Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Podsumowanie

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Streszczenie

Ludzkie komórki nie mnożą się w nieskończoność. Pod wpływem sygnałów zewnętrznych i/lub wewnętrznych komórki mogą umrzeć lub wejść w stabilne zatrzymanie cyklu komórkowego zwane starzeniem. Wykazano, że kilka mechanizmów komórkowych, takich jak skracanie telomerów i nieprawidłowa ekspresja onkogenów mitogennych, powoduje starzenie się. Starzenie się nie ogranicza się do normalnych komórek; Zgłaszano również, że komórki rakowe starzeją się.

Wykazano, że leki chemoterapeutyczne wywołują starzenie się komórek rakowych. Pozostaje jednak kwestią sporną, czy starzenie się zapobiega, czy sprzyja nowotworzeniu. Ponieważ może to być ostatecznie specyficzne dla pacjenta, wkrótce potrzebna będzie szybka i czuła metoda oceny starzenia się komórek rakowych.

W tym celu, standardowy test β-galaktozydazy, obecnie stosowana metoda, ma poważne wady: jest czasochłonny i niewrażliwy. Proponujemy tutaj test oparty na cytometrii przepływowej do badania starzenia się żywych komórek. Ten test ma tę zaletę, że jest szybki, czuły i może być sprzężony z znakowaniem immunologicznym różnych markerów komórkowych.

Wprowadzenie

Od wczesnych lat sześćdziesiątych i odkrycia przez Hayflicka i Moorheada, starzenie się nadal pozostaje komórkową ciekawostką ¹. Ludzkie komórki nie rozmnażają się w nieskończoność, a przez starzenie się Hayflick i Moorhead ukuli komórkowy proces starzenia się. Starzenie się to stabilne zatrzymanie cyklu komórkowego, w którym komórki pozostają aktywne metabolicznie, w przeciwieństwie do śmierci komórkowej. Do tej pory wykazano, że cztery mechanizmy komórkowe indukują starzenie się: skracanie telomerów, uszkodzenie DNA, zaburzenia chromatyny i nieprawidłowa ekspresja mitogennych onkogenów ². Oznacza to, że nie tylko normalne komórki, ale także komórki rakowe są w stanie ulec starzeniu ³. W rzeczywistości wykazano, że komórki nowotworowe ulegające starzeniu się stanowią barierę dla dalszej progresji guza ^4-5. Jednak kilka doniesień wskazało, że w pewnych okolicznościach starzenie się komórek może również sprzyjać nowotworom złośliwym ^6-7. Badanie starzenia się komórek nowotworowych wkrótce stanie się pilną potrzebą w badaniach nad rakiem, ponieważ obecnie stosowane leki chemioterapeutyczne mogą prowadzić do starzenia się komórek rakowych nie tylko in vitro, ale także in vivo ⁸.

Głównym testem do badania obecności komórek starczych jest test β-galaktozydazy o kwaśnym pH. Ten test histochemiczny odzwierciedla zwiększoną biogenezę lizosomalną zachodzącą w większości komórek starczych. Krótko mówiąc, egzogenny X-gal, nałożony na komórki, jest rozszczepiany przez β-galaktozydazę wzbogaconą w lizosomy komórek starczych, co daje niebieski kolor ⁹. Niebieskie komórki starcze można następnie określić ilościowo pod mikroskopem jasnego pola. Chociaż test β-galaktozydazy jest bardzo popularny, ma poważne wady. Po pierwsze, ten test jest wykonywany na stałych komórkach. Po drugie, jest to czasochłonne, ponieważ oznacza ilościowe określenie stopnia starzenia się poprzez zliczenie znacznie dużej liczby komórek starczych pod mikroskopem. Po trzecie, test ten nie jest czuły, ponieważ rozróżnienie między komórkami starczymi i niestarzejącymi się całkowicie zależy od obserwatora.

Omawiamy tutaj niewykorzystany, szybki i czuły test oparty na cytometrii do oceny obecności żywych komórek starczych. Test ten opiera się na hydrolizie cząsteczki przepuszczalnej przez błonę, 5-dodekanoiloaminofluoresceiny di-β-D-galaktopyranozydu (C₁₂FDG), przez β-galaktozydazę wzbogaconą w komórki starcze. Po hydrolizie i wzbudzeniu laserowym C₁₂FDG emituje zieloną fluorescencję i dlatego może być wykryty za pomocą cytometrii przepływowej ^{10, 11}. Wykrywanie komórek starczych za pomocą cytometrii przepływowej ma tę wielką zaletę, że jest szybkie i czułe. Ponadto wykrywanie komórek starczych za pomocą cytometrii przepływowej może być połączone z wykrywaniem innych markerów komórkowych. Test ten może być stosowany do wykrywania komórek starczych w populacji komórek rakowych leczonych chemioterapią i może być rutynowo umieszczany na skrawkach tkanki, po dysocjacji komórek, w klinice.

Protokół

1. Przygotowanie C12FDG, Bafilomycyny A1 i hodowli komórkowej

1. Rozpuścić proszek C₁₂FDG w sulfotlenku dimetylu (DMSO) do końcowego stężenia 20 mM. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. DMSO należy stosować w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa.
2. Rozpuścić proszek bafilomycyny A1 w DMSO do końcowego stężenia 0,1 mM. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bafilomycynę należy stosować w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa.
3. Hodować linię komórkową RPMI 8226 lub inne linie komórkowe przylegające lub nie, w pożywkach zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków, w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Oszacuj liczbę komórek potrzebnych do eksperymentu. Aby zarejestrować wystarczającą liczbę zdarzeń podczas analizy cytometrii przepływowej, wymagane jest 5 x 10⁵ komórek. Aby określić procent komórek starczych, potrzebne są trzy próbki komórek: próbka nieznakowana, komórki niepoddane działaniu substancji barwione C₁₂FDG, komórki poddane działaniu substancji wybarwione C₁₂FDG.
4. Wysiewaj komórki 24 godziny przed wykonaniem eksperymentu, aby komórki znajdowały się w fazie logarytmicznej krzywej proliferacji komórkowej.

2. Indukcja starzenia

się

1. Indukuj starzenie się komórek rakowych poprzez dodanie leku chemioterapeutycznego. Stężenie leku i czas trwania leczenia powinny być dostosowane do badanego typu komórek. Rozpocznij od 48-godzinnej kuracji w końcowym stężeniu doksorubicyny 50 nM dla stężenia komórek na poziomie około 10-6 komórek/ml. Nie zapomnij dołączyć próbki niepoddanej działaniu substancji (kontrola ujemna).

3. Leczenie bafilomycyną A1

1. Sprawdź żywotność komórek, mieszając je z błękitem trypanowym (v/v), ponieważ lek chemioterapeutyczny zastosowany w poprzednim etapie może prowadzić do apoptozy komórek. Wypełnij do komory Malasseza i policz liczbę niebieskich komórek (martwych komórek) i białych krwinek (żywych komórek). Jeśli procent żywotności jest mniejszy niż 70%, martwe komórki można usunąć za pomocą odpowiedniego zestawu, aby zapewnić, że martwe komórki nie będą zniekształcać późniejszej analizy.
2. Usuń pożywkę hodowlaną i zastąp ją wstępnie podgrzaną świeżą pożywką hodowlaną. Potraktować komórki końcowym stężeniem 100 nM bafilomycyny A1. Bafilomycyna A1 służy do neutralizacji kwaśnego pH lizosomów. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

4. C₁₂FDG Barwienie

1. Rozpuścić C₁₂FDG w podgrzanych świeżych pożywkach do końcowego stężenia 2 mM.
2. Dodać związek do komórek w końcowym stężeniu 33 μM i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . W przypadku stosowania komórek nieprzylegających, należy odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (może być konieczne dostosowanie prędkości do użytego typu ogniwa), przemyć 2x PBS. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl zimnego PBS. Jeśli używasz przylegających komórek, usuń pożywkę i przemyj 2x PBS. Zebrać przylegające komórki za pomocą roztworu trypsyny i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (może być konieczne dostosowanie prędkości do użytego typu komórek). Zawiesić osad komórkowy w 500 μl zimnego PBS. W obu przypadkach stężenie komórek powinno wynosić około 10⁶ komórek/ml.
3. Wykonaj koimmunoznakowanie, aby dokładniej scharakteryzować populację komórek starczych.

5. Analiza cytometrii przepływowej

1. Skalibrować cytometr przepływowy za pomocą kulek kontrolnych zalecanych przez producenta cytometru przepływowego. Dla wszystkich etapów należy zarejestrować co najmniej 10⁴ zdarzenia.
2. Uruchom pierwszą próbkę zawierającą komórki bez etykiet. Przygotuj dwuparametrową grafikę przedstawiającą Forward Scatter Channel (FSC) i Side Scatter Channel (SSC). Ustaw PhotoMultiplier Tubes (PMT) i zdefiniuj obszar zainteresowania z wyłączeniem martwych komórek i resztek komórkowych, które mogły pojawić się podczas przygotowywania próbki. Bramkuje ten obszar zainteresowania na histogramie z jednym parametrem wyświetlającym FL1 na skali logarytmicznej osi x i liczbę zdarzeń na osi y. Łączna liczba zdarzeń reprezentuje liczbę analizowanych komórek. Ustaw PMT tak, aby nieoznaczone komórki pojawiały się w pierwszej dekadzie na skali logarytmicznej osi x. W razie potrzeby określić autofluorescencję komórek.
3. Uruchomić drugą próbkę zawierającą komórki niepoddane działaniu środka. Na jednoparametrowym histogramie wyświetlającym FL1 (fluorescencja C₁₂FDG) umieść kursor za słabo oznaczoną populacją. Próg ten pozwoli na rozróżnienie między komórkami niestarczymi (słabo oznakowanymi komórkami) a komórkami starczymi (jasno oznaczonymi komórkami).
4. Uruchomić trzecią próbkę zawierającą komórki poddane działaniu środka. Jaskrawo oznaczone komórki, czyli komórki starcze, pojawiają się powyżej progu określonego w poprzednim kroku. Oceń procent komórek starczych, dzieląc liczbę jasnych zdarzeń na całkowitą liczbę zdarzeń. W razie potrzeby aktywność β-galaktozydazy można również oszacować za pomocą średniej intensywności fluorescencji.

Wyniki

Szpiczak mnogi, nowotwór hematologiczny, został wykorzystany do oceny starzenia się wywołanego przez procedurę chemioterapeutyczną. W tym celu dostępna na rynku linia komórkowa MM (RPMI 8226) była leczona przez 2 dni doksorubicyną, lekiem chemioterapeutycznym. Komórki poddano następnie działaniu bafilomycyny A1 i poddano dalszej inkubacji z C₁₂FDG. Komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Rysunek 1 ilustruje poszczególne etapy i pokazuje, że procent komórek starczych można określ...

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj metodę opartą na cytometrii przepływowej do ilościowego określania starzenia się komórek w żywych komórkach nowotworowych. Metoda ta opiera się na zastosowaniu związku przepuszczalnego przez błonę, C₁₂FDG, i dlatego może być stosowana w dowolnych typach komórek i po różnych zabiegach, o ile związek jest pobierany przez komórki. Po wychwycie komórkowym C₁₂FDG jest hydrolizowany przez β-galaktozydazę, wzbogaconą w lizosomy komórek starczych. Po wzbudzeniu laserowym związek emituj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-dodekanylaminofluoresceina di-β-D-galaktopyranozyd	Invitrogen	D-2893
Dimetylosulfotlenek	Sigma	D2650
Bafilomycyna A1	Sigma	B1793
Doksorubicyna	Sandoz
Trypan niebieski	Sigma	T8154
RPMI 1640 pożywka do hodowli komórkowych	Lonza	BE12-702
Surowica cielęca płodu	PAA Laboratories GmBH	A15 101
Antybiotyki	Gibco	5290-018
Cytometr przepływowy Gallios	Beckman Coulter	A94291