Artykuł metodologiczny

Protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii

DOI:

10.3791/50480

⸱

28 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgical Oncology, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, 2Department of Chemistry, Rice University , 3Mechanical Engineering and Materials Science, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokoły używane do badania oddziaływań pól elektrycznych o częstotliwości radiowej (RF) 13,56 MHz z koloidami nanocząstek złota zarówno w systemach niebiologicznych, jak i biologicznych (in vitro/vivo). Interakcje te są badane pod kątem zastosowań w terapii nowotworów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie przeciwnowotworowe, które są mniej toksyczne i inwazyjne niż ich obecne odpowiedniki, są wysoce pożądane. Wykorzystanie pól elektrycznych RF, które wnikają głęboko w organizm, powodując minimalną toksyczność, jest obecnie badane jako realny sposób nieinwazyjnej terapii raka. Przewiduje się, że interakcje energii RF z uwewnętrznionymi nanocząstkami (NP) mogą uwalniać ciepło, które może następnie spowodować przegrzanie (hipertermię) komórki, ostatecznie kończąc się martwicą komórki.

W przypadku systemów niebiologicznych przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące ilościowego oznaczania ciepła uwalnianego przez wysoko skoncentrowane koloidy NP. W przypadku systemów biologicznych, w przypadku eksperymentów in vitro, opisujemy techniki i warunki, których należy przestrzegać, aby skutecznie wystawić komórki rakowe na działanie energii RF bez artefaktów ogrzewania mediów masowych znacznie zasłaniających dane. Na koniec podajemy szczegółową metodologię dla mysich modeli in vivo z ektopowymi guzami raka wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Absorpcja energii RF przez tkankę biologiczną (ze względu na ich naturalną przenikalność elektryczną) powoduje wzrost temperatury tkanek w funkcji czasu, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki przez hipertermię. Przypuszcza się, że hipertermia nowotworowa może być zoptymalizowana poprzez zastosowanie ukierunkowanych nanomateriałów, które internalizują się w komórce rakowej i działają jak przetworniki termiczne RF, pozostawiając sąsiednie zdrowe, normalne komórki nienaruszone. Kilka doniesień wykazało już, że różne NP mogą działać jako skuteczne źródła ciepła RF, które pomagają w martwicy raka1-4.

Pod tym względem, nanocząsteczki złota (AuNPs)3-5, nanorurki węglowe1 i kropki kwantowe6, 7 wykazały ekscytujące cechy, gdy były używane zarówno w eksperymentach RF in vitro, jak i in vivo. Chociaż dokładna natura mechanizmu nagrzewania tych nanocząsteczek pod wpływem pola RF jest nadal przedmiotem dyskusji, seria fundamentalnych eksperymentów z wykorzystaniem AuNP położyła ogromne znaczenie zarówno na wielkość NP, jak i stany agregacji. Wykazano, że tylko AuNP o średnicach <10 nm nagrzewają się pod wpływem pola RF8. Ponadto ten mechanizm grzewczy jest znacznie osłabiony, gdy AuNP są agregowane. Ten warunek agregacji został również zweryfikowany w modelach in vitro, w których położono nacisk na optymalizację stabilności koloidalnej AuNP w wewnątrzkomórkowych przedziałach endolizomalnych w celu zapewnienia skutecznej terapii RF4. Jednak techniki i zasady eksperymentalne stosowane do zbierania i oceny tych danych mogą być problematyczne, zwłaszcza w przypadku walidacji profili cieplnych RF z koloidów NP.

Kilka raportów wykazało, że głównym źródłem produkcji ciepła RF może być ogrzewanie dżulem zawiesiny jonowej tła, w której zawieszone są nanocząsteczki, a nie sameNP-y 9-12. Chociaż nasz niedawny artykuł8 potwierdził wykorzystanie oddziaływań RF do generowania ciepła z AuNP o średnicach mniejszych niż 10 nm, naszym celem jest bardziej szczegółowe opisanie tych protokołów w tym artykule.

Pokazujemy również protokoły i techniki potrzebne do oceny skuteczności AuNPs jako hipertermicznych czynników termicznych zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo dla modeli raka wątroby. Chociaż skupiamy się przede wszystkim na prostych koloidach AuNP zwieńczonych cytrynianem, te same techniki można zastosować do innych hybryd AuNP, takich jak kompleksy sprzężone z przeciwciałami i chemioterapią. Miejmy nadzieję, że stosując się do tych zasad, eksperymentatorzy powinni być w stanie szybko ocenić potencjał dowolnego nanomateriału jako skutecznego czynnika hipertermicznego indukowanego przez fale radiowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełny przegląd eksperymentu jest przedstawiony na rysunku 1.

Dalsze szczegóły są przedstawione w krokach 1-3 poniżej.

1. Ocena ogrzewania RF koloidów NP: AuNPs jako przykład

  1. Ogólnie rzecz biorąc, dla każdej badanej próbki NP należy najpierw kilkakrotnie przepłukać próbkę przez filtr wirówkowy wodą dejonizowaną (DI) w celu usunięcia jonów tła i zanieczyszczeń. Wszystkie jony i zanieczyszczenia zostaną usunięte z zawiesiny AuNP, gdy wypłukiwana ciecz ma podobną szybkość nagrzewania RF (HR) jak woda DI. Ten proces oczyszczania pozwala również na uzyskanie wyższych stężeń nanocząsteczek. Warto zauważyć, że chociaż w tym przykładzie użyto AuNP, podstawowe zasady można zastosować do innych materiałów NP.
  2. Na przykład należy oczyścić butelkę o pojemności 500 ml dostępnych w handlu AuNP o średnicy 5 nm, a następnie poddać je działaniu pola RF o natężeniu pola elektrycznego 13,56 MHz o natężeniu pola elektrycznego 90 kV/m.
    1. Pobrać ~125 ml z podstawowego roztworu AuNP i podzielić na sześć probówek filtracyjnych wirówki o masie 50 kDa. Wirować przy 3 000 obr./min. przez 2 min 5 sek. Usuń przefiltrowany bufor i napełnij filtry większą ilością roztworu podstawowego. Powtarzać, aż wszystkie 500 ml zostanie przefiltrowane.
    2. Zastąp przefiltrowany bufor podobną objętością wody DI i powtórz około 8 razy (lub do momentu, gdy przefiltrowany bufor RF HRs będzie równoważny wodzie DI). Uwaga, analiza UV-Vis może być również wykorzystywana do monitorowania pików absorpcji zanieczyszczeń. Po całkowitym usunięciu zanieczyszczeń buforowych należy odpipetować około 0,5 ml wody DI do każdego filtra i ponownie zawiesić AuNPs przez wielokrotne pipetowanie. Powinno to całkowicie usunąć AuNPs z filtra i umożliwić pełne zawieszenie. Połączyć wszystkie sześć zawiesin w jednej tubce Eppendorf o pojemności 15 ml.
    3. Po oczyszczeniu i zagęszczeniu AuNP należy przeanalizować próbkę przy użyciu ICP-OES i/lub ICP-MS, UV-vis i potencjału Zeta, aby uzyskać dane dotyczące odpowiednio stężenia i stabilności NP. Analiza SEM i/lub TEM może być również wykorzystana do uzyskania danych morfologicznych. Szczegółowe przygotowanie próbek do tych technik można znaleźć w literaturze4.
  3. Korzystając z systemu Kanzius RF opisanego w poprzednich badaniach8 lub pochodnych tego systemu, umieść cylindryczną kuwetę kwarcową o pojemności 1,3 ml tak, aby pole elektryczne RF w powietrzu (bez obecnej próbki) wynosiło ~90 kV/m wewnątrz kuwety. Dla standardowej próbki soli fizjologicznej (0,9 % NaCl) pole elektryczne zostałoby zredukowane do ~1,1 kV/m. Są to przybliżone warunki stosowane w celu umożliwienia porównań między różnymi systemami.
    1. Odpipetować 1,3 ml próbki oczyszczonego koloidu AuNP o stężeniu 1 000 mg/l do kuwety kwarcowej i wprowadzić ją do pola RF. Można to zrobić za pomocą specjalnie zbudowanego teflonowego uchwytu na próbki. Wystaw próbkę na działanie pola RF przez okres 120 sekund lub do momentu, gdy próbka osiągnie temperaturę 70 °C, aby zapobiec wyładowaniom elektrycznym lub szybkiemu wrzeniu. Przechwytuj dane termowizyjne (a także obszary kontrolne) za pomocą kamery na podczerwień i powiązanego oprogramowania. Powtórz tę procedurę trzy razy.
    2. Przefiltrować próbkę przez kolejny filtr wirówkowy o sile 50 kDa w celu ekstrakcji AuNPs z buforu wodnego DI. Ponownie wystaw bufor na działanie pola RF, ponownie trzy razy. Różnica w HR między koloidem AuNP a buforem wodnym DI w tle określa HR ze względu na same AuNPs. Spodziewaj się uzyskania HR na poziomie ~0,3 °C/s i 0,05 °C/s, aby uzyskać HR zależne od AuNP na poziomie ~ 0,25 °C/s. Zawiesić pozostałe AuNP z filtra w 1,3 ml wody do eksperymentów in vitro/vivo.

2. Hipertermia indukowana RF wspomagana nanocząstkami: badania in vitro

  1. Te badania in vitro można zastosować do dowolnego typu komórek rakowych, które tworzą monowarstwy 2D. W tym eksperymencie wykorzystaj ludzkie komórki Hep3B pochodzące z raka wątrobowokomórkowego.
    1. Płytka ~ 50 000 komórek w trzech przednich dołkach 12-dołkowej płytki z 1 ml pożywki wzrostowej. Powtórz to 6 razy (użyć trzech płytek do badań NP i trzech płytek jako kontroli). Inkubować w temperaturze 37,5 °C przez 24 godziny przed wprowadzeniem nanocząsteczek. Najpierw wysterylizować nanocząsteczki za pomocą komory bezpieczeństwa biologicznego naświetlonej promieniami UV przez 5 minut.
    2. Do każdej studzienki wprowadzić 0,1 ml roztworu AuNP o stężeniu 1000 mg/l i pozostawić na kolejne 24 godziny. Dodać 0,1 ml wody do każdej studzienki z trzech płytek komory kontrolnej i również pozostawić na 24 godziny.
    3. Po upływie 24 godzin odessać pożywkę komórkową i przemyć PBS, aby usunąć wszelkie powierzchniowo związane AuNPs. Wymień nośnik komórkowy. Ogniwa są teraz gotowe do ekspozycji na fale radiowe.
  2. Umieść każdy pakiet 12-dołkowych komórek w polu RF. Poczekaj, aż ogniwa ostygną do 31 °C. Włącz generator RF i wystaw na 3,5 minuty. Ostateczna temperatura nośnika komórkowego wyniesie ~37 °C. Wyłącz pole RF. Usuń komórki i umieść je w inkubatorze na 24 godziny przed analizą.
    1. Usuń komórki z inkubatora i odessaj pożywkę komórkową. Dodać 1,6 ml pożywki komórkowej do każdej studzienki, a także 0,4 ml odczynnika MTT. Inkubować komórki przez 4 godziny. Odessać pożywkę i zastąpić 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Umieść płytki komórkowe na kołysce stołowej i pozostaw na 10 minut, aby DMSO mogło rozpuścić odczynniki MTT. Na koniec należy odpipetować 100 μl każdego dołka do płytki 96-dołkowej i optycznie odczytać dołek przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek, takiego jak czytnik płytek SPECTROstar Nano.

3. Hipertermia indukowana RF wspomagana nanocząstkami: badania in vivo

  1. Te badania in vivo można zastosować do każdego rodzaju nowotworu, który tworzy guzy lite w ortotopowym lub ektopowym modelu mysim. W tym eksperymencie wykorzystano komórki raka wątroby Hep3B w ektopowym modelu myszy BALB-C Nade.
  2. Uwaga: wszystkie eksperymenty in vivo są przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Ponadto, demonstrowany protokół został przeprowadzony pod kierunkiem i zgodą University of Texas M.D. Anderson Cancer Centers Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
    1. Hodować odpowiednią liczbę komórek (~100 k) w kolbie do hodowli tkankowej z odpowiednią pożywką wzrostową. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez cały czas hodowli komórkowej.
    2. Potraktować komórki trypsyną (w celu odłączenia od kolby) i wytworzyć roztwór 2 milionów komórek na każde 25 μl. Dodać równą ilość Matrigelu (na lodzie) i dokładnie wymieszać, aby przygotować ostateczny roztwór do wstrzykiwań. Wstrzyknij ten roztwór w żądane miejsce na grzbiecie myszy i odczekaj odpowiednią ilość czasu, aż guzy urosną do pożądanych rozmiarów (2-4 tygodnie w przypadku większości komórek). Przed ekspozycją na fale radiowe myszy BALB-C Nude powinny mieć lite guzy ektopowe o średnicy 0,5-1 cm.
    1. Przygotuj myszy do użycia (w tym przypadku myszy BALB-C Nado), znieczulając je roztworem ketaminy i ksylazyny przez wstrzyknięcie IP. Podczas gdy myszy zasypiają, trzymaj je w komorze o kontrolowanej temperaturze 37 °C. W sumie potrzebnych będzie 20 myszy, wszystkie z guzami podobnej wielkości. Dziesięć myszy zostanie użytych w połączeniu z AuNP i bez nich (te ostatnie to tylko zastrzyki PBS), podczas gdy pozostałe 10 myszy zostanie podzielonych na kontrole narażone na RF i nienarażone na RF: obie grupy bez zastrzyków AuNP.
    2. Po odpowiednim znieczuleniu wstrzyknąć AuNPs bezpośrednio do guza za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3 z igłą 27 G. Roztwór AuNP powinien mieć stężenie Au 200 mg/l w 0,1 ml PBS. Po wstrzyknięciu należy użyć wacika chirurgicznego, aby wchłonąć krew i przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem.
    3. Następnie zamontuj mysz, która ma być leczona, na głowicy odbiorczej generatora RF. Mysz musi być ustawiona tak, aby guz znajdował się najbliżej głowy transmisyjnej. Osłoń obszary, które nie mają być leczone, a także wrażliwe obszary, takie jak oczy, uszy i palce u stóp, taśmą miedzianą. Upewnij się, że taśma miedziana prawidłowo styka się z płaszczyzną uziemienia, aby nie doszło do gromadzenia się ładunku. Ponadto obszar ekspozycji musi mieć odstęp co najmniej 1 cm większy niż rozmiar pożądanego miejsca zabiegowego.
    4. Ustaw kamerę termowizyjną na podczerwień tak, aby guz i obszar leczenia były widoczne. Włącz RF na 5 minut. Zapisz wynikową krzywą temperatury. Jeśli terapia osiągnie temperaturę wyższą niż 42 °C, należy natychmiast przerwać leczenie.
    1. Po ekspozycji na fale radiowe odzyskaj myszy ze znieczulenia w ciepłej komorze, aż odzyskają przytomność.
    2. Powtórz eksperyment z tymi samymi myszami 48 godzin później (kroki 3.3.1 - 3.4.1).
    3. Po eksperymencie poddać myszy eutanazji zgodnie z instytucjonalnymi protokołami i procedurami. Zapisz wagę guza. Do analizy histologicznej unieruchomić guzy za pomocą formaliny i zanurzyć je w parafinie. Skrawki guza są zwykle barwione hematoksyliną i eozyną oraz dla celów istotnych dla oceny skuteczności terapeutycznej, np. Ki-67, rozszczepiona kaspaza-3 itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ocena ogrzewania RF koloidów NP: AuNPs jako przykład.

Po wykonaniu sekcji 1.1 - 1.2.3 spodziewaj się wysoce skoncentrowanego, stabilnego i oczyszczonego roztworu AuNPs o średnicy 5 nm i 10 nm. Z zakupionego roztworu podstawowego o objętości 500 ml należy spodziewać się uzyskania co najmniej 4 ml roztworu o stężeniu 1 000 mg/l. Różnica w HR między AuNPs a roztworem buforowym wody DI w tle przy tym stężeniu powinna wynosić ~0,25 °C/s i 0,1 °C/s odpowiednio dla AuNP 5 nm i 10 nm, jak pokazano na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły te pozwalają eksperymentatorowi w pełni przeanalizować stopień, w jakim nanomateriały (w tym przypadku AuNPs) mogą zwiększać hipertermię wywołaną przez RF w leczeniu raka. Pierwszy protokół dotyczy w szczególności analizy produkcji ciepła z wysoko skoncentrowanych i oczyszczonych próbek AuNP. Chociaż inne grupy zgłaszały produkcję ciepła głównie z, w których zawieszone są AuNP, a nie z samych AuNP9-11, ich systemy RF wykorzystywały niższe stężenia AuNP o średnicach >10 nm, a także niższe moce robocze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez NIH (U54CA143837), NIH M.D. Anderson Cancer Center Support Grants (CA016672), V Foundation (SAC) oraz nieograniczony grant badawczy od Kanzius Research Foundation (SAC, Erie, PA). Dziękujemy Kristine Ash z Oddziału Chirurgii Onkologicznej M.D. Anderson Cancer Center za pomoc administracyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik/Materiał
500 ml nanocząsteczek złota (5 nm)Ted Pella, INC15702-5
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4/-15 (50 kDa)MiliporyUFC805024/UFC910096(objętości 4 ml i 15 ml)
MEM X1 Pożywka do hodowli komórkowychCellgro10-101-CV(w razie potrzeby dodaj dodatkowe składniki odżywcze)
Bydło płodowe SerumSigmaF4135-500 ml
Taśma miedzianaTed Pella16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Kamera na podczerwieńFLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)Skontaktuj się z FLIR
1.3 ml Kuweta kwarcowaThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflonowy uchwyt na próbkę ze stolikiem obrotowymThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Czytnik mikropłytekBGM Labtech
Spektrometr UV-VisApplied Nanofluorescence, Houston, TX)NS1 NanoSpectralyzer
ICP-– SPerkinElmerOptima 4300 DV
ZetasizerMalvernZen 3600 Zetasizer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gannon, C. J., et al. Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field. Cancer. 110, 2654(2007).
  2. Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles. J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313(2008).
  3. Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells. Journal of Nanobiotechnology. 6, 2(2008).
  4. Raoof, M., et al. Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy. Nanomedicine. 8, 1096(2012).
  5. Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles. Surgery. 148, 319(2010).
  6. Glazer, E. S., Curley, S. A. Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles. Cancer. 116, 3285(2010).
  7. Glazer, E. S., Curley, S. A. Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes. Therapeutic Delivery. 2, 1325(2011).
  8. Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field. J. Phys. Chem. C. 116, 24380(2012).
  9. Kruse, D. E., et al. A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10(2011).
  10. Li, D., et al. Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles. J. Colloid Interf. Sci. 358, 47(2011).
  11. Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies. Nanoscale. , (2012).
  12. Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study. J. Phys. D App. Phys. 45, 075303(2012).
  13. Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays. Nano Lett. 6, 1261(2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Toksyczno in vitromodel mysi in vivoekspozycja na kwarcoczyszczanie za pomoc filtr w wir wkowychanaliza UV Vispomiar potencja u zetapodczerwona obrazowanie termiczne

Powiązane artykuły