Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Podsumowanie

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Streszczenie

Glikogen jest głównym energetycznym polimerem glukozy u kręgowców i odgrywa kluczową rolę w metabolizmie całego ciała, jak również w metabolizmie komórkowym. Istnieje już wiele metod wykrywania glikogenu, ale tylko kilka z nich ma charakter ilościowy. Opisujemy tutaj metodę z wykorzystaniem zestawu do oznaczania glikogenu Abcam, która opiera się na specyficznej degradacji glikogenu do glukozy przez glukoamylazę. Glukoza jest następnie specyficznie utleniana do produktu, który reaguje z sondą OxiRed w celu wytworzenia fluorescencji. Miareczkowanie jest dokładne, czułe i można je przeprowadzić na ekstraktach komórkowych lub skrawkach tkanek. Jednak w przeciwieństwie do innych technik nie daje informacji o rozmieszczeniu glikogenu w komórce. Jako przykład tej techniki opisujemy tutaj miareczkowanie glikogenu w dwóch liniach komórkowych, fibroblastach płuc chomika chińskiego CCL39 i ludzkim raku jelita grubego LS174, inkubowanych w normoksji (21%_O2) w porównaniu z hipoksją (1%_O2). Postawiliśmy hipotezę, że niedotlenienie jest sygnałem, który przygotowuje komórki do syntezy i przechowywania glikogenu w celu przetrwania¹.

Wprowadzenie

Glikogen to wielorozgałęziony polimer reszt glukozy, który jest obecny w cytoplazmie wielu typów komórek. Jest to jedna z głównych form magazynowania energii w komórkach i odgrywa ważną rolę w metabolizmie glukozy. Większość komórek ssaków jest w stanie wytwarzać i przechowywać glikogen, który może być szybko rozkładany do glukozy, aby promować glikolizę i produkcję ATP podczas stresu metabolicznego. Hepatocyty wytwarzają ogromne ilości glikogenu w celu regulacji poziomu cukru we krwi, zapewniając w ten sposób ciągły dopływ glukozy do organizmu. Natomiast stężenie glikogenu w innych komórkach (mięśniach, czerwonych krwinkach itp.) jest stosunkowo niskie. Jednak lokalnie ilości te są wystarczające, aby zapewnić energię w krótkim okresie, gdy komórki są nagle wystawione na działanie środowiska pozbawionego składników odżywczych.

Synteza i rozkład glikogenu przebiegają w ten sam sposób we wszystkich tkankach (Rysunek 1). Po pierwsze, glukoza dostaje się do komórek przez transportery glukozy (GLUT) i jest szybko przekształcana z glukozo-6-fosforanu (G6P) w glukozo-1-fosforan (G1P) przez fosfoglukutazę. G1P jest następnie modyfikowany do glukozy UDP, a węgiel C1 glukozy UDP jest przyłączany do reszty tyrozynowej glikogeniny, białka kotwiczącego glikogenu. Cząsteczka ta, uważana za starter glikogenu, jest rozszerzana przez przyłączenie glukozy UDP do końcowej glukozy za pomocą α(1→4) wiązania za pomocą syntazy glikogenu. Wreszcie, gdy powstaje łańcuch liniowy składający się z ponad 11 reszt glukozy, enzym rozgałęziający przenosi końcowy oligosacharyd utworzony przez co najmniej 6 reszt glukozy do innej glukozy w pobliskim łańcuchu za pośrednictwem wiązania α(1→6). Powtórzenie tego procesu daje masywną strukturę fraktalną zawierającą gałęzie, które tworzą helisę o stężeniu 6,5 glukozy na obrót. Glikogen może być odwrotnie hydrolizowany do glukozy przez skoordynowane działanie enzymów rozgałęziających, które hydrolizują α(1→6) związana i glikogenowa fosforylaza, która hydrolizuje α(1→4) glikozyd związany między ostatnią resztą glukozy gałęzi a cząsteczką glikogenu. Ta reakcja zwana glikogenolizą jest aktywowana przez zwiększanie poziomu AMP (odzwierciedlającego zużycie ATP) i hamowana przez glukozę i ATP^2,3.

Za pomocą mikroskopii elektronowej, cząsteczki glikogenu zostały opisane w wielu typach komórek jako β wolne cząstki (lub monocząsteczki glikogenu) o średnicy 15-30 nm. W określonych typach komórek, takich jak hepatocyty, cząstki β mogą być łączone w kompleks, tworząc rozety, znane również jako cząstki α, które różnią się średnicą od 80 nm do maksymalnie 200 nm⁴. Sposób, w jaki te β cząstki są wiązane, tworząc większe skupiska α cząstek, wciąż nie jest w pełni wyjaśniony. Niektóre dowody wskazują na to, że cząstki β mogą być wiązane wiązaniem kowalencyjnym⁵, wiązaniem wodorowym, a nawet poprzez interakcje białko-białko⁶. Ilość glikogenu przechowywanego w komórkach zależy od wielu parametrów: (I) ilości glikogeniny w komórce, która inicjuje syntezę glikogenu; (II) aktywność syntazy glikogenu i fosforylazy regulowanej przez fosforylację/defosforylację białek; (III) stężenie glukozy w komórkach, które zależy od kilku parametrów, takich jak dostarczanie glukozy z układu naczyniowego i wychwyt glukozy przez komórki. Zapasy glikogenu są ściśle regulowane przez allosteryczną regulację hormonów biosyntetycznych przez metabolity pośrednie, przez hormony regulujące metabolizm energetyczny oraz przez szlaki sygnałowe wyczuwające składniki odżywcze⁷.

Ważne jest, aby móc określić ilościowo glikogen w próbkach biologicznych, aby lepiej zrozumieć znaczenie metabolizmu glikogenu na całym ciele i poziomie komórkowym. Opisujemy tutaj precyzyjny, powtarzalny i wygodny test biochemiczny in vitro dla glikogenu. Technika ta opiera się na ilościowym określeniu fluorescencji glukozy przed i po specyficznej hydrolizie glikogenu.

Istnieją inne metody szacowania poziomu glikogenu w komórkach, ale większość z nich nie jest ilościowa. Jedna z pierwszych opisanych technik oznaczania ilościowego glikogenu w komórkach opierała się na pomiarze [¹⁴C]-glukozy wbudowywanej w glikogen^8,9. Zastosowanie promieniotwórczości sprawia, że proces ten jest trudniejszy do opanowania, ale ma tę zaletę, że zapewnia szybkość wprowadzania glukozy do glikogenu i rozróżnia rozkład reszt glukozy na zewnętrznych gałęziach i w rdzeniu cząsteczki (wymaga to również dodatkowej β-amylolizy i etapu chromatograficznego). Inna technika została opracowana niedawno i opiera się na włączeniu 2-NBDG (2-{N-[7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo]amino}-2-deoksyglukozy), fluorescencyjnej pochodnej 2-deoksyglukozy, do glikogenu¹⁰. Zmierzona intensywność fluorescencji odzwierciedla ilość wytwarzanego glikogenu i może być mierzona za pomocą czytnika fluorescencji. Rozkład fluorescencji w komórce można również ocenić za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wśród innych technik nieilościowych, barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS) jest prawdopodobnie najbardziej powszechne. Może być stosowany do wykrywania glikogenu w utrwalonych komórkach, skrawkach tkanek w parafinie lub zamrożonych. Ta technika histologiczna barwi niespecyficznie polisacharydy, glikolipidy, glikoproteiny, celulozę i obojętne mucyny na fioletowo. Swoistość tego testu można zwiększyć poprzez potraktowanie nieruchomych komórek lub skrawków tkanek diastazą, która specyficznie trawi glikogen. Następnie poziom glikogenu można oszacować jakościowo, porównując próbki niezhydrolizowane (wszystkie makrocząsteczki modyfikowane węglowodanami) z próbkami zhydrolizowanymi (makrocząsteczki zmodyfikowane węglowodanami z wyjątkiem glikogenu). Barwienie PAS i analiza mikroskopowa, w przeciwieństwie do testów biochemicznych glikogenu, dostarcza informacji dotyczących rozmieszczenia glikogenu w komórce, który może być dyfundowany lub skoncentrowany w określonej części komórki. Jednakże, mimo że barwienie PAS szacuje różnice w akumulacji glikogenu między różnymi warunkami, nie jest ilościowe¹¹.

Monoklonalne mysie przeciwciało pierwotnie wytworzone przy użyciu chrząstki kłykciowej żuchwy, ponieważ antygen ten okazał się reagować z glikogenem w komórkach i z oczyszczonym glikogenem in vitro¹². Ponieważ przeciwciało to specyficznie rozpoznaje łańcuchy cukrowe związane z glikogenem, jest użytecznym narzędziem do wykrywania glikogenu za pomocą immunohistochemii w bardziej specyficzny sposób niż barwienie PAS.

Mikroskopia elektronowa to kolejna technika, która pozwala na wizualizację ziaren glikogenu w komórkach i ocenę stopnia magazynowania glikogenu. W rzeczywistości cząstki β glikogenu są łatwo rozpoznawalne za pomocą mikroskopii elektronowej jako gęste granulki^{elektronów 1}.

Protokół

Biochemiczne miareczkowanie glikogenu

1. Liza komórek

1. Komórki nasienne w stężeniu 0,5-2 x 10⁶ na naczynie o średnicy 100 mm.
2. Leczenie: inkubacja komórek przez 24, 48 lub 72 godziny w niskim stężeniu tlenu (hipoksja) w beztlenowej stacji roboczej Bug-Box (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, Wielka Brytania) ustawionej na 1% lub 0,1% O₂, 94% lub 94,9% N₂ i 5% CO₂. Równolegle inkubować komórki w normoksji (21%_O2, 5% CO₂). Zmieniaj pożywkę (pożywkę zawierającą glukozę 25 mM) co 24 godziny, aby zminimalizować wahania stężenia glukozy w czasie eksperymentu.
3. Po zabiegu przemyj komórki 2x PBS, aby usunąć ślady glukozy z pożywki hodowlanej. Zeskrob komórki w zimnym PBS.
4. Odwirować roztwór z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut, wyrzucić supernatant i raz przemyć osad PBS. Granulat można zamrozić w temperaturze -20 °C przed kontynuowaniem.
5. Zawiesić osad w 100 μl wody destylowanej. Dodać 100 μl buforu do hydrolizy glikogenu dostarczonego z zestawem do oznaczania glikogenu (Abcam). Gotować lizat w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji enzymów.
6. Wirować i odwirowywać lizat z prędkością 13 000 obr./min przez 10 minut, aby usunąć nierozpuszczalne produkty. Zachować supernatant.
7. Aby znormalizować poziom glikogenu do zawartości białka między próbkami, kwantyfikacja białek może być przeprowadzona za pomocą 25-35 μl supernatantu za pomocą testu kwasu bicunchoninowego (BCA-Interchim).

Część lizatu może być użyta do pomiaru stężenia wolnego glukozy wewnątrz komórek.

2. Hydroliza glikogenu

1. Zmieszać 50 μl supernatantu (etap 1) z 1 μl mieszanki enzymów hydrolizujących. Ta mieszanina zawiera glukoamylazę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować krzywą wzorcową, rozcieńczając wzorcowy glikogen (2 mg/ml) dostarczony z zestawem do roztworu 10 μg/ml w buforze do hydrolizy. Następnie przygotuj sześć oddzielnych probówek z 0, 4, 8, 12, 16 i 20 μl wzorca 10 μg/ml i dostosuj każdą probówkę do końcowej objętości 50 μl z buforem hydrolitycznym, aby uzyskać stężenie glikogenu 0, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 i 0,2 μg/ml. Dodać 1 μl mieszanki enzymów hydrolizy do wzorców i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Stężenie glukozy w tle linii komórkowej, podane przez wartość stężenia wolnej glukozy, musi zostać odjęte od wartości całkowitego stężenia glukozy (glukoza z hydrolizy glikogenu + wolna glukoza), aby określić poziom glikogenu w komórce.

3. Rozwój i odczyt fluorescencji

1. Dla każdego warunku przygotuj jedną probówkę (probówkę 1) do pomiaru stężenia wolnej glukozy i dwie probówki (probówki 2 i 3) do pomiaru całkowitego stężenia glukozy (każda probówka z inną objętością hydrolizowanego glikogenu).
2. Dodać 15 μl supernatantu wyekstrahowanego na końcu etapu 1 w probówce 1. Dodać 35 μl buforu do hydrolizy do uzyskania końcowej objętości 50 μl. Uzyskana fluorescencja da stężenie wolnej glukozy.
3. Dodać X μl hydrolizowanego glikogenu (otrzymanego w kroku 2) do probówki 2. Doprowadzić do końcowej objętości 50 μl. Objętość próbki (X μl) należy dostosować do gęstości komórek i/lub typu komórki w celu uzyskania wartości fluorescencji, które nie przekraczają stężeń krzywej kalibracyjnej.
4. Dodać 2X μl hydrolizowanego glikogenu do probówki 3. Doprowadzić do końcowej objętości 50 μl.
5. Przygotuj roztwór rozwojowy dla próbek i wzorców, mieszając dla każdej probówki 48,7 μl buforu rozwojowego, 1 μl mieszanki enzymów rozwojowych i 0,3 μl sondy OxiRed (dostarczanej w zestawie do oznaczania glikogenu). Na przykład dla 2 warunków przygotuj mieszankę na 12 probówek (6 dla wzorców, 2 dla wolnej glukozy i 4 dla całkowitej fluorescencji glukozy).
6. Dodaj 50 μl tej mieszanki do każdej probówki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Zmierzyć fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 535 nm, długości fali emisji 587 nm zgodnie z zaleceniami i szczelinie 3 nm dla wzbudzenia i emisji.

Wyniki

Niski poziom tlenu (hipoksja) w guzach sygnalizuje komórkom nowotworowym potrzebę gromadzenia energii w celu radzenia sobie z późniejszym niedoborem składników odżywczych, aby przetrwać. Ponieważ glikogen jest głównym polimerem energetycznym glukozy w komórkach ssaków, zbadaliśmy regulację magazynowania glikogenu w warunkach hipoksji. Obliczenia i standaryzacja stężenia glikogenu w lizatach komórkowych muszą być wykonane na surowych danych fluorescencji, jak pokazano w Tabelach 1, 2 i

Dyskusja

Biochemiczne miareczkowanie glikogenu in vitro pozwala na dokładne ilościowe określenie zawartości glikogenu w komórkach. W porównaniu z niektórymi innymi technikami (PAS, immunofluorescencja przeciwciałem glikogenowym itp.), miareczkowanie to jest bardzo specyficzne, czułe i powtarzalne. Co więcej, metoda jest wygodna, ponieważ nie wymaga radioaktywności, ale spektrometru fluorescencyjnego. Jednak ta technika jest czysto ilościowa i nie dostarcza informacji o dystrybucji glikogenu w komórce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
DMEM	Invitrogen	31966.047
Zestaw do oznaczania glikogenu	Abcam	ab65620
PBS
EQUIPMENT
Spektrometr fluorescencyjny	PerkinElmer	LS 50B