Artykuł metodologiczny

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/50485

⸱

5 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Centre for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University Rostock, 2Institute for Experimental Surgery, University of Rostock

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego

obwodowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W erze wewnątrznaczyniowych protokołów aplikacji komórek w kontekście regeneracyjnej terapii komórkowej, mechanizmy leżące u podstaw migracji komórek macierzystych do tkanek nieszpikowych nie zostały całkowicie wyjaśnione. Opisano tutaj technikę mikroskopii przyżyciowej zastosowaną do mysiego mikrokrążenia cremaster do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego in vivo. Mikroskopia przyżyciowa M. cremaster została wcześniej wprowadzona w dziedzinie badań zapalnych do bezpośredniej obserwacji interakcji leukocytów ze śródbłonkiem naczyniowym. Ponieważ wystarczająca migracja obwodowych komórek macierzystych i progenitorowych obejmuje podobne początkowe etapy zwijania się i mocnego przylegania do wyściółki śródbłonka, możliwe jest zastosowanie modelu M. cremaster do obserwacji i kwantyfikacji interakcji komórek macierzystych podawanych donaczyniowo ze śródbłonkiem. Ponieważ różne składniki chemiczne mogą być selektywnie nakładane na tkankę docelową za pomocą prostych technik superfuzji, możliwe jest ustalenie niezbędnych warunków mikrośrodowiskowych, aby początkowa rekrutacja komórek macierzystych mogła zajść w żywym organizmie poza szpikiem kostnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem niniejszego artykułu jest opisanie techniki mikroskopii przyżyciowej (IVM) zastosowanej na mysim mikrokrążeniu cremaster do bezpośredniej obserwacji i analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Obecna koncepcja regeneracji tkanek i narządów opartych na komórkach macierzystych polega na kierowaniu komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego do uszkodzonej tkanki1. Kluczowym krokiem do udanej migracji komórek macierzystych jest interakcja komórek macierzystych z miejscowym śródbłonkiem w uszkodzonym narządzie, a następnie migracja przezśródbłonkowa i ostatecznie wszczepienie narządu2. Analiza przyżyciowa tych interakcji komórka macierzysta - komórki śródbłonka stanowi idealny parametr do ilościowego określenia odpowiedzi regeneracyjnej opartej na komórkach macierzystych w różnych warunkach patofizjologicznych in vivo. Co więcej, wydaje się możliwe, że w przyszłości analiza śródżyciowa zdolności migracyjnych określonych populacji komórek macierzystych w standaryzowanych środowiskach mikrokrążenia może zostać zastosowana przed przejściem tych populacji do dalszych badań klinicznych.

Mikroskopia przyżyciowe została początkowo opracowana do obserwacji i ilościowego oznaczania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka in vivo w dziedzinie badań nad stanami zapalnymi3. Pierwsze udane zapisy badań mikroskopowych przyżyciowych zostały odnotowane przez Cohnheima już w XIX wieku, badając języki i krezki żab pod mikroskopem świetlnym4. Od czasu pierwszego zastosowania IVM przeszedł ogromny rozwój techniczny i obecnie pewne niezbędne komponenty stanowią warunki wstępne do wykonywania ilościowego IVM: (i) preparaty tkankowe, które umożliwiają dostęp optyczny, (ii) sondy molekularne, które mogą być wykryte przez mikroskop, (iii) mikroskop podłączony do systemu detekcji oraz (iv) komputerowe systemy analizy, które mogą wyodrębnić interesujące parametry z zestawu danych obrazu4.

Do badań IVM wprowadzono różnorodne preparaty tkankowe, w tym krezki i wątrobę myszy i szczura5, grzbietowe komory fałdów skórnych myszy 6 i chomika, ucho królika i woreczek policzkowy chomika, by wymienić tylko kilka.

Jednak w dalszej części skupimy się na mięśniu cremaster myszy, stanowiącym idealną tkankę do obserwacji przyżyciowych, ponieważ przygotowanie i wizualizacja są możliwe dzięki dobrze ustandaryzowanej procedurze chirurgicznej i generalnie nie występują problemy z artefaktami ruchu. Otwarte przygotowanie mięśni cremaster zostało przeprowadzone po raz pierwszy w latach siedemdziesiątych XX wieku przez Baeza i współpracowników 7. Pierwotnie opisany dla szczurów, został z powodzeniem zaadoptowany również u myszy8. Po tym, jak poprzednie badania koncentrowały się głównie na interakcjach leukocytów ze ścianą naczynia, nasza własna grupa wprowadziła niedawno preparat mięśniowy cremaster myszy jako cenne narzędzie do bezpośredniej wizualizacji i analizy ilościowej interakcji komórka macierzysta-śródbłonek w określonym mikrośrodowisku9. Za pomocą tego modelu badano różne subpopulacje komórek macierzystych, w tym mysie komórki macierzyste szpiku kostnego c-kit + i mezenchymalne komórki macierzyste, a także ludzkie komórki macierzyste szpiku kostnego CD 133 + 10-12. Po wyizolowaniu komórek ze szpiku kostnego dawcy i znakowaniu fluorescencyjnym w celu wizualizacji, komórki macierzyste są selektywnie wprowadzane do mikrokrążenia cremaster za pomocą iniekcji tętniczej przez tętnicę udową, unikając w ten sposób uwięzienia komórek w odległych narządach. Co więcej, model mięśniowy cremaster jest szczególnie użyteczny, ponieważ różne chemokiny potencjalnie pośredniczące w lokalnej migracji komórek macierzystych w odpowiednich ustawieniach, mogą być miejscowo stosowane do tkanki docelowej za pomocą prostej techniki superfuzji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cały protokół po izolacji komórek trwa około 2 godzin.

1. Przygotowanie mikrochirurgiczne

  1. Przeprowadzić izolację komórek macierzystych ze szpiku kostnego dawcy i znakowanie fluorescencyjne izolowanej subpopulacji zgodnie ze znormalizowanymi protokołami9,12 Pozwól komórkom odpocząć w czasie wykonywania operacji na zwierzęciu. Do znakowania fluorescencyjnego polecamy CFDA (ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny).
  2. Znieczulić samca myszy o wadze 20-25 g ketaminą (75 mg/kg) i ksylazyną (2,5 mg/kg). Przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych znieczulenie powinno być utrzymywane przez suplementy (10% początkowego wstrzyknięcia, i.p.) w razie potrzeby (zwykle co 30-60 minut).
  3. Delikatnie ogol przednią część prawej moszny, a także prawe udo i pachwiny. Zbierz wszystkie wypadające włosy za pomocą zwilżonego bawełnianego wacika. Umieść mysz brzuszną stroną do góry na scenie z pleksiglasu i przymocuj stopy za pomocą elastycznej zasłony. Stolik jest wykonany na zamówienie, składa się z płyty podstawy i drugiej płyty na ogonowej krawędzi płyty podstawy do uniesienia obu nóg i moszny. Umieść stolik na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Po utrwaleniu na stoliku umieść zwierzę pod mikroskopem operacyjnym i wykonaj następujące czynności operacyjne przy użyciu 10- do 16-krotnego powiększenia.
  4. Wykonaj początkowe nacięcie za pomocą nożyczek do skóry na prawym udzie, tuż przed naczyniami udowymi od kolana do pachwiny.
  5. Zidentyfikuj tętnicę udową i podążaj za nią proksymalnie, mobilizując tętnicę z otaczających tkanek miękkich. Zidentyfikuj i odetnij dużą gałąź do lewego jądra za pomocą termokoagulacji. Następnie założyć szew podtrzymujący powierzchownie na lewym jądrze. Delikatna trakcja ułatwi dalszą proksymalną mobilizację tętnicy udowej.
  6. Po zakończeniu mobilizacji proksymalnej zidentyfikuj i odetnij dużą gałąź biegnącą przyśrodkowo przy udzie za pomocą termokoagulacji. Następnie podwiązać tętnicę udową w dystalnej części prawego uda. Delikatna przyczepność na ligaturze pomoże w dalszym przygotowaniu.
  7. Zwróć teraz ponownie uwagę na bliższą tętnicę udową i umieść szew wokół tętnicy tak proksymalnie, jak to możliwe. Przygotuj węzeł, ale jeszcze go nie wiąż. Zastosuj delikatną trakcję do szwu i stwórz załamanie tętnicy.
  8. Po ustaleniu załamania ostrożnie naciąć tętnicę za pomocą mikronożyczek. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić żyły udowej.
  9. Wprowadzić przygotowany mikrocewnik (średnica wewnętrzna 0,28 mm) przez nacięcie. Przed włożeniem cewnika należy odwietrzyć (0,9% chlorku sodu, NaCl) i podłączyć do strzykawki o pojemności 1 ml.
  10. Po pomyślnym wprowadzeniu cewnika ostrożnie poluzuj załamanie, aby ułatwić przejście cewnika. Przepływ krwi tętniczej powinien być natychmiast widoczny w cewniku. Delikatnie przesuń cewnik o kilka milimetrów poza poprzednie zagięcie. Następnie zwiąż przygotowaną ligaturę w celu zamocowania cewnika.
  11. Delikatnie przepłucz cewnik (0,9% NaCl) i odessać, aby potwierdzić prawidłowe położenie. Użyj kawałka taśmy, aby dodatkowo przymocować cewnik do etapu operacji.
  12. Po odpowiednim ustabilizowaniu należy odłożyć cewnik na bok na kolejne etapy przygotowania mięśnia cremaster. Stosuj regularne płukanie i aspirację cewnika co 5-10 minut, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.
  13. Zwróć teraz uwagę na prawą mosznę i wykonaj nacięcie, przecinając skórę i powięź powyżej brzusznej części prawej moszny. Uważaj, aby nie dotykać leżącej pod spodem tkanki żadnymi narzędziami.
  14. Przedłuż nacięcie aż do fałdu pachwinowego i doogonowo do dystalnego końca moszny.
  15. Ostrożnie oddziel leżącą pod spodem tkankę miękką i łączną nad workiem cremaster, nie dotykając jej. Zidentyfikuj dystalny koniec cremastera i umieść tutaj szew podtrzymujący, aby nieznacznie rozciągnąć mięsień. Wytnij teraz pozostałą tkankę miękką pod workiem mięśniowym, delikatnie pociągając mięsień doogonowo i do przodu.
  16. Po całkowitym oddzieleniu od tkanki łącznej otwórz worek cremaster w jednym punkcie na krawędzi czaszki za pomocą nożyczek. Przedłuż nacięcie od tego otworu w dół do dystalnego końca mięśnia.
  17. Uszczelnij małe naczynie łączące jądro i cremaster za pomocą termokoagulacji, a następnie przetnij pozostałe połączenia między mięśniem a jądrem za pomocą nożyczek.
  18. Odłóż jądro na bok, poza pole mikroskopii.
  19. Otwarty cremaster leży teraz płasko na scenie. Umieść cztery szwy 6-0 Prolene Stay na krawędziach tkanki i przymocuj je elastyczną serwetą, aby rozprowadzić tkankę mięśniową cremaster. Od tej pory należy stale nawilżać tkankę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ryc. 1).
  20. Odstaw teraz preparat na odpoczynek przez 15 minut. Następnie wstrzyknąć 0,05-0,1 ml 1% rodaminy-dekstranu przez lewą tętnicę udową w celu kontrastowego wzmocnienia mikrokrążenia. Jeśli planowane jest zastosowanie jakichkolwiek chemokin lub środków zapalnych, należy teraz miejscowo zwilżyć mięsień odpowiednim odczynnikiem za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. W przypadku eksperymentu kontrolnego kontynuuj nawilżanie PBS.

2. Mikroskopia przyżyciowa

  1. Trzymaj mysz nieruchomo na stoliku operacyjnym i poruszaj się pod mikroskopem fluorescencyjnym zmodyfikowanym do epi-oświetlenia i podłączonym do kamery wideo CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem). Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zwichnąć cewnika do tętnicy udowej.
  2. Przeprowadzaj eksperymenty z użyciem obiektywu do zanurzenia w wodzie.
  3. Po dostosowaniu obiektywu w celu odpowiedniej wizualizacji mikrokrążenia cremaster, a przed wstrzyknięciem komórek, stochastycznie zdefiniuj sześć żyłek zakapilarowych w celu późniejszej analizy mocnego przylegania komórek macierzystych.
  4. Podawać znakowane fluorescencyjnie komórki macierzyste, rozpuszczone w 200 μl PBS, w dawce 0,4 x 106 komórek na wstrzyknięcie, w sumie pięć kolejnych wstrzyknięć z wykorzystaniem cewnika do tętnicy udowej i strzykawki o pojemności 1 ml. Ostrożnie wstrząsnąć próbką komórek przed pierwszym wstrzyknięciem.
  5. Rejestruj zwijanie się komórek macierzystych natychmiast po wstrzyknięciu komórki, definiując w ten sposób "toczenie" jako ponad 50% zmniejszenie prędkości komórek wzdłuż wyściółki śródbłonka w połączeniu z typowymi ruchami komórkowymi typu "przyklej i uwolnij". Wykonaj liczenie toczących się komórek macierzystych i wszystkich komórek macierzystych przechodzących przez określoną odległość komorową w ciągu 1 minuty obserwacji po każdym wstrzyknięciu. Ilość zwijających się komórek macierzystych jest wyrażona jako procent wszystkich przechodzących komórek. Nie należy liczyć komórek wykazujących losowe, krótkie zjawiska wiązania jako komórek toczących się.
  6. Po ostatnim wstrzyknięciu komórki należy określić liczbę mocno przylegających komórek macierzystych przez liczenie i wyrazić ilość w stosunku do obliczonej powierzchni śródbłonka sześciu wstępnie zdefiniowanych żyłek (średnica x długość x π ) jako przylegające komórki/mm2 . Mocna adhezja jest brana pod uwagę, gdy przez 30 sekund nie jest wykrywany żaden ruch komórek.
  7. Po zakończeniu mikroskopii przyżyciowej ostrożnie usuń mięsień cremaster i przechowuj go w korespondencji do późniejszej analizy (immunohistochemia lub biologia molekularna). Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Analiza zapisów z mikroskopii przyżyciowej w celu ilościowego określenia rolowania komórek macierzystych i twardej adhezji śródbłonka, a także hemodynamiki mikronaczyniowej, takiej jak prędkość krwinek czerwonych (mm/s), długość naczynia (μm), średnica naczynia (μm), wskaźnik udziału ścian (sec-1); powinny być wykonywane w trybie offline przez badacza nieznanego z odpowiedniego eksperymentalnego leczenia tkankowego przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie, interakcja bezpośrednio wstrzykniętych komórek macierzystych lub progenitorowych ze śródbłonkiem naczyniowym w mikrokrążeniu mięśnia cremaster jest rzadkim zjawiskiem i występuje wyłącznie w żyłkach pozakapilarnych (średnica: 30-80 μm). Ze względu na znakowanie fluorescencyjne, toczące się i mocno przylegające komórki macierzyste można wyraźnie określić ilościowo w oddzieleniu od krążących endogennych leukocytów w obserwowanych żyłkach (ryc. 2).

Warunki mikrokrążenia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna pozwala na bezpośrednią wizualizację i analizę ilościową oddziaływań komórka-śródbłonek. Model mięśni cremaster jest szczególnie przydatny, ponieważ ekspozycja mikrochirurgiczna i techniki wizualizacji przyżyciowej zostały dobrze ugruntowane podczas badań nad interakcjami leukocyty-śródbłonek, a różne składniki chemiczne mogą być selektywnie stosowane do tkanki docelowej za pomocą prostej techniki superfuzji. Ze względu na brak artefaktów ruchowych i silne zakłócenia obrazu, ten k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach, przeprowadzone na potrzeby tego manuskryptu, zostały zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dioctan karboksy-fluoresceiny sukcynimidyloester (CFDA)Invitrogen, Carlsbad, CA, USAC1157
Rodamina 6 G (1%)Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy83697
Ketamin (Ketanest)Pfizer, Berlin, Niemcyniedostępne
Xylacin (Rompun)Bayer, Leverkusen, Niemcyniedostępne
Dulbecco's Phosphate - buforowana sól fizjologiczna (PBS)PAN Biotech, Aidenbach, NiemcyP04-36500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
  2. Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home? Blood. 106, 1901-1910 (2005).
  3. Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
  4. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  5. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
  6. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  7. Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
  8. Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874(2011).
  9. Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
  10. Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
  11. Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
  12. Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzia ywanie kom rek r db onkacewnik t tnicy udowejmikroskopia fluorescencyjnakom rki macierzyste szpiku kostnegoleczenie chemokinamianaliza mikrokr eniaadhezja kom rek macierzystych

Powiązane artykuły