Method Article

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród metod badania interakcji białko-białko wewnątrz komórek, Bimolekularna Komplementacja Fluorescencyjna (BiFC) jest stosunkowo prosta i czuła. BiFC opiera się na wytwarzaniu fluorescencji przy użyciu dwóch niefluorescencyjnych fragmentów białka fluorescencyjnego (stosuje się tutaj Venus, wariant białka żółtej fluorescencji). Niefluorescencyjne fragmenty Wenus (VN i VC) są łączone z dwoma oddziałującymi białkami (w tym przypadku AKAP-Lbc i PDE4D3), dając fluorescencję w wyniku interakcji VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 i tworzenie funkcjonalnego białka fluorescencyjnego wewnątrz komórek.

BiFC dostarcza informacji na temat subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych i siły oddziaływań białkowych na podstawie intensywności fluorescencji. Jednak analiza BiFC z wykorzystaniem mikroskopii do ilościowego określenia siły interakcji białko-białko jest czasochłonna i nieco subiektywna ze względu na niejednorodność ekspresji i interakcji białek. Dzięki sprzężeniu analizy cytometrii przepływowej z metodologią BiFC, fluorescencyjny sygnał interakcji białko-białko BiFC może być dokładnie zmierzony dla dużej liczby komórek w krótkim czasie. Tutaj demonstrujemy zastosowanie tej metodologii do mapowania regionów w PDE4D3, które są wymagane do interakcji z AKAP-Lbc. Ta wysokoprzepustowa metodologia może być stosowana do badań przesiewowych czynników, które regulują interakcję białko-białko.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Szacuje się, że w ludzkim interaktomie istnieje < jove_content">650 000 interakcji białko-białko, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowych funkcji komórek 1,2. Oprócz koimmunoprecypitacji (co-IP), złotego standardu w badaniu interakcji białko-białko z lizatu komórkowego, opracowano kilka testów komplementacji fragmentów białek (PCA) w celu poprawy czułości wykrywania interakcji białko-białko wewnątrz komórek 3. Techniki obejmują transfer energii rezonansu Förstera (FRET), transfer energii rezonansu bioluminescencji (BRET) i dwucząsteczkową komplementację fluorescencji (BiFC) 4,5. BiFC opiera się na ułatwionym asocjacji dwóch fragmentów białka f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfekcja komórkowa

  1. Płytki komórkowe dzień przed transfekcją, posiewając mniej komórek w celu immunofluorescencji.
    1. Do immunofluorescencji: na płytce 6-dołkowej pokryć szkiełka nakrywkowe (1 na studzienkę) 0,02% żelatyny w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny, przemyć raz pożywką i dla każdej studzienki płytkę 1 x 105 komórek HEK 293T w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej [zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco plus 10% FBS].
    2. Do analiz metodą cytometrii przepływowej i Western blot: płytka 1,2 x 105 komórek HEK 293T/basenik w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej na płytce 6-dołkowej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstrukty AKAP-Lbc i PDE4D3 (Rysunek 1B) zostały połączone odpowiednio z fragmentami VN i VC. Interakcja AKAP-Lbc i PDE4D3 powoduje funkcjonalną fluorescencję YFP (ryc. 1A). W tym miejscu używamy metody BiFC do mapowania miejsc wiązania AKAP-Lbc w PDE4D3. Upstream conserved region 1 (UCR1), upstream conserved region 2 (UCR2) i region katalityczny (CAT) są konserwatywne wśród białek rodziny PDE4, dlatego do badania przesiewowego miejsca wiązania PDE4D3 do AKAP-Lbc użyto pełnej długości (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC jest prostą i czułą metodą badania interakcji białko-białko. Metoda ta nie może być stosowana do identyfikacji nowych oddziaływań białko-białko, jednak jest szczególnie wygodna do potwierdzania interakcji białko-białko wewnątrz komórek i badania właściwości funkcjonalnych; takie jak subkomórkowa lokalizacja kompleksów białkowych, mapowanie miejsc interakcji białko-białko oraz badania przesiewowe małych cząsteczek / peptydów, które mogą modulować interakcję białko-białko. Ponieważ fragmenty VN i VC są niefluorescency.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy laboratorium O'Bryana w UIC za krytyczną ocenę eksperymentalną i dyskusję. Praca ta była wspierana przez American Heart Association Grant 11SDG5230003 dla GKC oraz National Center for Advancing Translational Science - UIC Center for Clinical and Translational Sciences Grant UL1TR000050.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ODCZYNNIKI
Dulbecco’ s zmodyfikowany Orzeł’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycyna (pióro/paciorkowiec), 100xInvitrogen15070-063
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Invitrogen16000-044
Przeciwciało anty-FlagSigmaM2, F1804
Przeciwciało anty-HACovance16B12, MMS-101R
α-tubulinaSigmaDM1A, T9026
Przeciwciało anty-GFPClontech632569
Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe hodowle tkankowe poddane działaniu ThermoFisher Scientific130184
Komórki HEK 293TATCCCRL-11268
Zestaw do oczyszczania plazmidu Maxiprep, szybkiQiagen12663
Dulbecco’ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), sterylna 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v)Gibco25300
Polistyrenowe rurki okrągłodenne do barwienia FACSBD Biosciences352052
ParaformaldehydFisher ScientificS74337MF
Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPIInvitrogenP-36931
Szkiełka mikroskopowe Superfrost plusFisher Scientific12-550-15
Szkło osłonowe premiumFisherfinest Fisher Scientific12-548-5P
EQUIPMENTCO
2 inkubator z płaszczem powietrznymNuAIR DH autoflow
Mikroskop konfokalny LSM510 METACarl Zeiss, Inc
Jednostka do elektroforezy i transferuBiorad
Cyan ADP Cytometr przepływowyBeckman Coulter

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

Related Articles