Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wśród metod badania interakcji białko-białko wewnątrz komórek, Bimolekularna Komplementacja Fluorescencyjna (BiFC) jest stosunkowo prosta i czuła. BiFC opiera się na wytwarzaniu fluorescencji przy użyciu dwóch niefluorescencyjnych fragmentów białka fluorescencyjnego (stosuje się tutaj Venus, wariant białka żółtej fluorescencji). Niefluorescencyjne fragmenty Wenus (VN i VC) są łączone z dwoma oddziałującymi białkami (w tym przypadku AKAP-Lbc i PDE4D3), dając fluorescencję w wyniku interakcji VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 i tworzenie funkcjonalnego białka fluorescencyjnego wewnątrz komórek.
BiFC dostarcza informacji na temat subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych i siły oddziaływań białkowych na podstawie intensywności fluorescencji. Jednak analiza BiFC z wykorzystaniem mikroskopii do ilościowego określenia siły interakcji białko-białko jest czasochłonna i nieco subiektywna ze względu na niejednorodność ekspresji i interakcji białek. Dzięki sprzężeniu analizy cytometrii przepływowej z metodologią BiFC, fluorescencyjny sygnał interakcji białko-białko BiFC może być dokładnie zmierzony dla dużej liczby komórek w krótkim czasie. Tutaj demonstrujemy zastosowanie tej metodologii do mapowania regionów w PDE4D3, które są wymagane do interakcji z AKAP-Lbc. Ta wysokoprzepustowa metodologia może być stosowana do badań przesiewowych czynników, które regulują interakcję białko-białko.
Wprowadzenie
Szacuje się, że w ludzkim interaktomie istnieje < jove_content">650 000 interakcji białko-białko, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowych funkcji komórek 1,2. Oprócz koimmunoprecypitacji (co-IP), złotego standardu w badaniu interakcji białko-białko z lizatu komórkowego, opracowano kilka testów komplementacji fragmentów białek (PCA) w celu poprawy czułości wykrywania interakcji białko-białko wewnątrz komórek 3. Techniki obejmują transfer energii rezonansu Förstera (FRET), transfer energii rezonansu bioluminescencji (BRET) i dwucząsteczkową komplementację fluorescencji (BiFC) 4,5. BiFC opiera się na ułatwionym asocjacji dwóch fragmentów białka fluorescencyjnego (tutaj używamy Venus; wariantu YFP), z których każdy jest połączony z potencjalnym oddziałującym partnerem białkowym (w tym przykładzie używamy AKAP-Lbc i PDE4D3). Interakcja dwóch interesujących białek wewnątrz komórek powoduje funkcjonalną fluorescencję, którą można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu żywych lub utrwalonych komórek 6,7,8. W porównaniu z innymi PCA, BiFC jest czuły i mniej wymagający technicznie, z potencjałem do badania lokalizacji komórkowej w żywych komórkach. Główną wadą tej techniki jest jednak to, że raz utworzonego kompleksu białek fluorescencyjnych nie można odwrócić. Dlatego nie jest to dobra metoda do badania dynamicznej interakcji białko-białko. W tym artykule używamy BiFC do mapowania miejsc interakcji PDE4D3 z AKAP-Lbc poprzez monitorowanie intensywności fluorescencji Wenus. W porównaniu z tradycyjną analizą przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, która jest czasochłonna i pracochłonna (jeśli nie jest przeprowadzana przy użyciu zautomatyzowanych maszyn o wysokiej przepustowości), cytometria przepływowa zapewnia prostą analizę ilościową tysięcy komórek w niejednorodnej populacji w krótkim czasie 9,10. Tutaj, przeprowadzając bezpośrednie porównanie analizy cytometrii przepływowej-BiFC i tradycyjnego co-IP, pokazujemy, że te dwie metody dostarczają porównywalnych danych, jednak analiza BiFC metodą cytometrii przepływowej jest mniej czasochłonna i zużywa mniej materiału, co może być bardziej przydatne, gdy komórki będące przedmiotem zainteresowania są ograniczone.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Transfekcja komórkowa
- Płytki komórkowe dzień przed transfekcją, posiewając mniej komórek w celu immunofluorescencji.
- Do immunofluorescencji: na płytce 6-dołkowej pokryć szkiełka nakrywkowe (1 na studzienkę) 0,02% żelatyny w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny, przemyć raz pożywką i dla każdej studzienki płytkę 1 x 105 komórek HEK 293T w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej [zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco plus 10% FBS].
- Do analiz metodą cytometrii przepływowej i Western blot: płytka 1,2 x 105 komórek HEK 293T/basenik w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej na płytce 6-dołkowej (0,3 x 105 komórek HEK 293T w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej na basenie na płytce 24-dołkowej).
- Przygotuj DNA do transfekcji zgodnie z protokołem producenta: Effecten (Qiagen) jest używany do immunofluorescencji. TransIT-LT1 (Mirus) jest używany do analizy metodą cytometrii przepływowej i Western blot. Ilość użytego DNA jest podana poniżej.
Płytka 24-dołkowa (ng)
Płytka 6-dołkowa (ng)
Wektor CFP
10
50 Rozdział
VN N-AKAP-Lbc
200 szt.
1000 szt.
VC N-PDE4D3-FL (PDE4D3 o pełnej długości)
2,5, 5, 10, 20, 40, 80
100 szt.
VC N-PDE4D3-UCR1 (N-końcowy fragment PDE4D3 zawierający domenę UCR1)
100 szt.
VC N-PDE4D3-UCR2+CAT (fragment C-końcowy PDE4D3 zawierający UCR2 i domeny katalityczne)
100 szt.
Transfekcja przy użyciu Effectenu (6-dołkowego):
- Dodać wskazaną ilość plazmidowego DNA + 4 μl wzmacniacza do 100 μl buforu EC, wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 5 μl efektenu, wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodawaj kroplami do komórek.
- Dodać wskazaną ilość plazmidowego DNA do 250 μl/50 μl pożywki bez surowicy Opti-MEM I w sterylnej probówce.
- Dodaj odczynnik TransIT-LT1 do rozcieńczonej mieszaniny DNA i delikatnie odpipetuj do mieszania. (Stosunek odczynnika TransIT-LT1 do DNA wynosi 3 μl odczynnika TransIT-LT1 na 1 μg DNA).
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i dodawać kroplami do komórek.
2. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej, Western Blot i immunofluorescencji
- 24 godziny po transfekcji, sprawdź fluorescencję pod mikroskopem epifluorescencyjnym przed pobraniem komórek.
- Przygotowanie komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej:
- Umyj komórki 0,5 ml/2 ml lodowatego PBS dla płytek 24-dołkowych/6-dołkowych.
- Odłącz komórki za pomocą 50 μl/250 μl 0,05% trypsyny.
- Zneutralizować trypsynę za pomocą 200 μl/1 ml pożywki DMEM.
- Zebrać 250 μl komórek (zarówno dla płytki 24-dołkowej, jak i 6-dołkowej) przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, pozostałe komórki (1 ml) wykorzystać do analizy Western blot.
- Zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 250 μl [PBS + 0,5% (w/v) BSA + 2 mM EDTA], przechowywać na lodzie do analizy cytometrycznej przepływowej. Komórki można również utrwalić w 1% paraformaldehydzie (w PBS), jeśli analiza cytometrii przepływowej nie będzie natychmiastowa.
- Przygotowanie komórek do analizy Western blot: przeprowadzane równolegle z przygotowaniem komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej.
- Umyj komórki 1x 2 ml lodowatego PBS, lizuj komórki, dodając 100 μl buforu do lizy komórek [10 mM bufor fosforanu sodu, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100].
- Zebrać lizat komórkowy przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C.
- Określ ilościowo stężenie białka za pomocą testu białka Bradforda, załaduj równe ilości białka na linię dla SDS-PAGE i przenieś do nitrocelulozy w celu immunoblottingu.
- Przygotowanie komórek do immunofluorescencji.
- Przepłukać komórki 3x 2 ml PBS, utrwalić komórki w 1 ml 3,7% paraformaldehydu (w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3x 2 ml PBS przez 5 min.
- Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą medium montażowego. W razie potrzeby uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci.
- Przed badaniem przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.
3. Cytometria przepływowa i mikroskopia immunofluorescencyjna
- Cytometria przepływowa jest wykonywana przy użyciu cyjanowego ADP Beckman Coulter, wyposażonego w lasery na ciele stałym o długości fali 488 nm, 405 nm i 642 nm. Oprogramowanie Summit służy do akwizycji i analizy.
- Skalibruj cytometr przepływowy za pomocą standardowych kulek.
- Wykreśl rozproszenie do przodu (FSC)/rozproszenie boczne (SSC) na skali liniowej do bramkowania populacji żywych komórek.
- Wykreślić szerokość impulsu FSC/napięcia dla bramkowania niezagregowanej populacji żywych komórek.
- Wykreślić liczbę/FL6 (fluorescencja CFP, 405 nm) na skali logarytmicznej do bramkowania niezagregowanych żywych komórek CFP-dodatnich.
- Wykreślić liczbę/FL1 (fluorescencja YFP, 488 nm) w skali logarytmicznej dla intensywności BiFC.
- Uruchom YFP-CFP- podwójnie ujemne próbki, dostosuj napięcie lampy fotopowielacza FSC, SSC, FL1 i FL6 (PMT), aby ustawić próg dla każdego sygnału.
- Uruchom pojedyncze próbki dodatnie (zarówno YFP+, jak i CFP+) w celu przyszłej kompensacji off-line
- Uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń bramkowanych (niezagregowanych żywych komórek CFP+) do analizy.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna wykonywana jest przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510. Uwaga: ważne jest, aby wszystkie ustawienia (takie jak powiększenie, otwórka, wzmocnienie detektora, przesunięcie wzmacniacza, rozmiar klatki, prędkość skanowania, średnia skanowania i moc lasera) były spójne między próbkami, aby zapewnić prawidłowe porównanie wszystkich danych.
4. Analiza danych (wykonana za pomocą oprogramowania Summit)
- Skonfiguruj protokół analizy podobny do tego do akwizycji z odpowiednim bramkowaniem:
Bramka 1 na wykresie punktowym FSC/SSC dla żywych komórek.
Bramka 2 w FSC/szerokość impulsu bramki 1 dla niezagregowanych komórek pod napięciem.
Bramka 3 w liczbie/CFP bramki 3 dla niezagregowanych żywych komórek CFP+. - Kompensuj sygnał YFP i CFP za pomocą pojedynczych dodatnich komórek YFP+ i CFP+.
- Ponownie określ linie odcięcia dla komórek CFP/YFP-dodatnich.
- Eksportuj średnią intensywność fluorescencji (MFI) komórek CFP+ YFP do programu Excel w celu wykreślenia danych.
- Znormalizuj YFP MFI do poziomów ekspresji AKAP-Lbc, PDE4D3 i kontroli obciążenia α-tubuliny, zgodnie z Western blot.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Konstrukcje AKAP-Lbc i PDE4D3 (Ryc. 1B) połączono odpowiednio z fragmentami VN i VC. Interakcja AKAP-Lbc i PDE4D3 skutkuje funkcjonalną fluorescencją YFP (Ryc. 1A). W niniejszej pracy wykorzystujemy metodę BiFC do mapowania miejsc wiązania AKAP-Lbc w PDE4D3. Region zachowany 1 w górze strumienia (UCR1), region zachowany 2 w górze strumienia (UCR2) oraz region katalityczny (CAT) są konserwatywne wśród białek rodziny PDE4, dlatego do przesiewania miejsc wiązania PDE4D3 z AKAP-Lbc wykorzyst...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
BiFC jest prostą i czułą metodą badania interakcji białko-białko. Metoda ta nie może być stosowana do identyfikacji nowych oddziaływań białko-białko, jednak jest szczególnie wygodna do potwierdzania interakcji białko-białko wewnątrz komórek i badania właściwości funkcjonalnych; takie jak subkomórkowa lokalizacja kompleksów białkowych, mapowanie miejsc interakcji białko-białko oraz badania przesiewowe małych cząsteczek / peptydów, które mogą modulować interakcję białko-białko. Ponieważ fragmenty VN i VC są niefluorescency...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy laboratorium O'Bryana w UIC za krytyczną ocenę eksperymentalną i dyskusję. Praca ta była wspierana przez American Heart Association Grant 11SDG5230003 dla GKC oraz National Center for Advancing Translational Science - UIC Center for Clinical and Translational Sciences Grant UL1TR000050.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Dulbecco’ s zmodyfikowany Orzeł’ s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycyna (pióro/paciorkowiec), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Przeciwciało anty-Flag | Sigma | M2, F1804 | |
| Przeciwciało anty-HA | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulina | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Przeciwciało anty-GFP | Clontech | 632569 | |
| Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe hodowle tkankowe poddane działaniu Thermo | Fisher Scientific | 130184 | |
| Komórki HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| Zestaw do oczyszczania plazmidu Maxiprep, szybki | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), sterylna 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polistyrenowe rurki okrągłodenne do barwienia FACS | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Szkło osłonowe premium | Fisherfinest Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENTCO | |||
| 2 inkubator z płaszczem powietrznym | NuAIR DH autoflow | ||
| Mikroskop konfokalny LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Jednostka do elektroforezy i transferu | Biorad | ||
| Cyan ADP Cytometr przepływowy | Beckman Coulter |
Bibliografia
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
