Zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA)

Podsumowanie

Unaczynione allotransplantacje kompozytowe (VCA) stały się kliniczną rzeczywistością. Jednak szerokie zastosowanie kliniczne VCA jest ograniczone przez przewlekłą wielolekową immunosupresję. Autorzy prezentują wiarygodny i powtarzalny duży model zwierzęcy do tłumaczenia nowych strategii immunomodulacyjnych, które mogą zminimalizować lub potencjalnie wyeliminować potrzebę immunosupresji w VCA.

Streszczenie

Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA), taka jak przeszczepy dłoni i twarzy, stanowi realną opcję leczenia złożonych urazów mięśniowo-szkieletowych i wyniszczającej utraty tkanek. Pomimo korzystnych i bardzo zachęcających wczesnych i pośrednich wyników funkcjonalnych, odrzucenie wysoce immunogennego składnika skórnego VCA i potencjalne skutki uboczne przewlekłej wielolekowej immunosupresji nadal utrudniają powszechne zastosowanie kliniczne VCA. Dlatego badania w tej nowej dziedzinie muszą koncentrować się na badaniach translacyjnych związanych z unikalnymi cechami immunologicznymi VCA oraz na opracowaniu nowych strategii immunomodulacyjnych w zakresie immunomodulacji i indukcji tolerancji po VCA bez konieczności długotrwałej immunosupresji.

Ten artykuł opisuje niezawodny i powtarzalny translacyjny duży zwierzęcy model VCA, który składa się z płata kostno-skórnego w allotransplantacji heterotopowych kończyn tylnych świń zdefiniowanych przez MHC. Krótko mówiąc, dobrze unaczyniona łopatka skórna jest identyfikowana w przednio-przyśrodkowej okolicy uda za pomocą angiografii laserowej w bliskiej podczerwieni. Leżące poniżej mięśnie, staw kolanowy, dystalna część kości udowej i bliższa kość piszczelowa są pobierane na szypułce naczynia udowego. Ten przeszczep allogeniczny może być uważany zarówno za VCA, jak i unaczyniony przeszczep szpiku kostnego z jego unikalnymi cechami uprzywilejowanymi immunologicznie. Przeszczep jest przeszczepiany do podskórnej kieszonki brzusznej u zwierzęcia biorcy z elementem skóry zewnętrznie skierowanym do obszaru grzbietowo-bocznego w celu monitorowania immunologicznego.

Trzy zespoły chirurgiczne pracują jednocześnie w dobrze skoordynowany sposób, aby skrócić czas znieczulenia i niedokrwienia, poprawiając w ten sposób efektywność tego modelu i zmniejszając potencjalne czynniki zakłócające w protokołach eksperymentalnych. Model ten służy jako podstawa dla przyszłych strategii terapeutycznych mających na celu zmniejszenie i potencjalne wyeliminowanie potrzeby przewlekłej wielolekowej immunosupresji w VCA.

Wprowadzenie

Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA), taka jak przeszczepy dłoni i twarzy, stała się rzeczywistością kliniczną z licznymi przeszczepami rąk i twarzy wykonywanymi na całym świecie¹². Pomimo faktu, że wczesne i pośrednie wyniki są korzystne i bardzo zachęcające², wymóg przewlekłej wielolekowej immunosupresji nadal ogranicza jej szerokie zastosowanie kliniczne. Postępy w mysich modelach VCA, w tym supermikrochirurgiczne zespolenia i techniki mankietów bez szwów^{13, 3}, utorowały drogę do lepszego zrozumienia odpowiedzi alloimmunologicznych w VCA. Zaproponowano niezliczone protokoły immunomodulacyjne do zastosowań klinicznych w oparciu o nasze lepsze zrozumienie mechanizmów immunologicznych w VCA, ale muszą one zostać zweryfikowane na dużym modelu zwierzęcym, który byłby w rozsądny sposób przewidywał ich działanie u ludzi⁷. Opierając się na fizjologicznych i immunologicznych podobieństwach między układami narządów człowieka i świni⁶, modele VCA świń można uznać za wiarygodną i opłacalną alternatywę dla modeli u psów⁹ i naczelnych¹.

Ten artykuł zawiera szczegółowy przegląd metodologii użytej w naszym zdefiniowanym przez MHC heterotopowym modelu przeszczepu kończyn tylnych świń, który służy jako podstawa dla naszych obecnych i przyszłych strategii immunomodulacyjnych mających na celu wywołanie tolerancji immunologicznej na VCA, a tym samym poszerzenie jej klinicznego zastosowania. Wykorzystujemy dobrze scharakteryzowane świnie wsobne wyhodowane do homozygotyczności w locus antygenu leukocytów świń specjalnie do ich wykorzystania w badaniach związanych z przeszczepami¹¹. Podnosimy unaczyniony płat kostno-skórny oparty na naczyniach udowych. Płat zawiera nienaruszony unaczyniony szpik kostny w dystalnej części kości udowej i bliższej części kości piszczelowej. Przednio-przyśrodkowa skóra uda jest również włączona do przeszczepu i jest eksterioryczna do grzbietowo-bocznej części zwierzęcia biorcy w celu monitorowania immunologicznego najbardziej immunogennego składnika VCA. Ułożenie grzbietowo-boczne ułatwia badanie kliniczne w pozycji stojącej i siedzącej, a także utrzymuje skórę przeszczepu allogenicznego w stosunkowo czystej czystości.

Ustener et al. wprowadzili jeden z pierwszych dużych zwierzęcych modeli translacyjnych w VCA, przeszczepiając promieniowe płaty kostno-mięśniowo-skórne kończyn przednich u niekrewniaczych świń hodowlanych¹⁵. Grupa wykorzystała ten model, aby po raz pierwszy wykazać, że ostre odrzucenie VCA, które obejmowało wysoce immunogenny składnik skóry, można opóźnić i leczyć klinicznie istotną strategią bez znaczących powikłań i skutków ubocznych specyficznych dla leku. Korzystne wyniki uzyskane w tym badaniu stały się następnie kamieniem węgielnym w projektowaniu schematów leczenia do przeszczepów rekonstrukcyjnych u ludzi. Chociaż te wczesne modele VCA świń dobrze nadawały się do opracowywania protokołów zapobiegających odrzuceniu skóry, mięśni, kości, nerwów i naczyń, brakowało im wyspecjalizowanych struktur, takich jak chrząstka stawowa i błony maziowe stawów. Kolejne wysiłki koncentrowały się na uwzględnieniu przyśrodkowego palca zwierzęcia, co wymagało umieszczenia gipsu na całej długości, aby zapobiec przemieszczeniu się przeszczepu¹⁴. Chociaż model ten nadaje się do badania odrzucenia wszystkich głównych elementów przeszczepu kończyny, jednym z głównych ograniczeń tego modelu były trudności w ambulatoryjnej sytuacji po przeszczepie spowodowane umieszczeniem gipsu. W związku z tym stworzono heterotopowe modele allotransplantacji kończyn świń, składające się z kości piszczelowej, strzałkowej, stawu kolanowego, dystalnej kości udowej, otaczających mięśni i łopatki skórnej, aby przede wszystkim badać immunologiczne aspekty VCA, umożliwiając jednocześnie zwierzęciu swobodne poruszanie się po operacji z minimalnym zachorowalnością ⁸.

Rozwój dobrze scharakteryzowanych, zdefiniowanych przez SLA świń wsobnych dzięki pionierskiej pracy dr Davida H. Sachsa doprowadził do nowej ery translacyjnych badań VCA. Wykorzystując heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych w warunkach niewielkiego niedopasowania antygenowego, Mathes i wsp.¹⁰ wykazało nieograniczone przeżycie składników układu mięśniowo-szkieletowego po krótkim cyklu leczenia cyklosporyną. Przeżycie składników skóry było jednak wydłużone tylko w porównaniu z brakiem kontroli leczenia. Utratę składnika skórnego przeszczepu przypisano izolowanej i bardzo energicznej odpowiedzi immunologicznej, w szczególności na naskórek. Podobnie, przy użyciu w pełni niedopasowanych świń z wyczerpaniem limfocytów T, krótki cyklosporyna i cytokina mobilizowały komórki jednojądrzaste krwi obwodowej dawcy indukowały tolerancję tylko na składniki mięśniowo-szkieletowe, a składnik skórny był nadal^odrzucany5. Zjawisko to, zwane "rozdwojoną tolerancją", przyniosło zmianę paradygmatu w badaniach nad VCA, z większym naciskiem na wysoce immunogenny składnik skóry, który jest integralnym składnikiem większości wykonanych do tej pory przeszczepów rekonstrukcyjnych.

W tym zmodyfikowanym modelu wykorzystujemy zespolenie typu end-to-end, podwiązując tętnicę udową biorcy i obracając ją w kierunku głowowym (Rysunek 1). To nie tylko skraca czas niedokrwienia, umożliwiając użycie konwencjonalnego urządzenia sprzęgającego, ale także zmniejsza ryzyko niepowodzenia zespolenia. Nie zaobserwowaliśmy żadnych zdarzeń niedokrwiennych po podwiązaniu tętnicy udowej u naszych biorców, co wskazywałoby, że krążenie oboczne było wystarczające do zapewnienia unaczynienia rodzimej nodze. Dodatkowo, w tej zmodyfikowanej metodzie, zewnętrzniony komponent skórny jest mobilizowany w oparciu o leżące poniżej naczynia perforacyjne i jest umieszczony bocznie (ryc. 1) w przeciwieństwie do brzusznego położenia pachwiny w tradycyjnym modelu¹⁰. Pozwala to na łatwą wizualizację przeszczepu w celu monitorowania odporności w pozycji stojącej lub siedzącej zwierzęcia.

Stąd niezawodny i powtarzalny duży model zwierzęcy jest niezbędny do zbadania strategii indukcji tolerancji w stosunku do składnika skórnego VCA i opracowania nowych nieinwazyjnych strategii monitorowania immunologicznego dla lepszego przewidywania przeżycia przeszczepu.

Protokół

W tej publikacji wideo, wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem dla zwierząt zatwierdzonym przez Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Planowanie przedoperacyjne

1. Wykorzystujemy zdefiniowane przez MHC miniaturowe świnie wsobne MGH (15-20 kg) w naszych badaniach translacyjnych do allotransplantacji kończyn, w których jeden dawca płci męskiej dostarcza kończyny dwóm biorcom płci żeńskiej (ryc. 1). Przed zabiegiem zwierzęta dawcy i biorcy są poddawane dokładnej ocenie klinicznej przez lekarza weterynarii.
2. W celu zminimalizowania czasu znieczulenia i niedokrwienia, zabiegi dawcy i biorcy przeprowadzane są jednocześnie na trzech stołach operacyjnych w jednej dedykowanej sali operacyjnej dla dużych zwierząt. Praca zespołowa i koordynacja między zespołami chirurgicznymi, a także personelem weterynaryjnym mają kluczowe znaczenie dla ogólnego sukcesu tej procedury. Plan operacji jest omawiany z zespołem weterynaryjnym na formalnym spotkaniu 1-2 tygodnie przed dniem operacji.
3. Tunelizowany cewnik do żyły centralnej (7 Fr dwustrumieniowy cewnik Hickmana) jest umieszczany w zewnętrznej lub wewnętrznej żyle szyjnej każdego biorcy zwierzęcia przed przeszczepem w celu immunosupresyjnego monitorowania poziomu leków i dożylnego podawania leków immunosupresyjnych i/lub immunomodulujących. Cewniki te są umieszczane w bezpośrednim polu widzenia za pomocą techniki cięcia żylnego i tunelizowane z tyłu, aby wyjść wysoko na szyi grzbietowej i zabezpieczane za pomocą niewchłanialnych szwów z monofilamentu i samoprzylepnego bandaża owijanego wokół szyi.
4. Trzymaj zwierzęta NPO (bez pokarmów stałych, ale dozwolone jest podlewanie ad lib) co najmniej 12 godzin przed zabiegiem.
5. W dniu zabiegu należy uspokoić zwierzęta ketaminą w dawce 20 mg/kg i ksylazyną w dawce 2 mg/kg domięśniowo.
6. Umieścić rurkę dotchawiczą o odpowiedniej wielkości i podłączyć ją do aparatu do znieczulenia i respiratora (utrzymywanego na izofluranie 0,5-3%)
7. Umieścić cewnik dożylny w żyle usznej brzeżnej i podawać 0,9% sól fizjologiczną w oparciu o masę ciała przez cały zabieg.
8. Podać analgezję zapobiegawczą (buprenorfina 0,02 mg/kg dożylnie).
9. Profilaktyczny antybiotyk (cefazolina 20-25 mg/kg dożylnie) należy podać przed pierwszym nacięciem zarówno zwierzętom dawczym, jak i biorcom.
10. Stosuj sterylną technikę we wszystkich procedurach zarówno dla biorców, jak i dawców. Obejmuje to stosowanie narzędzi sterylizowanych w autoklawie lub sterylizowanych gazem, masek, czepków na głowę, sterylnych fartuchów chirurgicznych i sterylnych rękawiczek. Ogolić obszar nacięcia maszynką do strzyżenia i zdezynfekować naprzemiennym roztworem Betadine i alkoholem.

Monitorowanie śródoperacyjne:

1. Po indukcji i intubacji należy utrzymać znieczulenie mieszaniną wziewną 0,5-3% izofluranu w tlenie.
2. Monitoruj tętno, pulsoksymetrię, EKG, CO₂ i temperaturę w odbycie w sposób ciągły i rejestruj co 15 minut.
3. Zapobiegaj hipotermii za pomocą ciepłego koca z wymuszonym obiegiem powietrza Bair Hugger.

Pobranie alloprzeszczepu kończyny kostno-skórnej od świni dawcy:

1. Umieść zwierzę dawcy w pozycji leżącej na stole operacyjnym i ułóż je w sterylny sposób.
2. Użyj angiografii laserowej bliskiej podczerwieni, aby zidentyfikować naczynia perforacyjne skóry przednio-przyśrodkowej. Wstrzyknąć zieleń indocyjaninową w ilości około 0,06 mg/kg rozcieńczoną w 2-5 ml soli fizjologicznej przez obwodowy dostęp naczyniowy. Około 10 sekund później wykonaj 30-2 minuty nagrań w bliskiej podczerwieni. Użyj wideo z tych nagrań, aby zidentyfikować perforatory. Na podstawie perforatorów zaznacz obszar skóry (około 100 cm²) do monitorowania.
3. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry pachwiny w ciągłości z oznaczeniami na łopatce do skóry (ryc. 2).
4. Zidentyfikuj naczynia udowe i odizoluj je dystalnie do poziomu gałęzi nadgenikulacyjnych i proksymalnie do poziomu więzadła pachwinowego.
5. Wypreparuj skórę i tkankę podskórną, zachowując obszar łopatki skórnej. Zszyj krawędzie skóry do leżących pod nią mięśni, aby uniknąć skurczu podczas zbioru płatów.
6. Wykonaj osteotomię tuż nad stępem za pomocą piły szablastej (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA).
7. Podziel mięśnie w bliższej części uda za pomocą elektrokoagulacji.
8. Podziel kość udową w połowie trzonu, pozostawiając płat kostno-skórny na szypułce naczyniowej. Płat zawiera łopatkę skórną, leżące pod nią mięśnie ud, staw kolanowy, dystalną część kości udowej i bliższą kość piszczelową, która zawiera nienaruszony unaczyniony szpik kostny o unikalnych cechach immunologicznych.
9. Użyj wosku kostnego, aby uzyskać hemostazę w przestrzeniach szpikowych. Wygładź krawędzie kości za pomocą ronjeurs w przygotowaniu dla biorcy.
10. Utrzymuj przeszczep perfundowany na szypułce naczyniowej, dopóki naczynia udowe biorcy nie zostaną przygotowane (ryc. 3).
11. Po zakończeniu sekcji biorcy należy podwiązać naczynia udowe dawcy tak proksymalnie, jak to możliwe, i przed przeszczepem podać histydynę-tryptofan-ketoglutaran (HTK, Custodiol, Newtown PA) przed przeszczepem.
    UWAGA: Kończyna dawcy jest przeszczepiana po przeciwnej stronie biorcy, tj. lewa kończyna dawcy po prawej stronie biorcy i prawa kończyna dawcy po lewej stronie biorcy).
12. Poddać eutanazji świnię dawcę natychmiast po pobraniu drugiej tylnej kończyny przy użyciu 100 mg/kg dożylnie pentobarbitalu sodu. Zgon jest potwierdzany przez personel weterynaryjny zgodnie z ustalonym protokołem.

4. Procedura biorcy (allotransplantacja kończyn tylnych)

1. Indukcję biorcy i intubację należy rozpocząć natychmiast po początkowym nacięciu dawcy, aby umożliwić przygotowanie naczyń biorczych podczas pobierania kończyny dawcy. Eliminuje to niepotrzebny czas oczekiwania i skraca całkowity czas znieczulenia dla dawcy i biorcy.
2. Ustawić zwierzę na wznak z obrotem o 30° po stronie operacyjnej, aby umożliwić odsłonięcie strony grzbietowo-bocznej.
3. Wykonać nacięcie pachwiny i odsłonić naczynia udowe; odizolować je dystalnie do poziomu gałęzi nadgennych i proksymalnie do poziomu więzadła pachwinowego.
4. Utwórz kieszeń podskórną od pachwiny do grzbietowo-bocznej ściany brzucha dla wstawki przeszczepu (ryc. 4).
5. Podwiązać naczynia dawcze i przepłukać przeszczep HTK.
6. Wykonaj wstawkę przeszczepu w sposób odwrócony: Łopatka do skóry powinna być skierowana grzbietowo-bocznie, aby umożliwić łatwe monitorowanie immunologiczne w pozycji stojącej, a odcięte końce naczyń udowych są skierowane doogonowo, aby umożliwić zespolenia naczyniowe od końca do końca bez żadnego napięcia naczyń (ryc. 5).
7. Jeśli to możliwe, użyj urządzenia do łączenia naczyń krwionośnych (Synovis, St Paul MN) do zespoleń żylnych (rozmiar 2,5-3,5 jest odpowiedni dla zwierząt o wadze 10-20 kg). To znacznie skraca czas niedokrwienia w porównaniu z konwencjonalnymi metodami.
8. Wykonać zespolenia tętnicze konwencjonalną techniką szwów z szwem 9-0 (Synovis, St Paul MN)
9. Po potwierdzeniu drożności naczyń zabezpiecz przeszczep na miejscu za pomocą szwów 3-0 PDS (ryc. 5). Mięśnie przeszczepu są przyszyte do mięśni ściany brzucha. Mięśnie przeszczepu nie powinny być przyszywane do mięśni uda biorcy, ponieważ może to być szkodliwe, gdy zwierzę porusza się po klatce.
10. Zewnętrznie zewnętrzizować łopatkę skórną po stronie grzbietowo-bocznej w celu monitorowania immunologicznego (ryc. 6) i przyszyć ją do sąsiedniej skóry za pomocą szwów podskórnych 3-0 Vicryl i wchłanialnych przerywanych szwów skórnych 4-0 monofilamentowych.
11. Zamknij skórę pachwiny warstwami za pomocą szwów podskórnych 3-0 Vicryl i wchłanialnych przerywanych szwów skórnych 4-0 monofilamentowych.
12. Umieść plaster z fentanylem o stężeniu 50-100 mcg/h do znieczulenia pooperacyjnego.
13. Po przeszczepie allogenu kończyn tylnych zwierzę po wybudzeniu i swobodnym oddychaniu wraca do kojca.

Wyniki

Wykonano dwadzieścia cztery heterotopowe przeszczepy kończyn tylnych świń zdefiniowane przez SLA, stosując naszą zmodyfikowaną technikę, przy średnim czasie niedokrwienia wynoszącym 78 min (zakres: 62-94 min). U wszystkich zwierząt bez trudności osiągnięto prawidłowe wszczepienie graftu oraz rozmieszczenie skórnego płata grzbietowo-bocznego. Angiografia laserowa w bliskiej podczerwieni wykazała doskonałe ukrwienie graftu u wszystkich biorców. Pierwszych dwanaście zespoleń żylnych wykonano przy użyciu konwencjonalnych tec...

Dyskusja

Historycznie rzecz biorąc, heterotopowy protokół przeszczepu kończyn tylnych obejmował eksterioryzację łopatki skórnej do brzusznej ściany brzucha, a naczynia były zespolene w sposób end-to-side (Hettiarachty 2004). Jednak w naszej zmodyfikowanej metodzie odwrócona klapa i zespolenia typu end-to-end przesuwają łopatkę skóry bardziej na boki, a tym samym ułatwiają monitorowanie odporności w pozycji stojącej zwierzęcia. Identyfikacja tętnicy łydkowej i stref maksymalnej perfuzji za pomocą angiografii laserowej w bliskiej p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Piła szablasta
Urządzenie do sprzęgania naczyniowego	Synovis, Newtown PA	21003B