Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Summary

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Abstract

Komórki neuroprogenitorowe (NPC) wyizolowane z ludzkiego mózgu płodu zostały namnażone w warunkach proliferacyjnych w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), aby zapewnić obfite zaopatrzenie komórek. NPC różnicowano w obecności nowej kombinacji czynnika wzrostu nerwów (NGF), neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF), dibutyrylu cAMP (DBC) i kwasu retinowego na naczyniach pokrytych poli-L-lizyną i mysią lamininą w celu uzyskania kultur bogatych w neurony. NPC różnicowano również pod względem braku neurotrofin, DBC i kwasu retinowego oraz w obecności rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF), aby uzyskać kultury bogate w astrocyty. Zróżnicowane NPC charakteryzowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla panelu markerów neuronalnych, w tym NeuN, synapsyny, acetylocholinoesterazy, synaptofizyny i GAP43. Kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i markery astrocytów STAT3 wykryto u 10-15% zróżnicowanych NPC. Aby ułatwić charakterystykę molekularną specyficzną dla typu komórki, przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego w celu wyizolowania neuronów hodowanych na szkiełkach membranowych z naftalanu etylenu (PEN). Metody opisane w tym badaniu dostarczają cennych narzędzi do pogłębienia naszej wiedzy na temat molekularnego mechanizmu neurodegeneracji.

Introduction

Wiadomo, że neurogeneza trwająca całe życie występuje w strefie podkomorowej komór bocznych oraz w warstwie podziarnistej zakrętu zębatego mózgu dorosłego ssaka ¹. Komórki neuroprogenitorowe (NPC), które pochodzą z tych regionów, są komórkami multipotencjalnymi, które mogą różnicować się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty ². NPC wzbudziły zainteresowanie ze względu na ich potencjał do przeszczepiania pacjentom z różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona, stwardnieniem zanikowym bocznym, udarem mózgu i chorobą Alzheimera (AD) ³. Badania z udziałem NPC koncentrowały się na tym kącie przeszczepu, ale potencja....

Protocol

1. Ekspansja ludzkich NPC (Rysunek 1)

1. Ożyw zamrożony zapas ludzkich NPC z mózgu płodu (Lonza, Walkersville, MD, USA) i hoduj je w zawiesinie w kolbach T-75 jako neurosfery (Figura 1A) w pożywce neuropodstawowej zawierającej suplementy proliferacji, EGF (10 ng / ml) i FGF (10 ng / ml).
2. Po 3 dniach w hodowli przenieś neurosfery do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj z prędkością 500 obr./min przez 5 minut.
3. Odrzucić supernatant, pozostawiając ~100 μl pożywki nad osadem komórkowym i przenieść do probówki Eppendorfa. Osad komórkowy o pojemności 100 μl wystarczy do rozszczepienia na 2 kolby T-75. Jeśli mnie....

Results

Rozszerzenie NPC (Rysunek 1)

Gdy neurosfery są rozbijane na zawiesinę pojedynczej komórki przez roztarcie, końcówka pipety musi dotykać dna probówki, aby istniał pewien opór, gdy zawiesina jest pipetowana w górę i w dół. Liczba razy trituration będzie różna u poszczególnych osób i należy o niej decydować metodą prób i błędów, badając powstałą zawiesinę komórek pod mikroskopem. Bardzo ważne jest zapewnienie wystarczającej gęstości zawiesiny komórek, ponieważ proliferacja będzie pr.......

Discussion

W tym badaniu opisujemy bogaty w neurony model hodowli komórek poprzez różnicowanie samoodnawiających się ludzkich komórek neuroprogenitorowych oraz metodę izolowania czystej populacji neuronów za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego. Użyliśmy kombinacji NGF, BDNF, DBC i kwasu retinowego do różnicowania neuronalnego NPC. DBC jest używany do aktywacji CREB, czynnika transkrypcyjnego, który wzmacnia neurogenezę ¹². Kwas retinowy indukuje wyjście z cyklu komórkowego i zmniejsza populację glejową ^13<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komórki neuroprogenitorowe (NPC)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A ludzkie podłoże	Technologia komórek macierzystych	5750
Neurocult NS-A Suplement proliferacyjny	Technologia komórek macierzystych	5753
Neurocult NS-A Suplement różnicujący	Technologia komórek macierzystych	5754
Suplement B-27 (50x)	Invitrogen	17504-044
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu	Technologia komórek macierzystych	2633
Czynnik wzrostu fibroblastów	Sigma	F0291
Neurotroficzny czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego	Sygnalizacja komórkowa	3897S
Czynnik wzrostu nerwów	Invitrogen	13257-019
Dibutyryl cykliczny AMP	Sigma	D-0627
poli-L-lizyna	Sigma	P-5899
Mysia laminina	Sigma	L-2020
Kwas retinowy	Przeciwciało Sigma	R-2625
STAT3	Sygnalizacja komórkowa	9132
Przeciwciało GFAP	Sygnalizacja komórkowa	3670
Przeciwciało GAP43	Laboratoria transdukcji	612262
Przeciwciało BDNF	Millipore	AB1534SP
Przeciwciało acetylocholinoesterazy	Santz cruz	Sc-11409
Przeciwciało synaptofizyny	Abcam	ab18008-50
Przeciwciało NeuN	Chemicon	MAB377
Przeciwciało synapsyny	Novus	NB300-104
Anty mysie FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Laboratoria
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Laboratoria
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Szkiełko nakrywkowe (szkiełko nakrywkowe z dużym kołem)	Fisherbrand	12-545-102
Podłoże montażowe (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Membrana długopisu	Zastosowane biosystemy	LCM0521
Zestaw do barwienia sekcji mrożonych Histogene LCM	Biosystemy zastosowane	KIT0401
Zestaw do amplifikacji RNA RiboAmp	Applied biosystems	KIT0201
Zestaw do izolacji Picopure RNA	Zastosowane biosystemy	KIT0202
CapsureMacro LCM Kapsułki	Applied biosystems	LCM0211