Nos ssaków to wielofunkcyjny organ o skomplikowanych strukturach wewnętrznych. Jama nosowa jest wyłożona różnymi nabłonkami, takimi jak nabłonek węchowy, oddechowy i płaskonabłonkowy, które różnią się znacznie lokalizacjami anatomicznymi, morfologią i funkcjami. U dorosłych myszy nos pokryty jest różnymi kośćmi czaszki, co ogranicza eksperymentalny dostęp do struktur wewnętrznych, zwłaszcza tych z tyłu, takich jak główny nabłonek węchowy (MOE). Tutaj opisujemy skuteczną metodę uzyskania prawie całych i nienaruszonych tkanek nosa z zachowaną organizacją anatomiczną. Za pomocą narzędzi chirurgicznych pod mikroskopem preparacyjnym sekwencyjnie usuwamy kości czaszki otaczające tkankę nosa. Zabieg ten można wykonać zarówno na utrwalonych paraformaldehydem, jak i świeżo wypreparowanych, oskórowanych głowach myszy. Cała procedura odkostniania trwa około 20-30 minut, czyli znacznie krócej niż czas doświadczalny wymagany w przypadku konwencjonalnego odwapniania chemicznego. Ponadto przedstawiamy łatwą metodę usuwania pęcherzyków powietrza uwięzionych między małżowinami, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania nienaruszonych cienkich odcinków poziomych, czołowych lub strzałkowych z preparatu tkanek nosa. Tkanka nosa przygotowana naszą metodą może być wykorzystana do obserwacji całego nabłonka, a także do badań morfologicznych, immunocytochemicznych, hybrydyzacji RNA in situ i fizjologicznych, zwłaszcza w badaniach, w których interesujące jest badanie i porównanie specyficzne dla regionu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną
* These authors contributed equally
W tym artykule
Streszczenie
Wprowadzenie
Jama nosowa ssaków zawiera różne rodzaje tkanek i narządów, które pełnią różne funkcje. Jama nosowa stanowi wejściową część górnych dróg oddechowych, która umożliwia przepływ powietrza do i z płuc. Wdychane powietrze przechodzi przez jamę nosową, gdzie jest poddawane kondycjonowaniu temperatury i wilgotności 1 oraz czyszczeniu lub filtrowaniu w celu usunięcia substancji drażniących i toksycznych oraz zakaźnych mikroorganizmów 2. Oba zabiegi są przeprowadzane przez nabłonek nosa i tkanki podnabłonkowe, w tym gruczoły i naczynia, i mają kluczowe znaczenie dla ochrony dolnych dróg oddechowych i płuc. Oprócz swojej roli w oddychaniu i obronie nab....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie nosa myszy
W badaniu wykorzystano dorosłe myszy w linii C57BL/6. Wszystkie procedury i opieka nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komisję Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Maryland, Baltimore County.
1.1 Pobieranie nosa z myszy utrwalonych w paraformaldehydzie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując tę metodę, możemy niezawodnie uzyskać niemal całkowicie nienaruszoną tkankę nosową. Rysunek 2A przedstawia obraz dorosłego preparatu nosowego z głowy utrwalonej w paraformaldehydzie. W tym preparacie wszystkie cztery podolfaktorowe organy zmysłów, w tym MOE, organ przegrody, zwoje Grüneberga oraz VNO, są nienaruszone. Zachowane są również nabłonki oddechowe oraz tkanki podnabłonkowe, takie jak gruczoły i naczynia. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w szeregu badań, w których analizowaliś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj zademonstrowaliśmy krok po kroku procedurę izolowania nienaruszonej tkanki węchowej i oddechowej z nosa myszy poprzez sekwencyjne usuwanie otaczających kości, oszczędzając tkankę poniżej. Pokazujemy, że staranne usunięcie kości może zachować nawet najdelikatniejsze tkanki w całości. Dzielimy się również spostrzeżeniami na temat możliwych modyfikacji tej techniki, w której izolujemy razem zarówno tkankę mózgu, jak i nosa, aby zachować połączenie nerwowe. Ta nowa metoda umożliwia izolowanie całych tkanek węchowych.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty badawcze (granty NIH/NIDCD 009269, 012831 i administracyjne uzupełnienie ARRA NIH) dla Weihong Lin. Szczególne podziękowania kierujemy do Pana Tima Forda z UMBC za jego pomoc techniczną w nagrywaniu i przetwarzaniu filmów. Pragniemy również podziękować dr Daphne Blumberg, pani Chere Petty z UMBC i panu Nicholasowi McCollumowi z Olympus America Inc. za ich pomoc sprzętową w filmowaniu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dissection | |||
| Rongeur, 1,0 mm Szerokość szczęk | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Szczypce precyzyjne, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Szczypce precyzyjne, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Szczypce precyzyjne, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Kleszczyki do próbek, Ząbkowane | nożyczki operacyjne VWR | 82027-440 | |
| WPI | 501753 | ||
| Nożyczki do irysów, prosty | Miltex | V95-304 | |
| Mikroskop preparacyjny | Olympus | SZ40 | |
| [nagłówek] | |||
| Osadzanie w tkankach | |||
| Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastikowa forma do zatapiania | VWR | 15160-215 | |
| Pompa próżniowa aspiratora | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [nagłówek] | |||
| Barwienie sekcji | |||
| czerwony | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Barwienie jąder |
Bibliografia
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
