Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c

Podsumowanie

Postanowiliśmy określić dopuszczalne stężenia trzech kwasów tłuszczowych (kwasu oleinowego, linolowego i linolenowego) oraz toksyny, które nie wpływały znacząco i negatywnie na przeżywalność komórek poprzez rozpuszczanie kwasów tłuszczowych i toksyny oraz używanie ich w testach przeżycia komórek.

Streszczenie

Pozytywna rola kwasów tłuszczowych w zapobieganiu i łagodzeniu chorób innych niż ludzkie i ludzkie była i nadal jest obszernie udokumentowana. Role te obejmują wpływ na choroby zakaźne i niezakaźne, w tym zapobieganie stanom zapalnym, a także odporność błony śluzowej na choroby zakaźne. to ostra choroba jelit wywoływana przez bakterię Vibrio cholerae. Występuje w krajach rozwijających się i nieleczona może prowadzić do śmierci. Chociaż istnieją szczepionki przeciwko, nie zawsze są one skuteczne i potrzebne są inne metody zapobiegawcze. Postanowiliśmy określić dopuszczalne stężenia trzech kwasów tłuszczowych (kwasu oleinowego, linolowego i linolenowego) oraz toksyny przy użyciu odpowiednio mysich makrofagów BALB/C i ludzkich komórek nabłonka jelitowego. Rozpuściliśmy powyższe kwasy tłuszczowe i zastosowaliśmy testy proliferacji komórek, aby określić zakresy stężeń i określone stężenia kwasów tłuszczowych, które nie są szkodliwe dla żywotności ludzkich komórek nabłonka jelitowego. Rozpuściliśmy toksynę i użyliśmy jej w teście w celu określenia zakresów stężeń i specyficznych stężeń toksyny, które statystycznie nie zmniejszają żywotności komórek w makrofagach BALB/C.

Stwierdziliśmy, że optymalne stężenia kwasów tłuszczowych wynoszą od 1 do 5 ng/μl, a dla toksyny < 30 ng na leczenie. Dane te mogą pomóc w przyszłych badaniach, które mają na celu znalezienie ochronnej roli kwasów tłuszczowych w błonie śluzowej w zapobieganiu lub łagodzeniu zakażeń.

Wprowadzenie

Korzyści zdrowotne wynikające z kwasów tłuszczowych, takich jak kwas oleinowy, linolowy i linolenowy, były i nadal są udokumentowane. Na przykład kwas oleinowy ułatwia przenikanie leków lipofilowych do organizmu^1,2, zmniejsza chorobę niedokrwienną serca o 24%, gdy zastępuje nasycone kwasy tłuszczowe³ i jest stosowany w leczeniu chorób metabolicznych, takich jak adrenoleukodystrofia⁴, która jest genetycznym zaburzeniem metabolizmu kwasów tłuszczowych sprzężonym z chromosomem X. Chociaż kwas linolowy (w przeciwieństwie do kwasu oleinowego) jest niezbędnym prekursorem kwasu arachidonowego u ssaków, nie jest syntetyzowany przez organizm i musi być pozyskiwany ze źródeł zewnętrznych, takich jak spożycie nasion lnu. ⁵ Badania wykazują kilka korzystnych skutków zdrowotnych kwasu linolowego, takich jak: właściwości przeciwstarzeniowe dla skóry; ⁶ właściwości przeciwzapalnych; ⁷ zmniejszona proliferacja komórek raka jelita grubego i prostaty; ⁸ oraz zdolność do walki z otyłością i promowanie zdrowia układu sercowo-naczyniowego. ⁹ Kwas linolenowy odgrywa rolę w zmniejszaniu stanu zapalnego przyzębia10 oraz modulowaniu biosyntezy tromboksanu i prostacykliny. ¹¹

Arpita¹² badała wpływ żółciowych kwasów tłuszczowych i cholesterolu na ekspresję czynników wirulencji i ruchliwość V. cholerae. Yamasaki¹³ wskazał, że ekstrakt metanolowy z czerwonej papryczki chili i inne naturalnie ekstrahowane związki mogą potencjalnie zmniejszyć produkcję toksyny. Można sobie wyobrazić rozważenie stosowania produktów spożywczych bogatych w powyższe kwasy tłuszczowe (takich jak nasiona lnu) w zapobieganiu i łagodzeniu chorób zakaźnych, takich jak, poprzez zapewnienie odporności błony śluzowej. Przeprowadziliśmy badania w celu rozpuszczenia kwasów tłuszczowych i określenia, za pomocą testów proliferacji komórek, maksymalnego stężenia kwasów tłuszczowych, które ludzkie komórki nabłonka jelitowego mogą tolerować bez szkodliwego wpływu na żywotność komórek. Postawiliśmy hipotezę, że kwasy oleinowy, linolowy i linolenowy mają korzystny wpływ na żywotność komórek w niższych stężeniach, ale w wyższych stężeniach będą toksyczne dla komórek. Rozpuściliśmy również toksynę i określiliśmy maksymalne stężenie toksyny, które makrofagi myszy BALB/C mogą tolerować bez znacznego spadku żywotności komórek. Stawiamy hipotezę o toksycznym wpływie toksyny na żywotność komórek nawet na bardzo niskim poziomie. Metoda rozpuszczania toksyny i wykorzystania jej do określenia maksymalnej ilości toksyny, którą komórki mogą tolerować bez znacznego spadku przeżywalności, stanowi przewagę dla przyszłych badań. Na przykład połączenie powyższych metodologii można wykorzystać do określenia, czy kwasy tłuszczowe zapewniają komórkom odporność błony śluzowej na infekcje. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, ta racjonalność i metodologia nie zostały zbadane.

Omawiamy, jak nasze wstępne dane mogą być wykorzystane w późniejszych badaniach, aby ustalić, czy kwas oleinowy, linolowy i linolenowy zapewniają komórkom odporność błony śluzowej na zakażenie.

Protokół

1. Hodowla tkankowa

1. Użyj makrofagów Mus musculus (myszy BALB/c) do oznaczania toksyny. Początkowo należy wyhodować wszystkie komórki M. musculus zgodnie z instrukcjami dostawcy.
2. Rozmnażaj komórki myszy BALB/c w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium z L-glutaminą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% pożywką antybiotykową/przeciwgrzybiczą lub podstawową pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 5% L-glutaminą i 1% odczynnikiem antybiotykowym/przeciwgrzybiczym.
3. Hodować komórki w kolbach do corningu o średnicy 75^cm2 z wentylowanymi nasadkami w temperaturze 37 °C, 95% powietrza i 5% CO_{2 .}
4. Przywołaj ludzkie komórki nabłonka jelitowego w ciągu 24 godzin od dostawy, zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oznaczania kwasów tłuszczowych.
5. Namnażać ludzkie komórki nabłonka jelitowego w kolbach rogowych o długości 75^cm2 z wentylowanymi nasadkami w pożywce HybriCare uzupełnionej 10% FBS i 30 ng/ml ludzkiego EGF w temperaturze 37 °C. Nie należy używać odczynników antybiotykowych/przeciwgrzybiczych zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Podziel wszystkie komórki (1:3) przy około 70% zbieganiu.
7. Zamroź i wydobądź wszystkie komórki przez cały czas trwania badania, stosując standardowe protokoły zamrażania.
8. Uwaga: Do oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych na większą skalę, początkowo użyj szybciej rosnących, łatwiejszych w utrzymaniu makrofagów mysich. Do oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych w drobnej skali należy użyć ludzkich komórek nabłonkowych. Używaj makrofagów myszy do wszystkich metod leczenia toksyną (patrz dyskusja).

2. Leczenie kwasami tłuszczowymi i toksyną

1. Przenieś kwasy oleinowy, linolowy i linolenowy z dostarczonych przez firmę szklanych ampułek do wysterylizowanych szklanych fiolek.
2. Przenieś każdy kwas tłuszczowy do oddzielnej wysterylizowanej probówki Eppendorfa i rozpuść ją najpierw w 100% etanolu w rozcieńczeniu 1:6, a następnie w niekompletnym podłożu RPMI 1640 do końcowego stężenia 10 μg/μl.
3. Zmieszać każdy roztwór i przenieść go do szklanych fiolek do przechowywania w zamrażarce (-20 °C).
4. Komórki płytki w 2,500 komórkach / dołku na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych.
5. Dodać odpowiednią kompletną pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość studzienki do 200 μl w celu traktowania komórek kwasami tłuszczowymi w ramach przygotowań do testów MTT.
6. Po 24-godzinnym okresie rozmnażania wyjmij nośnik i zastąp go nowym.
7. Dodaj odpowiednie stężenia każdego kwasu tłuszczowego, który ma być badany, do studzienek (patrz wyniki). Dodaj kompletne media, aby zwiększyć całkowitą objętość studzienki do 200 μl.
8. Inkubować płytki poddane działaniu środka przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.
9. Rozpuścić toksynę w PBS o stężeniu 1 mg/ml i podwielokrotność roztworu w kriowialach i przechowywać kriowiale w temperaturze 2-8 °C.
10. W przypadku leczenia komórkami należy rozcieńczyć toksynę w stosunku 1:100 w wysterylizowanym PBS (pH 7,4) lub niekompletnym DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 1 ng/μl.
11. Do leczenia komórek toksyną w ramach przygotowań do testów MTT, płytki komórkowej, jak opisano powyżej.
12. Po 24-godzinnym okresie namnażania dodaj odpowiednie stężenia toksyny (nasze stężenia patrz wyniki), które zostaną przetestowane do studzienek zgodnie z procedurami stosowanymi w aplikacjach kwasów tłuszczowych (powyżej).
13. Inkubować płytki poddane działaniu środka przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.
14. Jako dodatnia (dodatnie c w całym artykule) i ujemna kontrola (ujemne c), zarówno w przypadku leczenia kwasami tłuszczowymi, jak i toksyną, inkubuje się komórki odpowiednio z kompletną pożywką i 70% etanolem.
15. W przypadku wszystkich próbek i zabiegów należy zastosować co najmniej trzy powtórzenia (n = 3), z większą liczbą powtórzeń dla kontroli pozytywnych (n = 6 w tym badaniu).

3. Test MTT

1. Przygotować roztwór podstawowy MTT do stężenia 2,5 mg/ml.
2. Usunąć roztwór z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki, która ma być badana, i zastąpić go 200 μl świeżego kompletnego roztworu pożywki.
3. Dodać 10 μl roztworu MTT do każdego dołka.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny.
5. Odrzucić roztwór pożywki i dodać 100 μl 0,04 M HCl w izopropanolu do każdej studzienki.
6. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
7. Przenieś roztwór z każdej studzienki do nowej probówki wirówkowej.
8. Wirować przy 20 000 x g, w temperaturze pokojowej, przez 1 minutę lub do momentu powstania osadu.
9. Przenieść od 20 do 40 μl każdej próbki do czytnika mikropłytek.
10. Odczytać absorbancję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru.

Wyniki

Oznaczenie optymalnego stężenia kwasów tłuszczowych

Optymalne stężenie kwasów tłuszczowych definiuje się jako maksymalne stężenie, przy którym wzrost komórek jest porównywalny z wzrostem komórek kontrolnych lub go przekracza, przy stosunkowo niskiej zmienności wyników. Aby określić optymalne stężenie kwasów oleinowego, linolewowego i linolenowego, komórki poddawano początkowo działaniu różnych stężeń każdego kwasu tłuszczowego w dużych przyrostach, a następnie w mniejszych przyrostach. Ry...

Dyskusja

Sugestia stężenia kwasów tłuszczowych i toksyny

Chociaż dokładny mechanizm działania kwasów tłuszczowych wzmacniających odporność błony śluzowej nie jest znany, w kilku badaniach próbowano zbadać ich korzystne działanie. Nasze badanie ma na celu przedstawienie metodologii określania maksymalnego stężenia kwasów tłuszczowych, które komórki mogą tolerować, a także maksymalnego stężenia toksyny, które komórki mogą tolerować bez znaczącego wpływu na przeżycie komórek.

Aby ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cells/Reagent
Mus musculus makrofagi	ATCC	ATCC RAW 264.7
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco	ATCC	30-2002
L-glutamina	ATCC	30-2115
Surowica bydlęca	płodu Bio-west	S0250
Antybiotyk/ przeciwgrzybicze	Hyclon	SV3007901
Ludzkie komórki nabłonka jelitowego	ATCC	ATTC CCL-241
Pożywka HybriCare	ATCC	46-X
Kwas oleinowy	Sigma-Aldrich	O1008
Kwas linolowy	Sigma-Aldrich	L-1376
Kwas linolenowy	Sigma-Aldrich	L-2376
Toksyna	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
BD Falcon 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych
oprogramowaniem Dynex Revelations 4.22	Dynex	91000101