Tutaj prezentujemy metodę analizy pod mikroskopem świetlnym komórek końcowych tchawicy u larw Drosophila. Metoda ta pozwala na szybkie zbadanie morfologii gałęzi i światła u całych zwierząt i byłaby przydatna do analizy pojedynczych mutantów lub badań przesiewowych w kierunku mutacji wpływających na rozwój komórek terminalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie komórek końcowych tchawicy larw Drosophila za pomocą mikroskopii świetlnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kształt komórki ma kluczowe znaczenie dla jej funkcjonowania. Jednak pomimo znaczenia morfologii komórek, niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób poszczególne komórki generują określone kształty. Końcowe komórki tchawicy Drosophila stały się potężnym modelem genetycznym do identyfikacji i wyjaśnienia ról genów wymaganych do generowania morfologii komórkowych. Komórki końcowe są składnikiem rozgałęzionej sieci rurkowej, systemu tchawicy, który służy do dostarczania tlenu do tkanek wewnętrznych. Komórki końcowe są doskonałym modelem do badania kwestii kształtu komórki, ponieważ posiadają dwie odrębne architektury komórkowe. Po pierwsze, komórki końcowe mają skomplikowaną rozgałęzioną morfologię, podobną do złożonych neuronów; Po drugie, końcowe gałęzie komórek są uformowane jako cienkie rurki i zawierają wewnątrzkomórkowe światło związane z błoną. Analiza ilościowa liczby gałęzi komórki końcowej, organizacji gałęzi i indywidualnego kształtu gałęzi może być wykorzystana do dostarczenia informacji na temat roli określonych mechanizmów genetycznych w tworzeniu komórki rozgałęzionej. Analiza tworzenia się rurki w tych komórkach może ujawnić konserwatywne mechanizmy tubulogenezy wspólne dla innych sieci kanalikowych, takich jak układ naczyniowy kręgowców. Tutaj opisujemy techniki, które można wykorzystać do szybkiego naprawiania, obrazowania i analizowania zarówno wzorów rozgałęzień, jak i tworzenia się rurki w końcowych komórkach larw Drosophila. Techniki te mogą być wykorzystywane do analizy komórek końcowych u zwierząt typu dzikiego i zmutowanego lub mozaik genetycznych. Ze względu na wysoką skuteczność tego protokołu, dobrze nadaje się on również do badań przesiewowych genetycznych, opartych na RNAi lub leków w układzie tchawicy Drosophila.
Wprowadzenie
Kształt komórki ma kluczowe znaczenie dla funkcjonowania poszczególnych komórek w organizmie, a także komórek, które funkcjonują jako część tkanki lub organu. Używamy komórek końcowych tchawicy Drosophila, składnika układu oddechowego owadów, do badania mechanizmów molekularnych, które uczestniczą w kontrolowaniu dwóch konserwatywnych typów morfologii komórkowej: rozgałęzień i tworzenia rurki (lumenogeneza). Komórki końcowe znajdują się na końcach sieci rozgałęzionych rurek, które służą do dostarczania tlenu do tkanek wewnętrznych1 i mają skomplikowaną rozgałęzioną morfologię, która zależy od szlaku sygnałowego FGF, który jest kontrolowany przez lokalne poziomy tlenu w tkankach docelowych2. Końcowe gałęzie komórkowe to cienkie rurki, z wypełnionym gazem subkomórkowym światłem biegnącym przez każdą gałąź. Odrębna architektura komórkowa komórek końcowych, wraz z łatwością, z jaką można przeprowadzić analizę genetyczną u Drosophila, sprawiają, że komórki te są doskonałym modelem do badania mechanizmów wzrostu komórek, rozgałęzień i tworzenia rurki wewnątrzkomórkowej. Komórki końcowe okazały się użytecznym modelem do zrozumienia niektórych szlaków sygnałowych prowadzących do różnicowania komórek rozgałęzionych, wzrostu i dojrzewania2-4. Korzystając z tego systemu, przeprowadzono bezstronne, zaawansowane genetyczne badania przesiewowe pod kątem mutantów morfogenezy komórek, dostarczając informacji na temat mechanizmów kontrolujących kształt komórki5,6. Na przykład badania przesiewowe ujawniły, że specyficzny RabGAP jest wymagany do polaryzacji cytoszkieletu i transportu pęcherzyków w tworzeniu światła i pozycjonowaniu7; że adhezja za pośrednictwem integryny jest wymagana dla stabilności gałęzi8; oraz że nabłonkowe białka o polarności PAR regulują spolaryzowany transport błonowy wymagany zarówno do rozgałęziania, jak i tworzenia światła9. Inne badania na komórkach terminalnych wykazały, że asymetryczna akumulacja aktyny i organizacja mikrotubul są wymagane do wydłużenia komórek i lumenogenezy10. W ten sposób różnorodne, konserwatywne mechanizmy biologiczne komórki przyczyniają się do końcowej morfogenezy komórki.
Tutaj opisujemy metodę szybkiego naprawiania nienaruszonych larw Drosophila w trzecim stadium do analizy rozgałęzień komórek końcowych i tworzenia światła. Protokół ten można również przeprowadzić zarówno na zwierzętach w pierwszym, jak i drugim stadium rozwojowym. Kluczem do tej techniki jest możliwość wizualizacji komórek końcowych, które są genetycznie znakowane przez fluorescencyjną ekspresję białka bezpośrednio przez naskórek larwalny nienaruszonych zwierząt. Ponieważ procedura ta nie wymaga żadnych manipulacji po utrwaleniu, takich jak barwienie przeciwciał, w celu obserwacji komórek, doskonale nadaje się do analizy wysokoprzepustowej, w tym badań genetycznych lub przesiewowych leków. Ekspresja białek fluorescencyjnych ujawnia strukturę gałęzi wypełnionych cytoplazmatycznymi. Tworzenie się rurki można monitorować równolegle za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu zidentyfikowania światła wypełnionego gazem, które kontrastuje z otaczającymi tkankami wypełnionymi płynem.
Zawarte w tym protokole jest metoda generowania genetycznych mozaik opartych na systemie MARCM11, do produkcji homozygotycznych zmutowanych komórek końcowych znakowanych białkami fluorescencyjnymi u zwierząt nieoznakowanych. Jest to konieczne, ponieważ komórki końcowe rozwijają swoje złożone struktury dopiero stosunkowo późno w rozwoju; Mozaiki genetyczne pozwalają na ominięcie wymagań genowych w innych tkankach na wcześniejszym etapie rozwoju. Aby wygenerować klony MARCM, tchawica jest znakowana za pomocą specyficznego dla tchawicy sterownika do oddychania (btl)12. Opisany tutaj jest protokół dla chromosomu Drosophila X; W przypadku innych chromosomów można zastosować podobną procedurę, z odczynnikami genetycznymi odpowiednimi dla badanego chromosomu. W tym przypadku tchawica jest znakowana przez ekspresję cytoplazmatycznie zlokalizowanego GFP, ale procedura działa równie dobrze z ekspresją innych białek fluorescencyjnych, takich jak DsRed.
Dodatkowo, dołączyliśmy metodę ilościowego określania wzorów rozgałęzień i powstawania światła w komórkach końcowych, opartą na metodach opracowanych do charakteryzowania wzorców rozgałęzień neuronalnych13. Tego rodzaju dane ilościowe mogą mieć kluczowe znaczenie w rozpoznaniu dokładnej roli genów w procesie rozgałęziania lub lumenogenezy, a także umożliwiają bezpośrednie porównania między różnymi mutantami9.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generowanie mozaiki
- Krzyżówka genetyczna
w FRT19A wanna: GAL80 FLP122/Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (samce) X * FRT19A/Bal (samice), gdzie * oznacza mutanta, który ma być badany. Uwaga: Ustaw krzyżówkę co najmniej jeden dzień przed eksperymentem, ponieważ pozwala to zwierzętom na odpowiednie kojarzenie się. - Wstępne układanie: Przenieść krzyżówkę do fiolek z pokarmem dla much, rozmazając niewielką ilość świeżej pasty drożdżowej umieszczoną na podłożu. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
- Nieśność: Przenieść zwierzęta z fiolki przed złożeniem do świeżej fiolki z niewielką ilością świeżej pasty drożdżowej. Pozostawić na 6 godzin w temperaturze 25 °C.
- Przenieść dorosłe osobniki z powrotem do wstępnie zniesionej fiolki w celu przechowywania i wykorzystania w kolejnych eksperymentach. Natychmiast wstrząsnąć cieplnie fiolkę zawierającą zarodki w wieku 0-6 godzin przez 45 minut w temperaturze 38 °C, w łaźni wodnej z krążącą wodą. Uwaga: Powierzchnia pokarmu powinna znajdować się poniżej poziomu wody, aby sprawdzić, czy wszystkie zarodki są odpowiednio zszokowane termicznie.
- Inkubować fiolki ze szpicem cieplnym w temperaturze 25 °C przez 4-5 dni, aż larwy trzeciego stadium zaczną wędrować.
2. Ekran dla mozaikowych zwierząt
- Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium z boków fiolki i umieść je w schłodzonym 100% glicerolu na małej plastikowej płytce.
- Zbadaj larwy za pomocą mikroskopu preparacyjnego o dużym powiększeniu, wyposażonego w optykę fluorescencyjną. Zidentyfikuj larwy z mozaikową ekspresją fluorescencyjnie znakowanych komórek tchawicy. Zazwyczaj można to zrobić przy powiększeniu 10-20X.
3. Utrwalanie ciepła
- Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie wyjmij mozaikę zwierząt z naczynia i umieść ją w kropli świeżego 100% glicerolu na szkiełku mikroskopowym z białego szkła o wymiarach 75x25x1 mm. Uwaga: w kropli można umieścić wiele zwierząt (Rysunek 1A).
Zwierzęta można również umieścić w kropli glicerolu bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym, ale należy zachować ostrożność podczas utrwalania (krok 3.2), ponieważ zwierzęta bardzo szybko się nagrzewają i mogą stać się nadmiernie unieruchomione. - Umieść szkiełko podstawowe na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C, aż zwierzęta przestaną się poruszać, nie dłużej niż 20 sekund w przypadku szkiełka podstawowego i 10 sekund w przypadku szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B). Zwierzęta początkowo się wiercą, ale po śmierci zatrzymują się i stają się sztywne i wydłużone. Uwaga: zbyt długa ekspozycja na ciepło uszkodzi gałęzie końcowe i lumeny, a także sprawi, że sygnał GFP będzie przyciemniony i rozproszony. W celu uzyskania optymalnej wydajności zaleca się, aby blok grzewczy znajdował się w tym samym pomieszczeniu co mikroskopy.
- Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie ustaw wszystkie larwy w kropli w jednym kierunku, tak aby wszystkie larwy na szkiełku były ustawione równolegle do siebie (ryc. 1C).
- Delikatnie umieść mikroszkiełko nakrywkowe o wymiarach 18x18 mm na larwach (lub odwróć szkiełko nakrywkowe na szklane szkiełko) i unikaj tworzenia się pęcherzyków (Rysunek 1D). Uwaga: szkiełko nakrywkowe może nie leżeć dokładnie płasko nad larwami, nie stanowi to problemu.
- Obraz larw w ciągu 30 minut. Utrwalone ciepło komórki końcowe ulegną degradacji, a sygnał GFP stanie się bardzo rozproszony.
4. Obrazowanie in vivo komórek końcowych tchawicy
- Umieść szkiełko na stoliku złożonego mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą obiektywu 5X zlokalizuj dwa równoległe pnie grzbietowe biegnące od przodu do tyłu na powierzchni grzbietowej zwierzęcia (ryc. 1F). Zlokalizuj dwie komórki końca grzbietowego, bezpośrednio między dwoma pniami grzbietowymi. Pomaga to zidentyfikować odpowiedni segment do analizy.
- Po orientacji obróć zwierzęta, aby zobrazować żądane komórki końcowe. W tym celu należy ostrożnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do krawędzi kleszczami prostopadłymi do długiej osi larw, powoli tocząc larwy pod szkiełkiem nakrywkowym (ryc. 1E i 1G).
- Wybór odpowiednich komórek końcowych ma kluczowe znaczenie dla spójnych wyników i porównań między mutantami. Komórki końcowe gałęzi ciała tłuszczowego (FB) można łatwo znaleźć w sąsiedztwie pnia grzbietowego, bocznie do linii środkowej. Boczne komórki końcowe grupy G (LG) są łatwe do znalezienia i znajdują się tuż po stronie brzusznej linii środkowej (ryc. 1H). Uwaga: w najbardziej przednich (Tr1) i tylnych (Tr10) segmentach układ komórki końcowej jest rozbieżny z innymi segmentami. Analizujemy tylko komórki końcowe w segmentach Tr2-Tr9. Komórki końcowe grzbietowe mają bardziej stereotypowy wzór rozgałęzień niż inne komórki końcowe tchawicy. Może to zależeć od dodatkowych, nieautonomicznych sygnałów komórkowych i należy to wziąć pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o uwzględnieniu ich w analizie.
- Po zidentyfikowaniu interesującej nas komórki końcowej uchwyć obraz przy użyciu żądanego powiększenia; zazwyczaj najlepiej jest 10X lub 20X (Rysunek 2A). Uwaga: ze względu na zmienne wzorce rozgałęzień staraj się robić zdjęcia zawierające jak najwięcej gałęzi i końcówek gałęzi.
- Nie przesuwając stolika, wyłącz fluorescencję i włącz światło przechodzące, aby uchwycić obraz w jasnym polu tej samej komórki i płaszczyzny ogniskowej (rysunek 2B). Światło zostanie zwizualizowane jako ciemno kontrastujące w przestrzeni komórki końcowej. Jeśli planujesz ilościowe określenie gałęzi komórek końcowych i lumenów, zbierz wiele obrazów w wielu płaszczyznach ogniskowych każdej komórki końcowej.
5. Analiza i kwantyfikacja morfologii komórek końcowych za pomocą ImageJ
- Otwórz obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą wtyczki ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) (http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/).
- Za pomocą narzędzia "Dodaj śledzenia" ręcznie prześledź gałęzie i światło całej komórki terminala.
- Korzystając z narzędzia "Obrysowywanie etykiet", zmień nazwę i ponowne kolorowanie, aby przypisać każdej linii w śladzie określone oznaczenie.
- Za pomocą narzędzia "Ustaw parametry" dostosuj szerokość linii w zakresie 6-10 pikseli (dla obrazów 512x512 uzyskanych z kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu złożonego. W przypadku kamer o wyższej lub niższej rozdzielczości szerokość pikseli powinna być odpowiednio przeskalowana), używając wszystkich innych ustawień domyślnych, a następnie wybierz "OK". Następnie użyj narzędzia "Utwórz migawkę", aby zrobić zdjęcie. Wybierz "Narysuj ślad", aby uzyskać migawkę śladu, którą można wyświetlić obok oryginału.
- Wybierz narzędzie "Zmierz trasy" i wybierz typ śledzenia (tj. które gałęzie mają być mierzone na podstawie konkretnych oznaczeń przypisanych w kroku 5.3). Następnie wybierz "Wyświetl pomiary śledzenia" i "Wyczyść poprzednie pomiary", a następnie kliknij "URUCHOM". Spowoduje to utworzenie arkusza kalkulacyjnego zawierającego nazwę, etykietę, długość (w pikselach) i inne dane obrazu. Dane te można następnie zapisać jako arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel w celu dalszej analizy statystycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki przedstawiono na Rysunku 2. Pojedyncza komórka końcowa grupy bocznej (LG) wykazuje rozbudowane rozgałęzienia subkomórkowe (uwidocznione za pomocą GFP; A) oraz wypełnione gazem światło subkomórkowe przebiegające przez każdą z gałęzi (uwidocznione za pomocą mikroskopii w polu jasnym; B). Obrazy te pozyskano z mozaikowej larwy w stadium L3, wytworzonej przy użyciu systemu MARCM opisanego w sekcjach 1 i 2, a następnie utrwalonej termicznie i zobrazowanej zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4. Panele C i D...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj technika utrwalania ciepła jest szybkim i wygodnym narzędziem do obrazowania końcowych komórek tchawicy larw Drosophila . Tutaj używamy tej techniki do zbadania rozgałęzienia i wzoru światła komórek typu dzikiego. Komórki tchawicy wykazujące ekspresję GFP, napędzane przez promotor specyficzny dla tchawicy bez oddychania, można łatwo uwidocznić przez naskórek larwy po utrwaleniu termicznym. Za pomocą tej metody można szybko zobrazować i zmierzyć specyficzne wzory rozgałęzień poszczególnych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.
Podziękowania
Dziękujemy Gillian Stanfield za komentarze do manuskryptu. T.A.J. jest wspierany przez University of Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 od NIH NIGMS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kleszcze studenckie Dumont #5 | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Mikroskop preparacyjny (lub odpowiednik) | Mikroskop złożony Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 (lub odpowiednik) | Carl Zeiss | Wyposażony w AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Zestaw filtrów 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Genotyp muchy | : w FRT19A tuba:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotyp: y w FRT19A |
Bibliografia
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
