdukcja adenowirusowa jest znana z tego, że nadaje przejściową ekspresję genów ektopowych w wielu typach komórek ludzkich, które wyrażają ludzki receptor adenowirusa Coxsackie (CAR). Przebiega bez konieczności aktywacji komórek lub progresji cyklu komórkowego. Ekspresja powierzchniowa CAR jest niezbędna do skutecznego przyłączania i internalizacji wirusa, a transgeniczna ekspresja skróconej wersji CARΔ1 pod promotorem specyficznym dla limfocytów T sprawia, że mysie tymocyty i limfocyty T są podatne na infekcję adenowirusową 16. Co ważne, transgen nie zmienia rozwoju tymocytów ani różnicowania in vitro naiwnych limfocytów T CD4 w różne podzbiory (dane nie pokazane; odnośnik 17). Transdukcja limfocytów T za pośrednictwem adenowirusa była wcześniej stosowana do nadekspresji 17,18 i podejść knock-down 19,20. Transgeniczne limfocyty T można oczyścić z dostępnego w handlu DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. i ref. 17). Co ważne, transdukcja adenowirusowa pozwala na wysoką ekspresję interesującego genu w naiwnych limfocytach T bez wywoływania oczywistych oznak aktywacji. Limfocyty T pozostają naiwne (CD44 niskie, CD62Lwysokie) i spoczynkowe (CD25-, CD69-) po zakażeniu i mogą być aktywowane i różnicowane w Treg podobnie jak komórki niezakażone.

Produkcja rekombinowanych adenowirusów może być osiągnięta po transfekcji komórek HEK293A z plazmidami adenowirusowymi (Rysunek 1). Plazmidy te zazwyczaj zawierają ludzki genom adenowirusa typu 5 z usuniętymi genami E1 i E3, co powoduje, że rekombinowane adenowirusy są niekompetentne do replikacji 21. HEK293A komórki uzupełniają niedobór replikacji, ponieważ zostały uwiecznione poprzez stabilną integrację ściętego adenowirusa 22. Ponieważ wektory adenowirusowe są duże (~40 kb) i w związku z tym nie nadają się do tradycyjnego klonowania za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych, zastosowaliśmy system Gateway. Interesujący gen jest początkowo klonowany do mniejszego wektora wejściowego, z którego można go łatwo przenieść do wektora docelowego adenowirusa za pośrednictwem reakcji rekombinacji lambda (LR) 23. Skonstruowaliśmy wektor pCAGAdDu, łącząc promotor CAG (promotor aktyny kurczaka i wzmacniacz CMV) z kasetą ekspresyjną zawierającą miejsca LR flankujące prokariotyczny marker selekcyjny ccdB 24 . Ta kaseta ekspresyjna jest połączona z wewnętrznym elementem miejsca wejścia rybosomu (IRES), który umożliwia koekspresję białka zielonej fluorescencji wzmocnionego markerem infekcji eukariotycznej (eGFP), które jest połączone z sekwencją zawierającą sygnał poli(A) bydlęcego hormonu wzrostu. Wybraliśmy sekwencje cis-regulatorowe CAG, ponieważ okazało się, że prototypowy promotor CMV jest wysoce zależny od aktywacji, a zatem niekorzystny dla ekspresji genów w naiwnych limfocytach T.

Tutaj udostępniamy protokół skutecznego różnicowania Treg in vitro oraz metodę transdukcji naiwnych limfocytów T CD4 bez aktywacji (Rysunek 2). Metoda umożliwia ektopową ekspresję genów lub zahamowanie poprzedzającego różnicowania limfocytów T CD4 w stanie naiwnym. Pozwala to na przetestowanie wpływu nadmiernie eksprymowanego genu podczas wczesnych zdarzeń sygnalizacyjnych po początkowej stymulacji TCR do momentu zaangażowania podzbioru limfocytów T. Nasze eksperymenty walidacyjne stanowią również podstawę do ustalenia podobnego zastosowania adenowirusa w różnicowaniu innych podzbiorów limfocytów T, takich jak komórki Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 lub Tfh.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie interesującego genu do wektora wejściowego

  1. Sklonuj interesujący nas gen do wektora wejściowego. W tej procedurze można zastosować amplifikację genu metodą PCR, a następnie ligację końców do wektora sprzężonego z topoizomerazą (np. pENTR/D-TOPO) lub klonowanie za pośrednictwem enzymu restrykcyjnego.

2. Przenoszenie interesującego genu do wektora docelowego pCAGAdDu

  1. Przenieś interesujący nas gen z wektora wejściowego do wektora docelowego za pomocą rekombinacji LR (np. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Spowoduje to utworzenie wektora ekspresji adenowirusa (ryc. 1).
  2. Linearyzuje 10 μg adenowirusowego wektora ekspresyjnego w trawieniu restrykcyjnym PacI, wytrąca DNA i ponownie zawiesza je w wodzie w stężeniu 3 μg na 100 μl. Linearyzacja uwalnia odwrócone powtórzenia wirusa (ITR), które są wymagane do replikacji i enkapsydacji wirusowego DNA w cząsteczki wirusa.

3. Generacja pierwotnego lizatu wirusa

  1. Zasiać 1 x 105 HEK293A komórek w 2 ml pożywki do hodowli komórkowych (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) w jednym dołku na 6-dołkowej płytce i inkubować komórki przez 6-14 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 10% CO2 , aby mogły przylegać. Komórki powinny wtedy znajdować się w około 50% zbieżności.
  2. Lipofekcja: Przenieść 6 μl odczynnika jetPEI do 94 μl 50 μM NaCl, krótko odwirować. Dodaj zmieszany roztwór do 100 μl zlinearyzowanego wektora adenowirusowego podczas wirowania i inkubuj tę mieszankę transfekcyjną przez 15 - 30 minut w temperaturze pokojowej.

Wykonaj wszystkie poniższe kroki w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa biologicznego dla infekcji adenowirusem!

  1. Dozować roztwór kroplami do studzienki zawierającej HEK293A komórki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 10% CO2 . W przypadku korzystania z markera fluorescencyjnego należy ocenić wizualnie skuteczność transfekcji po 12 - 36 godzinach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Dodawać 0,5 ml świeżej pożywki co 3 dni.
  2. Sprawdzaj co 2-3 dni pod mikroskopem świetlnym lub fluorescencyjnym pod kątem efektów cytopatycznych (CPE), czyli obszarów z powiększonymi i zaokrąglonymi komórkami, które zaczynają się odklejać. Świadczy to o efektywnym generowaniu wirusów. Po wystąpieniu szerszych stref CPE (ryc. 3), minie od 24 do 72 godzin, zanim wszystkie komórki zostaną zainfekowane.
  3. Gdy wszystkie komórki wykazują oznaki CPE, ale przed całkowitym oderwaniem komórek, należy je delikatnie pipetować i przenieść komórki z supernatantem (SN, 3 - 5 ml) do probówki z polistyrenu o pojemności 15 ml.
  4. Zamrozić komórki w SN na suchym lodzie przez 15 - 20 minut, a następnie szybko je rozmrozić w temperaturze 37 °C, aby rozerwać komórki. Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania (F/TC) jeszcze dwa razy. Pierwotny lizat wirusa należy przechowywać na lodzie do wykorzystania w ciągu jednego dnia lub zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Każdy dodatkowy F/TC zmniejszy miano wirusa o 30 - 50%.

4. Amplifikacja wirusa

  1. Wysiewaj i hoduj HEK293A komórki do 90% zbiegu na 14 cm naczyniu do hodowli tkankowej.
  2. Zainfekuj komórki połową lizatu wirusa pierwotnego (1,5 - 2,5 ml) i inkubuj komórki przez co najmniej 36 godzin. Następnie należy zainfekować prawie wszystkie komórki, co można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu ponownej amplifikacji już amplifikowanego (tj. bardziej skoncentrowanego) szczepu wirusa, należy zainfekować HEK293A przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 50 (patrz 6.3).
  3. Komórki powinny być zbierane, gdy wszystkie wykazują CPE, ale przed oderwaniem. Przy wydajnej produkcji wirusa stan ten osiąga się w ciągu 48 godzin po zakażeniu. (Jeśli trwa to do jednego tygodnia, należy rozważyć kolejną rundę amplifikacji poprzez zwiększenie ilości adenowirusa używanego do infekcji opisanej w 4.2.)
  4. Odłączyć komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść komórki oraz SN do probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml. Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć SN i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki lub SN (ok. 1 ml).
  6. Wykonać 3 F/TC, aby rozbić komórki i odwirować przy 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zdjąć SN zawierający cząstki wirusa (tj. skoncentrowany lizat wirusa) i poddzielić podwielokrotność lizatu wirusa w celu przechowania go w temperaturze -80 °C.

5. Wyznaczanie miana wirusa

  1. Zasiać 105 komórek A549 w każdym dołku w 5 dołkach 12-dołkowej płytki w 1 ml pożywki i pozostawić komórki do przylegania przez 6 godzin.
  2. Użyć 1 μl skoncentrowanego adenowirusa (rozmrożonego na lodzie) do wykonania seryjnego rozcieńczenia w pożywce (1:5 000, 1:10 000, 1:50 000, 1:100 000) i dodać 10 μl do dołka. Pozostaw jedną studzienkę niezainfekowaną, aby wyregulować bramkowanie w cytometrii przepływowej.
  3. Po 36 godzinach zdjąć SN, przemyć PBS i odłączyć komórki (np. przez trypsynizację). Ze względu na zagrożenie biologiczne zaleca się utrwalenie komórek w 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i jednorazowe przemycie PBS.
  4. Wykonaj analizę FACS ekspresji markera infekcji. Wykres "Zastosowany μl lizatu wirusowego" w stosunku do bezwzględnej liczby zakażonych komórek (ryc. 4). Określić liniowy zakres infekcji i obliczyć miano na ml nierozcieńczonego wirusa z krzywej wzorcowej w zakresie liniowym, przyjmując x = 1 000 μl.

6. Zakażenie limfocytami T

  1. Wyizolować naiwne/spoczynkowe limfocyty T CD4 z DO11.10 tg; Myszy CARΔ1 tg przy użyciu sortowania MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) lub sortowania FACS (CD4 + CD25- CD62L + CD44-).
  2. W przypadku eksperymentów na małą skalę należy odpipetować odpowiednią objętość lizatu wirusowego, aby osiągnąć MOI 50 do jednego dołka 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
  3. Dodać do 4 x 105 limfocytów T w końcowej objętości infekcji 50 μl w pożywce z komórek T (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyrugronian, 1x NEAA, 1x Witamina MEM Essential, 1x L-glutamina, 1:250 000 Merkaptoetanol, 10 mM HEPES).
    Przykład:
    Do zakażenia limfocytów T 3 x 105 stosuje się MOI wynoszący 50; Miano wirusa wynosi 3 x 109 ml-1
    Objętość wirusa = MOI x liczba limfocytów T / miano wirusa = 50 x (3 x 105) / (3 x 109 ml-1) = 0,005 ml

Uwaga: dla infekcji większą liczbą komórek, zwiększ skalę za pomocą MOI 50 w objętości infekcji 165 μl na 106 naiwnych limfocytów T w probówce z polistyrenu z luźnym kubkiem (do 3 ml na probówkę).

  1. Inkubować komórki przez 90 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdjąć SN, ponownie zawiesić w 200 μl PBS. Ponownie odwirować i zdjąć SN.

(Opcjonalnie: komórki mogą być ponownie umyte, aby skuteczniej usunąć wirusa)

  1. Zawiesić komórki w pożywce z 200 μl limfocytów T bez stymulacji przeciwciał i bez IL-2 lub innych cytokin, a następnie odpoczywać przez 40 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić ekspresję interesującego genu przed aktywacją.

7. Aktywacja i polaryzacja limfocytów T

  1. Odpipetować objętość kulek sprzężonych z anty-CD3 i anty-CD28, która jest równa liczbie komórek (np. 4 x 105) do małego kubka na odczynnik, dodać 10-krotną objętość PBS i umieścić je na magnesie na 2 minuty. Zdjąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w pożywce polaryzującej o objętości 200 μl (dla Treg: pożywka z limfocytów T + 1 ng/ml TGFβ, 100 U/ml IL-2).

Uwaga: Komórki mogą być również aktywowane za pomocą naczyń do hodowli tkankowych pokrytych przeciwciałami anty-CD28 i anty-CD3, lub w sposób specyficzny dla receptora limfocytów T DO11.10 za pomocą napromieniowanych splenocytów BALB/c pulsowanych antygenem peptydowym albuminy jaja kurzego 323-339.

  1. Odwirować odpoczynkowane komórki jak poprzednio, zdjąć SN i ponownie zawiesić komórki w 200 μl pożywki polaryzacyjnej zawierającej kulki sprzężone z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 bez zmiany pożywki.

8. Utrwalanie i barwienie limfocytów T w cytometrii przepływowej

  1. Umyć komórki: Odwirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdjąć SN, ponownie zawiesić w 200 μl PBS. Ponownie odwirować i zdjąć SN. Wykonaj odpowiednio wszystkie poniższe kroki prania.
  2. Zawiesić komórki w 100 μl roztworu do barwienia martwych komórek, dającego się utrwalić, i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć komórki, ponownie zawiesić w 100 μl PBS, dodać 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS, inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj komórki, zawieś je ponownie w 200 μl lodowatego 70% metanolu w PBS i inkubuj przez 30 minut na lodzie.

Uwaga: Komórki mogą być od teraz leczone bez ryzyka biologicznego!

  1. Przygotować 60 μl mieszanki wzorcowej z 60 μl PBS + 10 μg/ml bloku Fc (anty-FCR3 w celu zablokowania niespecyficznego wiązania). Umyć komórki, zawiesić je ponownie w 40 μl PBS + anty-FCR3 i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 20 μl PBS + anty-FCR3 zawierającego 1 μg przeciwciała anty-Foxp3 sprzężonego z PE, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Umyj komórki dwukrotnie w PBS i przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Produkcja wirusa

Aby uzyskać wysokie miana wirusa, kluczowy jest moment zbioru komórek HEK293A podczas pierwotnej produkcji wirusa lub jego amplifikacji. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne i w kontraście fazowym z wizualnymi oznakami produkcji wirusa przedstawiono na Rysunku 3. CPE zaobserwowano 10 dni po transfekcji komórek HEK293A kontrolnym wektorem pCAGAdDu bez wkładki. CPE charakteryzują się pojawieniem obszarów z powiększonymi i zaokrąglonymi komórkami, które zaczynają ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wytwarzanie i miareczkowanie wirusów

Dla uzyskania optymalnych wyników transfekcji najważniejsza wydaje się jakość i ilość linearyzowanego wektora. Nie zaobserwowaliśmy negatywnego wpływu początkowego przerostu kultury na produkcję lizatu pierwotnego, ponieważ infekcja szybko postępuje, gdy nastąpi efektywna produkcja wirusa. Jednak na produkcję wirusa przez komórki HEK293A mogą wpływać długie wstawki, które zmniejszają wydajność. Okazało się, że niektóre otwarte ramki odczytu zakłócają produkcję...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Lirui Du za skonstruowanie wektora pCAGAdDU oraz Oliverowi Gorce za dostarczenie protokołu fiksacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do klonowania pENTR/D-TOPOInvitrogenK240020
Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymówInvitrogen11791020
PacINew England BiolabsR057S
jetPEIPolyplus-transfekcja101-10N
HEK293A Linia komórkowaInvitrogenR705-07
A549ATCCCCL-185
Płytki 6-dołkoweBD Falcon353046
14 cm naczynie do hodowli tkankowychNunc168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1) 1JdgrTaconic FarmsModel Nr. 4285
Naiwny zestaw do izolacji komórek T CD4 + IIMiltenyi Biotech130-094-131
DMEMInvitrogen41966-052
FBSPAN Biotech1502-P110704
PenStrepInvitrogen15140-122
RPMI 1640LonzaBE12-167F
NaPyrgronianLonzaBE13-115E
NEAA 100xLonzaBE13-114E
L-GlutaminaInvitrogen25030
Roztwór buforowy HEPES (1 M)Invitrogen15630-056
β-MerkaptoetanolSigma-AldrichM-7522
MEM Niezbędna mieszanka witamin (100x)Lonza13-607C
Mysi aktywator T Dynabeads CD3 / CD28 do ekspansji i aktywacji komórekInvitrogen114-56D
Rekombinowany ludzki TGF-beta 1R& D Systems240B
Proleukin S (18 x 106IE)Novartis
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich barwników martwych komórekInvitrogenL-23105
Mysz BD Fc BlockTBD Pharmingen553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PEeBioscience12-5773-82
Mmu-miR-155 Test mikroRNA TaqManRoche Applied Biosystems
Sondy LightCycler 480 MasterRoche Applied Biosystems04902343001
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan RocheApplied Biosystems4366596
4427975

Bibliografia

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314(2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415(2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307(2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4(2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacyjne limfocyty Tektopowa ekspresja genówcytometria przepływowabarwienie na Foxp3aktywacja limfocytów Tnadekspresja genuwarunki polaryzacji Treg
Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.