Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Podsumowanie

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych ¹⁵N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Streszczenie

Mikrodomeny błony plazmatycznej są cechami opartymi na fizycznych właściwościach środowiska lipidów i steroli i odgrywają szczególną rolę w procesach sygnalizacyjnych. Ekstrakcja mikrodomen błonowych wzbogaconych w sterole z komórek roślinnych do analizy proteomicznej jest trudnym zadaniem, głównie ze względu na wiele etapów przygotowania i źródeł zanieczyszczeń z innych przedziałów komórkowych. Błona plazmatyczna stanowi tylko około 5-20% wszystkich błon w komórce roślinnej, dlatego izolacja wysoko oczyszczonej frakcji błony plazmatycznej jest wyzwaniem. Często stosowana metoda polega na wodnym dwufazowym rozdzielaniu w glikolu polietylenowym i dekstranie, w wyniku czego powstają pęcherzyki błony komórkowej o czystości 95%¹. Bogate w sterol mikrodomeny błonowe w błonie plazmatycznej są nierozpuszczalne po potraktowaniu zimnymi niejonowymi detergentami o zasadowym pH. Tę odporną na detergenty frakcję membranową można oddzielić od błony plazmatycznej przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy ². Następnie białka można wyekstrahować z pasma o niskiej gęstości gradientu sacharozy przez wytrącanie metanolu/chloroformu. Wyekstrahowane białko zostanie następnie strawione trypsyną, odsolone i ostatecznie przeanalizowane przez LC-MS/MS. Nasz protokół ekstrakcji mikrodomen bogatych w sterole jest zoptymalizowany pod kątem przygotowania czystych, odpornych na detergenty frakcji membranowych z kultur komórkowych Arabidopsis thaliana.

Używamy pełnego znakowania metabolicznego kultur komórkowych zawiesiny Arabidopsis thaliana z K¹⁵NO₃ jako jedynego źródła azotu do ilościowych porównawczych badań proteomicznych po leczeniu biologicznym będącym przedmiotem zainteresowania ³. Mieszając równe proporcje znakowanych i nieznakowanych kultur komórkowych w celu ekstrakcji białek stawowych, wpływ etapów przygotowania na końcowy wynik ilościowy jest ograniczony do minimum. Również utrata materiału podczas ekstrakcji wpłynie w ten sam sposób zarówno na próbki kontrolne, jak i poddane zabiegowi, a zatem stosunek peptydu lekkiego i ciężkiego pozostanie stały. W proponowanej metodzie znakowana lub nieznakowana hodowla komórkowa jest poddawana biologicznej obróbce, podczas gdy druga służy jako kontrola ⁴.

Wprowadzenie

W 1972 roku Jonathan Singer i Garth Nicolson zaproponowali model płynnej mozaiki jako model struktury błon komórkowych, zastępując model kanapkowy białko-lipid-białko, który był ogólnie akceptowany na początku lat 60. Singer i Nicolson postulowali, że błonę biologiczną można uznać za dwuwymiarową ciecz, w której wszystkie cząsteczki lipidów i białek dyfundują swobodnie i łatwo ⁵. Od tego czasu model budowy błony plazmatycznej i wiedza na temat składu błony stały się jeszcze bardziej złożone. W szczególności w błonie komórkowej można zaobserwować struktury takie jak kompleksy białkowe i strukturalnie nieuporządkowane mikrodomeny oparte na lipidach/sterolach. W sztucznych błonach modelowych ^6,7 sterole i sfingolipidy mogą poprzecznie oddzielać się od innych gatunków lipidów, tworząc regiony o zmienionych cechach fizycznych. Ta segregacja w błonie komórkowej jest spowodowana głównie właściwościami samoasocjacyjnymi między sterolami a silnie nasyconymi łańcuchami węglowodorowymi fosho- i sfingolipidów ⁸. W szczególności sztywne pierścienie sterolowe sprzyjają interakcjom ze sztywniejszymi i prostszymi nasyconymi gatunkami lipidów, a interakcje te zmuszają sąsiednie łańcuchy węglowodorowe do bardziej rozszerzonych konformacji, zwiększając grubość i twardość membrany.

Jedną z powszechnie obserwowanych cech mikrodomen membranowych wzbogaconych sterolami była ich nierozpuszczalność po leczeniu niejonowymi detergentami, takimi jak Triton X-100 czy Brij 35. Uważano, że frakcje te są identyczne z mikrodomenami membranowymi i nazwano je membranami odpornymi na detergenty (DRM) w oparciu o ich biochemiczną metodę przygotowania ². Stosowanie niejonowych detergentów podczas ekstrakcji DRM spotkało się z pewną krytyką, ponieważ biochemiczny preparat DRM może nie odpowiadać bezpośrednio żadnemu konkretnemu przedziałowi błonowemu w żywej komórce ⁹. W szczególności stosunek detergentu do białka wydaje się kluczowy w takich preparatach, ponieważ różne detergenty, a także różne ilości detergentów mogą dawać różny skład frakcji membranowej odpornej na detergenty ¹⁰. Istnieją jednak dowody na to, że poszczególne gatunki białek specyficznie wiążą się z tymi bogatymi w sterole komórkowymi domenami błonowymi i że białka te są dobrze wzbogacone w biochemiczne preparaty frakcji membranowych odpornych na detergenty ¹¹. Rdzeniem białek, które znaleziono we frakcji roślinnej DRM, a dla których obecność w DRM była zależna od steroli, były w szczególności białka zakotwiczone w GPI, takie jak fasciclinopodobne białka arabinogalaktanu (FLA) i członkowie rodziny białek SKU. Znaleziono również pewne białka sygnałowe, takie jak kinazy receptoropodobne lub fosfolipazy ¹¹. Wyniki te są zgodne z wieloma badaniami proteomicznymi dotyczącymi mikrodomen błonowych ssaków ^12,13. Również w przypadku roślin istnieje coraz więcej dowodów na rolę mikrodomen błonowych w kontekście reakcji na stres ^14-16.

Opisany tutaj protokół zapewnia solidną metodę frakcjonowania mikrodomen błony plazmatycznej i szczególnie wykorzystuje stężenie białka do detergentu, co pozwala nam zobrazować wywołane stresem zmiany w przedziale membranowym bogatym w sterole ^4,11,14.

Protokół

PROCEDURA

Powszechnie używane odczynniki i w protokole ekstrakcji:

1. Pożywka JPL do hodowli zawiesinowych rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana)
   • 3 μM H₃BO₃
   • 3 μM MnSO₄ x H₂O
   • 1,1 μM ZnSO₄ x 7 H₂O
   • 0,15 μM KJ
   • 0,03 μM Na₂MoO₄ x 2 H₂O
   • 3 nM CoCl₂ x 6 H₂O
   • 3 nM CuSO₄ x 5 H₂O
   • 0,9 mM CaCl₂ x 2 H₂O
   • 0,5 mM MgSO,₄ x 7_H2O
   • 0,5 μM FeSO₄ x 7 H₂O
   • 0,5 μM Na₂EDTA x 2 H₂O
   • 0,12 μM chlorowodorek tiaminy
   • 0,16 μM kwasu nikotynowego
   • 0,097 μM chlorowodorek pirydoksyny
   • 0,107 μM NAA
   • 0,375 mM KH₂PO₄
   • 0,061 mM NaH₂PO₄ x 2 H₂O
   • 0,039 mM na₂HPO₄
   • 0,027 mM glicyny
   • 0,56 mM mio-inozytol
   • 1,5% sacharozy
   • 10 mM K¹⁴NO₃ lub 10 mM K¹⁵NO₃

UWAGA: pH podłoża JPL powinno być dostosowane do 5,7 za pomocą KOH. Pożywka musi być wysterylizowana przez filtrację lub autoklawowanie przed użyciem.

2. Bufor H
   • 100 mM HEPES-KOH (pH 7,5)
   • 250 mM sacharozy
   • 10% (w/v) glicerol
   • 5 mM EDTA
   • 5 mM kwas askorbinowy
   • 0,6% (w/v) PVP K-25 lub K-30
   • 5 mM naziemna telewizja cyfrowa (dodaj świeżą)
   • 1 mM PMSF (dodaj świeży)
   • Inhibitory proteazy i fosfatazy (dodać świeże)
     • 50 mM NaF
     • 1 mM Na₃VO₄
     • 1 mM benzamidyny
     • 0,3 μM mikrocystyny
     • 4 μM leupeptyna
     • koktajl inhibitorów proteazy
3. Bufor R
   • 5 mM fosforanu potasu
   • 0,33 M sacharoza
   • 3 mM KCl
   • 0,1 mM EDTA
   • 1 mM DTT (dodaj świeże)
4. Bufor TNE
   • 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
   • 150 mM NaCl
   • 5 mM EDTA
5. System dwufazowy (system 6 g jest odpowiedni dla maksymalnie 15 g świeżej próbki) Metoda przygotowania
   W 15 ml tubie Falcon wymieszaj składniki wymienione poniżej i dokładnie wymieszaj:
   • 20% (w/w) dekstran T500 - 2,6 g
   • 40% (w/w) poli(glikol etylenowy) (PEG 3350) - 1,3 g
   • sacharoza - 0.678 g
   • 0,2 M Fosforan potasu, pH 7,8 - 0,15 ml
   • 2 M KCl - 0,014 ml
   • Dodawać wodę, aż całkowita masa układu dwufazowego wyniesie 6 g.
6. Roztwory sacharozy w buforze TNE
   • 2,4 m, 1,6 m, 1,4 m, 0,15 m
7. Odczynniki do trawienia trypsyny
   • UTU: 6 M mocznik, 2 M tiomocznik (pH 8,0 z 10 mM Tris-HCl)
   • Bufor redukcyjny (1 μg/μl naziemnej telewizji cyfrowej w wodzie; 6,5 mM)
   • Bufor alkilowacyjny (5 μg/μl jodoacetamidu w wodzie; 27 mM)
   • Endopeptydaza LysC (0,5 μg/μl)
   • Trypsyna o zmodyfikowanym stopniu sekwencjonowania (0,4 μg/μl)
8. Odczynniki do odsalania peptydów powyżej C₁₈
   • roztwór do ponownego zaparowania: 2% kwas trifluorooctowy (TFA), 5% acetonitryl w wodzie
   • roztwór A: 0,5% kwas octowy
   • roztwór B: 80% acetonitrylu, 0,5% kwasu octowego
9. Odczynniki do wzbogacania fosfopeptydów
   • Roztwór A: 0,1% TFA, 5% acetonitrylu
   • Roztwór B: 0,1% TFA, 80% acetonitryl
   • TiO₂ 10 μm
   • Amoniak (podstawowy 25% roztwór)
   • Piperydyna (zapas 100%)

PROTOKOŁY

1. Metaboliczne znakowanie kultur zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

1. Hodować kultury zawiesinowe komórek Arabidopsis Col-0 pochodzące z liści ¹⁷ w pełnym ¹⁴pożywce N-JPL (¹⁸; patrz sekcja "Popularne odczynniki i") i jeden zestaw kultur w ¹⁵pożywkach N-JPL w sterylnej kolbie w stałych warunkach oświetleniowych przy 80 do 100 μmol/m²s, 23 °C, pod ciągłym wytrząsaniem przy 120 obr./min.
2. Aby utrzymać hodowle komórkowe, należy zaszczepić 400 ml świeżej pożywki JPL 40 ml siedmiodniowych kultur komórkowych w kolbach o pojemności 1 l.
3. Zbiór kultur komórkowych odbywa się poprzez odsysanie próżniowe przez szeroki szklany lejek z siatką ze stali nierdzewnej. Komórki gromadzą się na płycie siatkowej oraz w lejku i stamtąd można je łatwo zebrać. Zaleca się zamrożenie komórek w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie przed zmieleniem.

UWAGA: Dla ¹⁵N metabolicznie znakowanych kultur komórkowych używaj K¹⁵NO₃ jako jedynego źródła azotu przez co najmniej dwa przejścia przez dwa tygodnie ¹⁹. W eksperymentach dotyczących proteomiki porównawczej należy użyć kultury komórkowej znakowanej ¹⁵N, a także utrzymywać nieznakowaną hodowlę w normalnym środowisku. Leczenie biologiczne zostanie następnie zastosowane do kultury znakowanej lub nieoznakowanej, podczas gdy druga służy jako kontrola (ryc. 1). W celu przygotowania białka obie kultury zostaną połączone ²⁰. Planując konfigurację eksperymentalną, zalecamy rozważenie konfiguracji wzajemnego znakowania ⁴, w której ten sam zabieg jest stosowany raz do ¹⁵komórek znakowanych N i raz do komórek nieznakowanych, a odpowiednie nieznakowane lub ¹⁵komórek znakowanych N służy jako kontrole. W takim przypadku potrzebne są podwójne ilości kultur komórkowych.

2. Oczyszczanie błony plazmatycznej

UWAGA: Wszystkie dalsze kroki są wykonywane w chłodni i/lub na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Homogenizować komórki z około 1 l 7-dniowych kultur zawiesinowych komórek w ciekłym azocie. Materiał może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania.
2. Wymieszać te same ilości znakowanych i nieznakowanych zamrożonych kultur komórkowych w oparciu o świeżą masę w zlewce i natychmiast dodać 2 objętości buforu H. W przypadku preparatu mikrodomen błonowych sugeruje się użycie co najmniej 7 g świeżej masy zarówno znakowanych, jak i nieznakowanych komórek.
3. Umieść zlewkę na shakerze i potrząsaj, aż materiał się rozpuści, a roztwór będzie płynny i bez kryształków lodu.
4. Przefiltrować homogenat przez jedną warstwę Miracloth do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
5. Zrównoważyć próbki buforem H i odwirować przy 10 000 x g przez 8 minut.
6. Załadować supernatant do wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych (np. do rotora Beckman Coulter SW31Ti) o objętości około 32 ml
7. Zrównoważyć próbki buforem H i zagnieździć mikrosomy przez odwirowanie w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy użyciu rotora Beckman SW32Ti.
8. Usunąć supernatant po odwirowaniu.

UWAGA: Supernatant zawiera rozpuszczalne białka. Niewielka ilość tej frakcji może zostać zachowana do dalszego wytrącania białek, a następnie analizy również białek rozpuszczalnych.

9. Zawiesić osad membrany z każdej próbki w odpowiedniej ilości buforu R i załadować na wierzch systemu dwufazowego U1 (rysunek 2). W przypadku stosowania systemu dwufazowego o masie 6 g należy załadować dokładnie 2 g zawieszonych granulek membrany.

UWAGA: Ostateczna objętość bufora R zależy od wielkości systemu dwufazowego, który ma być używany (~1,6 ml buforu R jest potrzebne przy użyciu systemu 6 g). Zaleca się użycie mniejszej ilości buforu do ponownego zawieszenia, aby czysty bufor mógł zostać dodany do systemu dwufazowego w celu uzyskania wymaganej masy, zamiast używania zbyt dużej ilości buforu do solubilizacji i niemożności załadowania całej próbki do układu dwufazowego.

10. Załadować taką samą objętość czystego buforu R, jaka jest używana do ponownego zawieszenia próbki na U2.
11. Powoli mieszaj rurki U1 i U2, odwracając je 30x (około 1 inwersji/s).

UWAGA: Nie potrząsaj energicznie systemem dwufazowym. Może to powodować brak separacji faz na etapie ultrawirowania.

12. Odwirować próbki w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
13. Usunąć supernatant po odwirowaniu.
14. Przenieść górną fazę z U1 do U2 i powtórzyć wirowanie przy 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
15. Przenieś górną fazę z U2 do probówek ultrawirówek SW41Ti i rozcieńcz ją pięcioma objętościami buforu R i dokładnie wymieszaj.

UWAGA: Ostatnia górna faza może wymagać podzielenia na oddzielne probówki ultrawirówek, zanim będzie można ją rozcieńczyć pięć razy.

16. Odwirować próbki o masie 200 000 x g w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę za pomocą wirnika SW41Ti.
17. Zawiesić osad membranowy w niewielkiej ilości buforu TNE (zwykle stosuje się 200 μl buforu) w celu odizolowania membran odpornych na detergenty.

UWAGA: Niewielka ilość tej frakcji może być zachowana do analizy niefrakcjonowanej błony plazmatycznej.

UWAGA: Frakcja błony plazmatycznej może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc przed frakcjonowaniem na membrany odporne na detergenty i frakcje rozpuszczalne w detergentach.

3. Przygotowanie membrany odpornej na detergenty

1. Sprawdź stężenie frakcji błony plazmatycznej za pomocą testu Bradforda.
2. Dodaj Triton X-100 do frakcji błony plazmatycznej. Końcowe stężenie detergentu powinno mieścić się w granicach 0,5-1%. Stosunek masy detergentu do białka powinien utrzymywać się na poziomie 13-15.
3. Wytrząsać próbki z prędkością około 100 obr./min w temperaturze 4 °C przez 30 min.
4. Dodać trzy objętości 2,4 M sacharozy do jednej objętości błony plazmatycznej poddanej działaniu substancji, aby uzyskać 1,8 M końcowe stężenie sacharozy.
5. Przygotować gradient sacharozy w probówkach ultrawirówek SW41Ti, ładując odpowiednie roztwory sacharozy na frakcję 1,8 M, jak pokazano na rysunku 3.
6. Odwirować próbki przy 250 000 x g w temperaturze 4 °C przez 18 godzin za pomocą rotora Beckman SW41Ti.
7. Ostrożnie wyjąć probówki ultrawirówek z wirnika, aby uniknąć zakłócenia pasma o niskiej gęstości, które może być widoczne jako mleczny pierścień na granicy faz sacharozy 0,15 M/1,4 M. Czasami nic nie widać, ale frakcja nadal zawiera frakcję białka odporną na detergenty.
8. Usuń frakcję o objętości 0,75 ml z górnej części gradientu. Frakcje 2 i 3, które zajmują objętość około 1,5 ml powyżej pierścienia międzyfazowego i 0,5 ml poniżej, reprezentują frakcję membranową odporną na detergenty. Zebrać te frakcje do 15 ml probówek Falcon. Frakcje 9 i 10 zawierają rozpuszczalną w detergentach frakcję membranową i mogą być również zbierane w celu porównania. Do dalszej analizy połącz frakcje 2 i 3 oraz frakcje 9 i 10.

4. Ekstrakcja białek z frakcji odpornej na detergenty za pomocą metanolu/chloroformu

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.

1. Do zebranych frakcji dodać 4 objętości metanolu i dokładnie wymieszać.
2. Dodaj 1 objętość chloroformu, dokładnie zmieszaj.
3. Dodaj 3 objętości wody, dokładnie wymieszaj.
4. Odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej (np. Eppendorf 5417R).
5. Usuń fazę wodną powyżej warstwy białka w interfazie.
6. Dodaj 3 objętości metanolu, dokładnie wymieszaj.
7. Odwirować próbki o masie 4 000 x g przez 10 minut.
8. Usunąć supernatant i wysuszyć osad. Wysuszony osad jest gotowy do mineralizacji w roztworze.

5. Trawienie trypsyny w roztworze

UWAGA: W tej procedurze wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, aby zredukować niepożądaną derywatyzację łańcuchów bocznych aminokwasów przez denaturanty.

1. Rozpuścić próbkę w małej objętości 6 M mocznika, 2 M timocznika o pH 8 (UTU). Użyć tak małej objętości, jaka jest zgodna z próbką (zwykle około 40 μl).
2. Próbki rozpuszczone w UTU w temperaturze 5 000 x g należy wirować w wirówce stołowej (np. Eppendorf 5417R) przez 10 minut, aby osadzać dowolny nierozpuszczalny materiał.
3. pH roztworu końcowego powinno być bliskie 8,0 dla optymalnego trawienia trypsyny. Sprawdź za pomocą pasków pH.
4. Dodać 1 μl buforu redukcyjnego na każde 50 μg białka próbki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

UWAGA: Konieczne jest tylko przybliżone oszacowanie zawartości białka. Gdy ilość próbki jest ograniczona, lepiej jest poświęcić dokładność, niż marnować próbkę na test białka.

5. Dodać 1 μl buforu alkilacyjnego na każde 50 μg białka próbki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
6. Dodać 0,5 μl LysC na 50 μg białka próbki i inkubować przez trzy godziny w temperaturze pokojowej z ciągłym wstrząsaniem przy prędkości 700 obr./min. W razie potrzeby trawienie można również przeprowadzić w nocy. Jednak dłuższy czas w wysokich temperaturach nie jest zalecany, ponieważ może zwiększyć utratę peptydów w wyniku adsorpcji na plastikowym materiale rurki w wodnych warunkach pH 8.
7. Rozcieńczyć próbkę czterema objętościami 10 mM Tris-HCl, pH 8.

UWAGA: Ten krok jest absolutnie konieczny do rozcieńczenia stężenia mocznika, ponieważ trypsyna jest bardzo wrażliwa na wysoką zawartość soli.

8. Dodać 1 μl trypsyny na 50 μg białka próbki i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej z ciągłym wstrząsaniem przy 700 obr./min.
9. Zakwasić próbki do końcowego stężenia 0,2% TFA, aby osiągnąć pH 2 (dodać około 1/10 objętości 2% kwasu trifluorooctowego).

UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia, ale lepiej jest przechowywać je na StageTips w temperaturze 4 °C, jeśli jest to krótki czas (jeden tydzień) lub przechowywać je po odsalaniu StageTips.

6. Produkcja końcówek C_18-StageTips

1. Umieść Empore Disk C18 na płaskiej, czystej powierzchni, takiej jak jednorazowa plastikowa szalka Petriego.
2. Wybij mały krążek za pomocą tępo zakończonej igły podskórnej o średnicy 1,5 mm. Krążek wbija się w igłę i można go przenieść do końcówki pipety.
3. Wypchnąć krążek z igły i zamocować go w zwężającym się zwężeniu końcówki pipety za pomocą kawałka stopionej krzemionki lub rurki łącznika po wewnętrznej stronie igły.

UWAGA: Końcówki StageTips mogą być przechowywane w suchym miejscu w temperaturze pokojowej ²¹.

7. Użycie C_18-StageTips do odsalania i zagęszczania peptydów

1. Kondycjonować końcówkę C_18-StageTip, umieszczając 50 μl roztworu B na przygotowanym dyszy StageTip. Obracać końcówkę w wirówce z prędkością 2 000 obr./min przez 2 minuty w wirówce stołowej (np. Eppendorf 5417R).

UWAGA: Użyj adapterów do obracania StageTips w wirówce Eppendorf, płyn zostanie zebrany w probówce reakcyjnej o pojemności 2 ml. W przypadku preparatów na większą skalę, końcówki stage można również umieścić w stojaku na końcówki z 96 z 200 μl, a płyn można zebrać na płytce do mikromiareczkowania.

UWAGA: Nigdy nie używaj wyższych prędkości niż 3 000 x g w wirówce stołowej (np. Eppendorf 5417R) ze względu na ryzyko wykręcenia się dysku C₁₈ z końcówki.

2. Zrównoważyć końcówkę StageTip za pomocą 100 μl roztworu A. Zawirować końcówkę w wirówce przy 5 000 x g w wirówce stołowej (np. Eppendorf 5417R).
3. Powtórz krok 2.
4. Załaduj próbkę na krążek, ostrożnie pipetując próbkę do końcówki pipety, tak aby krążek znajdował się w środku.

UWAGA: Jeden krążek może związać ok. 100 μg białka.

5. Obracać końcówki w wirówce, aż cała objętość próbki przejdzie przez krążek C₁₈.
6. Umyj końcówki StageTip dwa razy 100 μl roztworu A. Zakręć końcówki w wirówce.

UWAGA: Umyte i załadowane StageTips mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.

7. Usunąć próbkę z 40 μl roztworu B. Zebrać eluat w świeżej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
8. Zagęścić próbkę w próżni o wysokiej prędkości. W idealnych warunkach należy zatrzymać proces odwadniania, ponieważ pozostało tylko około 1 lub 2 μl płynu.

UWAGA: Suszone próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez lata.

9. Dodać końcową objętość 9 μl roztworu do resuspensji do próbki i przenieść ją na płytkę mikromiareczkową w celu analizy masy.

UWAGA: Ostateczna objętość użytego bufora do respensji zależy od potrzeb eksperymentatora i czułości użytego spektrometru masowego.

8. Alternatywny protokół wzbogacania fosfopeptydem

UWAGA: Do wzbogacania fosfopeptydem, ekstrakcja białek w kroku 2 musi być przeprowadzona w obecności inhibitorów fosfatazy.

UWAGA: Dokładne stężenie białka nie musi być określane w kolejnych krokach. Wystarczy z grubsza oszacować zawartość białka, aby uniknąć niepotrzebnej utraty próbki

1. Przygotuj C_8-StageTips (postępuj zgodnie z tym samym protokołem dla przygotowania C_18-StageTips w kroku 6).
2. Przenieś 1 mg 2-kulek TiO na wierzch przygotowanych końcówek C_8-StageTips (użyj 1 mg TiO₂ na 100 μg białka).
3. Zrównoważyć_końcówki TiO 2 ze 100 μl roztworu C, wirować z prędkością 2 000 x g przez 5 minut w wirówce stołowej (np. Eppendorf 5417R).
4. Zmieszać 100 μg strawionych i odsolonych peptydów z kroku 7.7 (powinno to być w 100 μl roztworu B) ze 100 μl roztworu A.
5. Załadować wymieszaną próbkę do zrównoważonych kolumn TiO₂; wirować z prędkością 1 000 x g, 5 min.
6. Zbierz przepływ i ponownie załaduj go na tę samą końcówkę (utrzymuj przepływ po drugim przejściu).
7. Przepłukać końcówkę 100 μl roztworu A; wirować z prędkością 2 000 x g, 5 minut w wirówce stołowej (np. Eppendorf 5417R).
8. Próbka elutu z 50 μl 5% amoniaku.
9. Próbkę eluować za pomocą 50 μl 5% piperydyny (obie eluaty można połączyć).
10. Natychmiast zakwasić próbkę przy użyciu 50 μl 20% kwasu fosforowego. pH powinno wynosić około 2.

UWAGA: Zachowaj końcówki TiO₂ i odzyskaj proszek. Można go umyć roztworem B i użyć ponownie przez jedną lub dwie kolejne rundy.

11. Ponownie odsolić zakwaszone próbki na końcówkach C₁₈ (patrz krok 8).

9. Analiza LC-MS/MS mieszanin peptydów

1. Zawiesić odsolone fosfopeptydy w buforze do resuspensji.
2. Załaduj ponownie zawieszoną próbkę do wybranego systemu LC-MS/MS i uzyskaj widma w trybie zależnym od danych w sugerowanej rozdzielczości 60 000 pełnych szerokości przy połowie maksimum.

UWAGA: Dla optymalnej fragmentacji, należy zastosować skanowanie neutralnej utraty ²², lub jeśli to możliwe, wielostopniową aktywację ²³. Jeśli ETD jest dostępny, umożliwi fragmentację szkieletu peptydowego bez utraty kwasu fosforowego ²⁴.

UWAGA: Listy pików z surowych danych muszą być wyodrębnione i przesłane do identyfikacji bazy danych, jak również do oceny ilościowej. W tym miejscu opisujemy ustawienia korzystania z Mascot i MSQuant, który działa dla plików surowych danych z instrumentów LTQ, LTQ-Orbitrap i LTQ-FT (Thermo Scientific).

3. Wyodrębnij listę szczytów za pomocą DTAsupercharge w menu "Helper" w MSQuant. Użyj ustawień domyślnych.
4. Prześlij wynikowy plik z listą szczytów do wyszukiwarki Mascot. Ustawienia krytyczne: tolerancja masy jonów prekursorowych 10 ppm, tolerancja masowa MS/MS 0,5 Da. Stałe modyfikacje: karbamidometylacja cystein, modyfikacje zmienne: utlenianie metioniny, fosforylacja seryny, treoniny, tyrozyny. Metoda oznaczania ilościowego: znakowanie ^{metaboliczne 15}N.
5. Zapisz wynik Mascot jako plik strony internetowej.
6. Załaduj plik wynikowy Mascot i plik RAW do MSQuant. Wybierz wszystkie interesujące Cię białka i uruchom "Automatyczne oznaczanie ilościowe". Program odczyta pełne widma skanowania z surowego pliku i dokona integracji pików dla znakowanych i nieznakowanych partnerów każdego peptydu.
7. Eksportuj wyniki kwantyfikacji do arkusza kalkulacyjnego lub do pliku tekstowego rozdzielanego tabulatorami. Dane można następnie przesłać do dalszej analizy statystycznej w Excelu lub za pomocą innych pakietów oprogramowania, takich jak Statquant ²⁵ lub cRacker ²⁶.

Wyniki

Dzięki przedstawionemu protokołowi z wykorzystaniem metabolicznie znakowanych kultur komórkowych Arabidopsis możliwe jest wyizolowanie błon plazmatycznych z tkanki roślinnej (krok 2, Rysunki 2 i 4) oraz wzbogacenie frakcji błon odpornych na detergenty w obrębie błony plazmatycznej (krok 3, Rysunki 3 i 5). Następnie protokół umożliwia ekstrakcję białek z tych frakcji błon odpornych na detergenty (krok 4) oraz trawienie białek w celu przeprowadzenia porównawczej analizy proteomicz...

Dyskusja

Protokół przedstawiony w tym artykule zawiera wiele etapów, z których wszystkie są kluczowe dla uzyskania czystego i reprezentatywnego frakcjonowania błony komórkowej rośliny na membrany odporne na detergenty i frakcje rozpuszczalne w detergentach. Dlatego ważne jest, aby postępować zgodnie z instrukcjami.

Traktowanie frakcji błony plazmatycznej detergentem niejonowym (krok 3.2) ma najsilniejszy wpływ na jakość frakcjonowania mikrodomen błonowych. Aby uzyskać powtarzalne wyniki dla różnych pre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
Chemicals zostały zamówione w Sigma-Aldrich, chyba że zaznaczono inaczej
: Amoniak (roztwór 25%)	WAKO	010-03166
TiO2 10 μ m	GL-Science	5020-75010
Empore Disk C18	Varian	12145004
Glikol polietylenowy(PEG 3350)	Sigma	88276
Dextran T500	Roth	9219.2
Trypsyna	Promega	V5113
Koktajl inhibitorów proteazy ()	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
EQUIPMENT
Optima L-80 XP Ultrawirówka	Beckman
Czytnik płytek	BioTek
EASY-nLC II nano-chromatograf cieczowy	Thermo Scientific
Spektrometr masowy LTQ-Orbitrap	Wirówka Thermo Scientific
5810R	Wirówka Eppendorf
5417R	Eppendorf
Thermomixer	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25	Christ
Shaker Unimax 2010	Heidolph