Artykuł metodologiczny

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50513

⸱

4 lipca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Streszczenie

Lokomocja larw Drosophila jest wspaniałym modelowym systemem w neuronauce rozwojowej i fizjologicznej, dzięki dostępności genetycznej podstawowych składników neuronalnych w obwodach1-6. Zastosowanie optogenetyki7,8 w obwodzie nerwowym larw pozwala nam manipulować aktywnością neuronalną w sposób przestrzenny i czasowy9-13. Zazwyczaj próbki są szeroko oświetlone lampą rtęciową lub diodą LED, więc specyficzność docelowych neuronów jest kontrolowana przez binarne systemy ekspresji genów, takie jak system Gal4-UAS14,15. W tej pracy, aby poprawić rozdzielczość przestrzenną do "rozdzielczości subgenetycznej", lokalnie oświetliliśmy podzbiór neuronów w brzusznym rdzeniu nerwowym za pomocą laserów zaimplementowanych w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Monitorując ruch ściany ciała częściowo nienaruszonych larw, interaktywnie aktywowaliśmy lub hamowaliśmy aktywność neuronalną za pomocą rodopsyny kanałowej16,17 lub halorodopsyny18-20, odpowiednio. Poprzez ograniczone przestrzennie i czasowo oświetlenie tkanki nerwowej możemy manipulować aktywnością określonych neuronów w obwodzie w określonej fazie zachowania. Metoda ta jest przydatna do badania związku między aktywnością lokalnego zespołu neuronalnego w brzusznym rdzeniu nerwowym a czasoprzestrzennym wzorcem wyjścia motorycznego.

Wprowadzenie

Przemieszczanie się do przodu w locie perystaltycznym u larw Drosophila następuje poprzez rozprzestrzenianie się skurczu mięśni z segmentów tylnych do przednich. Ruch ten jest realizowany przez sekwencyjną aktywację neuronów ruchowych w obrębie brzusznego rdzenia nerwowego wzdłuż podłużnej osi ciała. Aby zbadać obwody stojące za tą wzorcową aktywnością propagacyjną, lokalne zakłócenia aktywności neuronalnej mogą być podejściem informacyjnym. Chociaż test farmakologiczny może kontrolować określone substancje, takie jak neuroprzekaźniki, w tkance nerwowej, działanie leków farmakologicznych może być podobne w prawie wszystkich segmentach, ponieważ larwalny brzuszny rdzeń nerwowy jest powtarzalną strukturą złożoną z podobnych neuromerów wzdłuż osi podłużnej. Alternatywnie, można wyrazić optogenetyczne lub wrażliwe na temperaturę cząsteczki sondy w niewielkiej liczbie segmentów. Jednak tak specyficzne linie gal4 są bardzo trudne do wygenerowania. W tym miejscu przedstawiamy metodę manipulowania neuronami w kilku segmentach za pomocą oświetlenia laserowego. Wykorzystując ograniczone przestrzennie oświetlenie w mikroskopii konfokalnej, można zaburzyć aktywność neuronów w okolicy. W połączeniu ze wzorcem ekspresji sondy za pomocą podzbiorów specyficznych dla neuronów linii gal4, ta metoda oświetlenia laserowego znacznie poprawia rozdzielczość przestrzenną dla perturbacji. A ponieważ metoda ta wymaga jedynie konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego, zakup dodatkowego sprzętu laboratoryjnego zazwyczaj nie jest konieczny.

Korzystając z tej techniki, zbadaliśmy rolę aktywności neuronów ruchowych podczas propagacji wyjścia motorycznego13. Blokując aktywność neuronów ruchowych w obrębie kilku segmentów podczas ruchu perystaltycznego, byliśmy w stanie sprawdzić, czy aktywność samych neuronów ruchowych jest wymagana do propagacji motorycznego sygnału wyjściowego. Miejscowa i przejściowa blokada neuronów ruchowych zahamowała propagację ruchu perystaltycznego. Po usunięciu blokady propagacja pojawiła się na odcinku, na którym fala została zatrzymana. Zjawisko to sugeruje, że bez aktywacji neuronów ruchowych fala propagacyjna nie może dalej postępować wzdłuż brzusznego rdzenia nerwowego, a zatem aktywacja neuronów ruchowych jest niezbędna do ruchu perystaltycznego. Wcześniej informowaliśmy o szczegółowych danych i dyskusjach na temat tego zjawiska w Inada et al. (2011) 13. W tym miejscu opisujemy metodę interaktywnego zakłócania aktywności neuronalnej przy jednoczesnym monitorowaniu ruchu wypreparowanych larw. Korzystając z różnych linii gal4 i serii wzorców czasoprzestrzennych do manipulacji aktywnością, można badać logikę obwodów poprzez właściwości odpowiedzi perturbacyjnej obwodu motorycznego.

Protokół

1. Przygotowanie larw

  1. Utrzymuj linki muchowe OK6-Gal4, UAS-ChR2 lub OK6-Gal4, UAS-NpHR2 w plastikowych fiolkach zawierających standardowy pokarm dla much.
  2. Rozprowadź pastę drożdżową zawierającą all-trans retinal (ATR) w odpowiednich stężeniach (1 mM dla ChR2, 10 mM dla NpHR2 ("w skrócie NpHR") na płycie z sokiem jabłkowym.
  3. Pobrać z fiolek 2. lub 3. larwy w trzecim stadium rozwojowym i umieścić je na płytce zawierającej ATR.
  4. Hodować je w temperaturze 25 °C w ciemności przez odpowiedni okres czasu (1 dzień dla ChR2, 2 dni dla NpHR).

2. Konfiguracja mikroskopu

  1. Podłącz kamerę CCD (XCD-V60, Sony) do konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego (w naszym przypadku FV1000, Olympus) z mocowaniem C-mount (powiększenie 0,35x).
  2. Jeśli na drodze światła od soczewki obiektywu do kamery CCD znajduje się migawka, która zamyka się podczas skanowania laserowego, należy ją ostrożnie zdjąć. Ponieważ ten krok zależy od konfiguracji mikroskopu, w razie potrzeby skontaktuj się z producentem mikroskopu w celu uzyskania pomocy technicznej.

3. Sekcja

  1. Opłucz larwy karmione ATR wodą, aby usunąć resztki pokarmu z organizmu.
  2. Umieść larwę na naczyniu pokrytym sylgardem, grzbietem do góry (strona grzbietowa ma dwie rurki tchawicy biegnące wzdłużnie, po jednej z każdej strony grzbietowej linii środkowej). Grubość sylgarda wynosi około 5 mm.
  3. Włóż szpilkę do owadów (szpilki do owadów Austerlitz, Φ0,10 mm, stal nierdzewna) w ogon między rurkami dotchawiczymi za pomocą kleszczyków (#5 Inox, FST firmy Dumont, Szwajcaria). Kołki o długości około 10 mm powinny być wygięte lub przycięte tak, aby były wystarczająco krótkie (~2 mm długości), aby uniknąć uderzenia i uszkodzenia powierzchni soczewki obiektywu. Następnie umieść drugą szpilkę owada w głowie larwy w pobliżu haczyka gębowego, czarnej struktury przypominającej pazur na przednim końcu.
  4. Dodaj sól fizjologiczną wolną od Ca2+ (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacharoza 36 mM (pH 7,1)), aby larwa była wilgotna.
  5. Wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona za pomocą mikronożyczek (MB-50-7, Napox, Japonia).
  6. Od nacięcia wykonaj podłużne cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej w kierunku głowy. Uważaj, aby nie uszkodzić brzusznego rdzenia nerwowego (VNC) i aksonów.
  7. Wykonaj małe nacięcie na głowie z boku.
  8. Umieść 4 kołki w każdym rogu rozciętej ściany ciała. Ściana ciała powinna być wystarczająco rozciągnięta, aby uwidocznić segmentowy wzór ściany ciała, ale nie za bardzo, aby utrudnić ruch perystaltyczny.
  9. Usunąć narządy wewnętrzne z wyjątkiem mózgu i VNC i przepłukać próbkę solą fizjologiczną wolną odCa2+.
  10. Dostosuj orientację brzusznego rdzenia nerwowego, aby była obustronnie symetryczna, zmieniając położenie i orientację szpilek owadów na ścianie ciała. Aby ustalić położenie brzusznego rdzenia nerwowego, włóż szpilkę przez tkankę między mózgiem a zaczepem ustnym w dół do sylgardu.
  11. Zastąp bufor roztworem Ringera 2 mM Ca2+ (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacharoza 36 mM (pH 7,3)).

4. Obrazowanie z oświetleniem laserowym

  1. Zamocuj suchą soczewkę obiektywową 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japonia) w mikroskopie konfokalnym i ustaw preparat larwy na scenie.
  2. Uzyskaj obraz transmisyjny wypreparowanego preparatu za pomocą czerwonego lasera (633 nm) w celu zlokalizowania brzusznego rdzenia nerwowego za pomocą mikroskopu konfokalnego. Do tego skanowania nie należy używać lasera 488 nm lub 559 nm, który wywołuje niepożądaną stymulację odpowiednio ChR2 lub NpHR.
  3. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) na obrazie transmisji. Tryb powiększenia może być przydatny do szczegółowego określenia zwrotu z inwestycji.
  4. Zmień zestaw filtrów mikroskopu, aby oświetlał światłem 488 nm lub 559 nm.
  5. Oświetl preparat lampą halogenową, aby uwidocznić ścianę ciała. Preparat może być monitorowany za pomocą kamery CCD dołączonej do mikroskopu konfokalnego.
  6. Rejestruj ruch ściany ciała i włączaj i wyłączaj wiązkę laserową podczas monitorowania ruchu.

Wyniki

Lokalna i przejściowa aktywacja neuronów ruchowych za pomocą ChR2.

Wyrażyliśmy ChR2 w neuronach ruchowych. Aksony neuronów ruchowych wychodzące z każdego segmentu VNC rzutują do odpowiadającego im segmentu ściany ciała. Po stymulacji jednego lub dwóch segmentów VNC niebieskim laserem, mięśnie w odpowiadających im segmentach wykazywały skurcze (Rycina 1).

Lokalna i przejściowa inhibicja neuronów ruchowych z użyciem NpHR.

Wyrażyliśmy NpHR w neuronach ruchowych. Gdy podczas perystaltycznych skurczów mięśni stymulowaliśmy kilka (1~2) segmentów VNC żółtym laserem, rozprzestrzeniająca się fala została zatrzymana na odpowiadających im segmentach ściany ciała (Rysunek 2). Następnie fala wznowiła bieg od zatrzymanych segmentów po wyłączeniu naświetlania laserem13.

Schemat skurczu mięśni i obraz mikroskopowy; światło niebieskie włączone/wyłączone; orientacja przednio-tylna.
Rycina 1. Lokalna aktywacja neuronów ruchowych za pomocą ChR2. A. Schemat lokalnej aktywacji preparatu w formie płata. Poprzez naświetlanie światłem niebieskim kilku segmentów brzusznego sznura nerwowego wykazujących ekspresję ChR2 w neuronach ruchowych, dochodzi do skurczu mięśni w odpowiadających im segmentach (grot strzałki). B. Obrazy transmisyjne zdyssekowanej larwy. Lokalna iluminacja brzusznego sznura nerwowego (groty strzałek) indukuje segmentowy skurcz mięśni ściany ciała (strzałki).

Schemat skurczu i rozkurczu mięśni z efektem światła na włóknach mięśniowych, obraz mikroskopowy.
Rycina 2. Lokalna inhibicja neuronów ruchowych za pomocą NpHR. A. Schemat lokalnej inhibicji preparatu filatu. Poprzez naświetlanie światłem żółtym kilku segmentów brzusznego sznura nerwowego wykazujących ekspresję NpHR w neuronach ruchowych, skurcze mięśni podczas spontanicznego ruchu perystaltycznego (grot strzałki u góry) ulegają rozkurczowi (grot strzałki na dole). B. Obrazy transmisyjne zdyssekowanej larwy. Lokalna iluminacja brzusznego sznura nerwowego (groty strzałek) spowodowała rozkurcz spontanicznie skurczonych segmentów ściany ciała (strzałki).

Dyskusja

Czasowe i lokalne zakłócenia aktywności neuronalnej są nieocenioną techniką analizy dynamiki sieci obwodów neuronalnych. W tym protokole przedstawiamy metodę manipulowania aktywnością neuronalną za pomocą optogenetyki za pomocą lasera. Wysoka kierunkowość lasera pozwala na bardziej miejscową stymulację optogenetyczną niż stymulacja szerokopolowa przy użyciu lampy rtęciowej lub ksenonowej. Chociaż oświetlenie laserowe zostało już zastosowane w optogenetyce w poprzednich badaniach, w większości poprzednich badań wymagane są specjalne konfiguracje, takie jak włókno szklane, mikromanipulator i źródło lasera. W tym protokole używamy konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej do oświetlenia miejscowego. Ponieważ system mikroskopu konfokalnego jest szeroko stosowany, metoda ta otworzy możliwość zastosowania optogenetyki o wyższej rozdzielczości w wielu laboratoriach.

Protokół ma dwa krytyczne punkty: rozwarstwienie larw i moc lasera. Po pierwsze, jeśli mózg, brzuszny rdzeń nerwowy lub nerw ruchowy zostanie uszkodzony podczas sekcji, larwy będą wykazywać mniejszy lub żaden spontaniczny ruch perystaltyczny. Precyzja jest więc niezbędna, zwłaszcza przy wykonywaniu nacięcia po stronie grzbietowej nożyczkami sprężynowymi i usuwaniu narządów wewnętrznych za pomocą kleszczy. Szczegóły dotyczące sekcji zostały zgłoszone wcześniej21. Po drugie, jeśli ma zostać osiągnięta wystarczająca stymulacja, wymagana jest moc lasera około 0,1 ~ 1 mW / mm2 dla ChR2 lub 1 ~ 10 mW /mm2 dla NpHR. Oceniliśmy moc lasera jako całkowitą moc światła pod soczewką obiektywu podzieloną przez szacowany obszar oświetlenia. Zmierzyliśmy całkowitą moc światła za pomocą miernika mocy (mobiken, Sanwa M.I. Technos, Japonia). Oszacowaliśmy obszar oświetlenia jako stałą kołową pomnożoną przez kwadrat długości fali lasera, co w przybliżeniu daje oświetlany obszar w granicy dyfrakcji. Efektywna moc oświetlenia próbki może być regulowana nie tylko przez moc wyjścia lasera, ale także przez zmianę prędkości skanowania i liczby powtórzeń. Skanowaliśmy laser z prędkością 20-100 μs/piksel 63 razy. Ponadto poziom ekspresji białka optogenetycznego i ilość ATR mają również kluczowe znaczenie dla skuteczności stymulacji. W związku z tym, jeśli larwy nie wykazały odpowiedzi optogenetycznej, należy sprawdzić i skorygować następujące punkty: 1) moc lasera (poprzez optymalizację systemu mikroskopowego), 2) poziom ekspresji białka optogenetycznego (poprzez sprawdzenie genotypu i temperatury hodowli) oraz 3) ilość ATR (poprzez dostosowanie stężenia ATR i okresu karmienia). NpHR wymaga wyższego stężenia ATR niż ChR2 z nieznanych przyczyn 13. ChR2 dobrze sprawdza się u larw hodowanych w pokarmie zawierającym mniej ATR (np. 0,1 mM) niż opisane tutaj (1 mM). Ponieważ karmienie larw do 1 mM ATR jest wystarczające do wytworzenia ChR2 fotoreaktywnego, zalecamy to stężenie do pierwszej próby w eksperymentach ChR2. Stężenie ATR można następnie zmniejszyć z poziomu 1 mM. Jeśli chodzi o czas ekspozycji na ATR, zalecamy czas opisany tutaj w celu zapewnienia solidnej kontroli optogenetycznej. Często nie udawało nam się zaobserwować reakcji optogenetycznej podczas karmienia larw ATR przez krótszy czas.

W tym protokole oświetlenie laserowe i akwizycja obrazu są obsługiwane przez oddzielny komputer. Tak więc wyraźne wykrycie czasoprzestrzennego wzorca oświetlenia laserowego przez kamerę CCD ma kluczowe znaczenie dla analizy danych. Jeśli plamka lub linia lasera jest przyciemniona na obrazie CCD, należy zoptymalizować moc lampy halogenowej i zwiększyć wartość kamery CCD, aby zobrazować oświetlenie laserowe, zachowując widoczność ściany ciała.

Oświetlenie czasoprzestrzenne pokazane w tym protokole dostarcza informacji o obwodach motorycznych larw; Metoda ta ma jednak pewne ograniczenia. Jeśli chodzi o aspekt "przestrzenny", lokalizacja oświetlenia jest rejestrowana przez obraz CCD o małym powiększeniu, używany do filmowania ruchów ścian ciała. W związku z tym obszar oświetlenia można przypisać na poziomie segmentu, ale nie na poziomie komórkowym. Jeśli chodzi o aspekt "czasowy", opóźnienie czasowe między włączeniem skanowania laserowego za pomocą mikroskopu konfokalnego a oświetleniem laserowym zależy od systemu mikroskopu konfokalnego i warunków skanowania. W związku z tym wymagane jest przeprowadzenie pewnych testów metodą prób i błędów, aby dostosować czas oświetlenia. Ponieważ czas oświetlenia można określić w filmach z obrazem CCD za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak ImageJ, krytycznym czynnikiem w rozdzielczości czasowej jest liczba klatek na sekundę obrazowania z kamery CCD. Zazwyczaj ustawiamy liczbę klatek na sekundę na 7,5-15 klatek na sekundę.

Postęp w narzędziach optogenetycznych daje nam szansę na modyfikację tego protokołu. Użyliśmy larw 3stopnia rozwojowego posiadających OK6-Gal4 i UAS-ChR2 [H134R] lub UAS-NpHR2. Inne narzędzia optogenetyczne zamiast ChR2[H134R] lub NpHR2, takie jak ChR2[T159C/E123T], NpHR3 lub Arch, mogą zwiększyć skuteczność kontroli aktywności22. Ponadto użycie innych linii gal4 lub analiza w innych stadiach rozwoju może dostarczyć więcej informacji o obwodach silnikowych.

W tym protokole aktywność ruchowa była monitorowana poprzez transmisję obrazów skurczu ściany ciała za pomocą kamery CCD. Aktywność neuronów ruchowych z wrażliwymi na wapń cząsteczkami fluorescencji (np. GCaMP) może być również bezpośrednio monitorowana podczas manipulowania aktywnością neuronalną za pomocą ChR2 lub NpHR. W takim przypadku zamiast lampy halogenowej i zwykłej kamery CCD opisanej wcześniej w niniejszym dokumencie stosuje się oświetlenie światłem niebieskim na dużym obszarze i kamerę CCD o wysokiej czułości (np . kamerę EMCCD). Aby poprawić rozdzielczość przestrzenną stymulacji przy jednoczesnym monitorowaniu ruchu ścian ciała, bardziej zaawansowaną metodą może być zastosowanie dodatkowej soczewki obiektywowej: oświetlenie brzusznego rdzenia nerwowego przez soczewkę obiektywową o dużym powiększeniu (np. 40x) znad próbki i monitorowanie ściany ciała za pomocą soczewki o małym powiększeniu (np. 4x) poniżej próbki. Ten system podwójnych soczewek może pozwolić nam na stymulację układu nerwowego w wyższej rozdzielczości przestrzennej.

Przedstawiony tutaj protokół można zastosować do innych obwodów neuronalnych, pod warunkiem, że narzędzia optogenetyczne mogą być wyrażane w układzie nerwowym i można ustalić przygotowanie, w którym można dostarczyć wystarczającą ilość światła do tkanki nerwowej.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid na badania naukowe w innowacyjnych obszarach "Mesoscopic Neurocircuitry" (nr 22115002) i "Comprehensive Brain Science Network" (nr 221S0003) Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, Japonia dla A.N. oraz Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców (B) (nr 21700344) Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) dla H.K.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop BX61WIOlympus CorporationBX61WI
Fluoview FV1000 system konfokalnyOlympus CorporationFV1000
Kamera CCDSonyXCD-V60
all-trans siatkówkaSigmaR2500-500MG200 mM w 95% EtOH
Silpot184Dow Corning Toray3255981

Bibliografia

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019(2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107(2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

brzuszny sznur nerwowymikroskopia konfokalnachannelrodopsynahalorodopsynaodpowied ruchowakamera CCD
Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.