Artykuł metodologiczny

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

DOI:

10.3791/50487

⸱

16 września 2013

 ,  , 
1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki neuroprogenitorowe (NPC) wyizolowane z ludzkiego mózgu płodu zostały namnażone w warunkach proliferacyjnych w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), aby zapewnić obfite zaopatrzenie komórek. NPC różnicowano w obecności nowej kombinacji czynnika wzrostu nerwów (NGF), neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF), dibutyrylu cAMP (DBC) i kwasu retinowego na naczyniach pokrytych poli-L-lizyną i mysią lamininą w celu uzyskania kultur bogatych w neurony. NPC różnicowano również pod względem braku neurotrofin, DBC i kwasu retinowego oraz w obecności rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF), aby uzyskać kultury bogate w astrocyty. Zróżnicowane NPC charakteryzowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla panelu markerów neuronalnych, w tym NeuN, synapsyny, acetylocholinoesterazy, synaptofizyny i GAP43. Kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i markery astrocytów STAT3 wykryto u 10-15% zróżnicowanych NPC. Aby ułatwić charakterystykę molekularną specyficzną dla typu komórki, przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego w celu wyizolowania neuronów hodowanych na szkiełkach membranowych z naftalanu etylenu (PEN). Metody opisane w tym badaniu dostarczają cennych narzędzi do pogłębienia naszej wiedzy na temat molekularnego mechanizmu neurodegeneracji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że neurogeneza trwająca całe życie występuje w strefie podkomorowej komór bocznych oraz w warstwie podziarnistej zakrętu zębatego mózgu dorosłego ssaka 1. Komórki neuroprogenitorowe (NPC), które pochodzą z tych regionów, są komórkami multipotencjalnymi, które mogą różnicować się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty 2. NPC wzbudziły zainteresowanie ze względu na ich potencjał do przeszczepiania pacjentom z różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona, stwardnieniem zanikowym bocznym, udarem mózgu i chorobą Alzheimera (AD) 3. Badania z udziałem NPC koncentrowały się na tym kącie przeszczepu, ale potencjał neuronów pochodzących z NPC jako modelu hodowli komórkowej w celu określenia mechanizmu neurodegeneracji nie został w pełni wykorzystany. Wcześniejsze badania na ogół wykorzystywały neurony postmitotyczne wyizolowane z tkanek mózgowych gryzoni, które muszą być izolowane w każdym eksperymencie, ponieważ nie odnawiają się samoczynnie. Chociaż ludzkie linie komórkowe nerwiaka zarodkowego, w tym komórki SH-SY5Y i SK-N-MC, mogą być rozszerzane, nie mają one cech neuronów pierwotnych. Z drugiej strony ludzcy NPC oferują obie zalety, ponieważ można je rozszerzać na wiele przejść i różnicować w celu wygenerowania populacji komórek o cechach neuronów pierwotnych 4,5. W obecnym badaniu opisujemy nowy protokół różnicowania w celu uzyskania spójnej, bogatej w neurony populacji z dostępnych na rynku NPC wyizolowanych z ludzkiego mózgu płodu. Ponieważ kultury te zawierają niewielki procent komórek glejowych, potrzebujemy dodatkowych metod, aby wyizolować czystą populację neuronów w celu charakterystyki molekularnej. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) jest nową techniką, dzięki której jednorodna populacja komórek z wycinka tkanki może być selektywnie wychwytywana w celu analizy ekspresji genów 6. Mózg jest niejednorodną tkanką składającą się z neuronów, gleju i innych typów komórek. LCM wykorzystano do określenia analiz ekspresji genów specyficznych dla neuronów 7-10. Wcześniej przeprowadziliśmy LCM neuronów hipokampa z odcinków mózgu myszy AD (Tg2576), aby wykazać zmniejszoną ekspresję cyklicznego białka wiążącego element odpowiedzi AMP (CREB) i BDNF, szczególnie w neuronach hipokampa 11. W niniejszym badaniu opisano procedury ekspansji ludzkich NPC, różnicowania neuronów, barwienia immunofluorescencyjnego markerów neuronalnych i LCM izolacji neuronów hodowanych na szkiełkach błonowych PEN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspansja ludzkich NPC (Rysunek 1)

  1. Ożyw zamrożony zapas ludzkich NPC z mózgu płodu (Lonza, Walkersville, MD, USA) i hoduj je w zawiesinie w kolbach T-75 jako neurosfery (Figura 1A) w pożywce neuropodstawowej zawierającej suplementy proliferacji, EGF (10 ng / ml) i FGF (10 ng / ml).
  2. Po 3 dniach w hodowli przenieś neurosfery do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj z prędkością 500 obr./min przez 5 minut.
  3. Odrzucić supernatant, pozostawiając ~100 μl pożywki nad osadem komórkowym i przenieść do probówki Eppendorfa. Osad komórkowy o pojemności 100 μl wystarczy do rozszczepienia na 2 kolby T-75. Jeśli mniej, zmniejsz liczbę kolb, ponieważ komórki neuroprogenitorowe nie proliferują się, jeśli są podzielone na cienkie kawałki.
  4. Rozcieraj granulat końcówką o pojemności 200 μl 50x, trzymając końcówkę o pojemności 200 μl przy dnie tuby. Podzielić zawiesinę komórkową równomiernie na dwie części i dodać je do 2 kolb T-75 (podział 1-2), jednej do dalszego rozprężania, a drugiej do różnicowania.
  5. Kontynuować hodowlę komórek neuroprogenitorowych w celu ekspansji (pierwsza kolba), zmieniając pożywkę co 4-5 dni, aż neurosfery osiągną swój pierwotny rozmiar 300-500 μm. Zmienić pożywkę przez odwirowanie (500 obr./min; 5 min), wyrzucić starą pożywkę i dodać nową pożywkę.

2. Zróżnicowanie ludzkich NPC w kulturę bogatą w neurony (Rysunek 2)

  1. W celu różnicowania komórek neuroprogenitorowych w kulturę bogatą w neurony, umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki i pokryj 100 μg/ml poli-L-lizyny, dodając 500 μl do każdej studzienki. Inkubuj naczynia przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać roztwór poli-L-lizyny i przepłukać płytkę jałową wodą.
  3. Następnie pokryj studzienki płytki 500 μl 5 μg/ml mysiej lamininy i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji umyć studzienki PBS.
  4. 4 dni po podziale komórek (krok 1.4) przenieś małe neurosfery z kolby oznaczonej "Do różnicowania" do powlekanych szalek o gęstości ~ 500 neurosfer na dołek 24-dołkowej płytki.
  5. Po 6 godzinach, gdy neurosfery przyczepią się do naczynia, usuń pożywkę proliferacyjną i dodaj pożywkę różnicującą składającą się z podłoża neuropodstawnego, suplementu B27, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM) i kwasu retinowego (2 μM).

3. Barwienie immunofluorescencyjne zróżnicowanych NPC (Rysunek 3)

  1. Po dwóch tygodniach hodowli komórek neuroprogenitorowych w pożywce różnicowania neuronów uzyskuje się kulturę bogatą w neurony. Wypłucz neurony raz w PBS, a następnie utrwal je w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Po utrwaleniu przepłucz komórki trzykrotnie PBS.
  2. Inkubować komórki z buforem permeabilacyjnym (5% BSA i 0,2% Triton X-100 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
  3. Inkubować szalki O/N w temperaturze 4 °C w wytrząsarce z następującą kombinacją przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych w 3% BSA w PBS: NeuN (1:250) i synapsyna (1:250); acetylocholinoesterazy (1:500) i synaptofizyny (1:250); BDNF (1:500) i GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) i GFAP (1:1 000).
  4. Przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS, a następnie inkubować je z drugorzędowymi przeciwciałami anty-króliczym-Cy3 i anty-mysimi przeciwciałami FITC w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut. Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS.
  5. Umieścić 10 μl podłoża montażowego na szkiełku podstawowym, wyjąć szkiełko nakrywkowe z naczynia hodowlanego za pomocą kleszczy i położyć je do góry nogami na podłożu montażowym. Delikatnie zetrzyj nadmiar podłoża montażowego i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci.
  6. Zbadaj neurony wybarwione immunologicznie w mikroskopie fluorescencyjnym.

4. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów (Rysunek 4)

  1. Różnicować NPC w kulturę bogatą w neurony na szkiełkach błonowych PEN pokrytych poli-L-lizyną i lamininą myszy, postępując zgodnie z procedurami opisanymi na rysunku 2.
  2. Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w warunkach wolnych od RNAse.
  3. Wybarwić kultury za pomocą HistoGene Stain (Arcturus) w celu wizualizacji komórek.
  4. Znajdź obszary czystych populacji neuronów pozbawionych astrocytów, korzystając z obrazu mapy drogowej całego slajdu z systemem Veritas LCM. Zaznacz neurony za pomocą narzędzi do rysowania.
  5. Wykonuj laserowe przechwytywanie tych obszarów przy użyciu sterowanej komputerowo precyzji i automatyzacji w dwuetapowym procesie. Po pierwsze, IR (podczerwień) jest wystrzeliwana w wiele punktów z ustawieniem mocy lasera 70 mW i impulsem 2,500 μs, aby membrana została przymocowana do nasadki. Następnie zaznaczony obszar jest wycinany za pomocą narzędzia tnącego UV przy niskim poziomie 10 mV.
  6. Połączenie tych procesów selektywnie przechwytuje zaznaczone obszary z membrany PEN na nasadki makr CapSure LCM. Kiedy czapeczka jest podnoszona, błona z neuronami przylega do czapeczki.
  7. Wyizolować całkowite RNA z próbek LCM za pomocą zestawu do izolacji PicoPure RNA (Arcturus) i potraktować DNazą.
  8. Amplifikuj wyizolowane RNA za pomocą zestawu do amplifikacji RNA RiboAMP, postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu.
  9. Wykonuj analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym za pomocą sond TaqMan w celu wykrycia ludzkiego łańcucha ciężkiego neurofilamentu (hNFHc).

Skróty:

AD, choroba Alzheimera; BDNF, neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego; CREB, cykliczne białko wiążące element odpowiedzi AMP; DBC, cykliczny wzmacniacz dibutyrylu; EGF, naskórkowy czynnik wzrostu; FGF, czynnik wzrostu fibroblastów; GFAP, kwaśne białko fibrylarne glejowe; LCM, mikrodysekcja wychwytu laserowego; NGF, czynnik wzrostu nerwów; NPC, komórka neuroprogenitorowa; PEN, naftalan etylenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozszerzenie NPC (Rysunek 1)

Gdy neurosfery są rozbijane na zawiesinę pojedynczej komórki przez roztarcie, końcówka pipety musi dotykać dna probówki, aby istniał pewien opór, gdy zawiesina jest pipetowana w górę i w dół. Liczba razy trituration będzie różna u poszczególnych osób i należy o niej decydować metodą prób i błędów, badając powstałą zawiesinę komórek pod mikroskopem. Bardzo ważne jest zapewnienie wystarczającej gęstości zawiesiny komórek, ponieważ proliferacja będzie pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisujemy bogaty w neurony model hodowli komórek poprzez różnicowanie samoodnawiających się ludzkich komórek neuroprogenitorowych oraz metodę izolowania czystej populacji neuronów za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego. Użyliśmy kombinacji NGF, BDNF, DBC i kwasu retinowego do różnicowania neuronalnego NPC. DBC jest używany do aktywacji CREB, czynnika transkrypcyjnego, który wzmacnia neurogenezę 12. Kwas retinowy indukuje wyjście z cyklu komórkowego i zmniejsza populację glejową 13<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Merit Review (NEUD-004-07F) od Veterans Administration (dla S.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki neuroprogenitorowe (NPC) LonzaPT-2599
Neurocult NS-A ludzkie podłożeTechnologia komórek macierzystych5750
Neurocult NS-A Suplement proliferacyjnyTechnologia komórek macierzystych5753
Neurocult NS-A Suplement różnicującyTechnologia komórek macierzystych5754
Suplement B-27 (50x) Invitrogen17504-044
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostuTechnologia komórek macierzystych2633
Czynnik wzrostu fibroblastów SigmaF0291
Neurotroficzny czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego Sygnalizacja komórkowa3897S
Czynnik wzrostu nerwów Invitrogen13257-019
Dibutyryl cykliczny AMPSigmaD-0627
poli-L-lizyna SigmaP-5899
Mysia laminina SigmaL-2020
Kwas retinowyPrzeciwciało SigmaR-2625
STAT3Sygnalizacja komórkowa9132
Przeciwciało GFAPSygnalizacja komórkowa3670
Przeciwciało GAP43Laboratoria transdukcji612262
Przeciwciało BDNFMilliporeAB1534SP
Przeciwciało acetylocholinoesterazy Santz cruzSc-11409
Przeciwciało synaptofizynyAbcamab18008-50
Przeciwciało NeuNChemiconMAB377
Przeciwciało synapsynyNovusNB300-104
Anty mysie FITCJackson Immuno115-095-146
Laboratoria
Anti Rabbit Cy3Jackson Immuno711-165-152
Laboratoria
BSASigmaA1653
Triton-X 100Acros21568-2500
Paraformaldehye Fisher4042
Szkiełko nakrywkowe (szkiełko nakrywkowe z dużym kołem)Fisherbrand12-545-102
Podłoże montażowe (Prolong Gold)InvitrogenP36930
Membrana długopisuZastosowane biosystemyLCM0521
Zestaw do barwienia sekcji mrożonych Histogene LCMBiosystemy zastosowaneKIT0401
Zestaw do amplifikacji RNA RiboAmpApplied biosystemsKIT0201
Zestaw do izolacji Picopure RNAZastosowane biosystemyKIT0202
CapsureMacro LCM KapsułkiApplied biosystemsLCM0211
podstawowe badawczebadawcze

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
  4. Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
  5. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
  6. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  7. Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
  8. Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
  9. Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
  11. Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).
  12. Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
  13. Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
  14. Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
  15. Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laser Capture MicrodissectionHuman Neuroprogenitor CellsNeuronal DifferentiationImmunofluorescent StainingNeuron Rich CulturePEN Membrane SlidesGene Expression AnalysisNeurotrophic Growth FactorsCell IsolationRNA Amplification

Powiązane artykuły