Artykuł metodologiczny

Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną

37.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50538

⸱

10 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

* These authors contributed equally

W tym artykule

Streszczenie

Nos ssaków to wielofunkcyjny organ o skomplikowanych strukturach wewnętrznych. Jama nosowa jest wyłożona różnymi nabłonkami, takimi jak nabłonek węchowy, oddechowy i płaskonabłonkowy, które różnią się znacznie lokalizacjami anatomicznymi, morfologią i funkcjami. U dorosłych myszy nos pokryty jest różnymi kośćmi czaszki, co ogranicza eksperymentalny dostęp do struktur wewnętrznych, zwłaszcza tych z tyłu, takich jak główny nabłonek węchowy (MOE). Tutaj opisujemy skuteczną metodę uzyskania prawie całych i nienaruszonych tkanek nosa z zachowaną organizacją anatomiczną. Za pomocą narzędzi chirurgicznych pod mikroskopem preparacyjnym sekwencyjnie usuwamy kości czaszki otaczające tkankę nosa. Zabieg ten można wykonać zarówno na utrwalonych paraformaldehydem, jak i świeżo wypreparowanych, oskórowanych głowach myszy. Cała procedura odkostniania trwa około 20-30 minut, czyli znacznie krócej niż czas doświadczalny wymagany w przypadku konwencjonalnego odwapniania chemicznego. Ponadto przedstawiamy łatwą metodę usuwania pęcherzyków powietrza uwięzionych między małżowinami, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania nienaruszonych cienkich odcinków poziomych, czołowych lub strzałkowych z preparatu tkanek nosa. Tkanka nosa przygotowana naszą metodą może być wykorzystana do obserwacji całego nabłonka, a także do badań morfologicznych, immunocytochemicznych, hybrydyzacji RNA in situ i fizjologicznych, zwłaszcza w badaniach, w których interesujące jest badanie i porównanie specyficzne dla regionu.

Wprowadzenie

Jama nosowa ssaków zawiera różne rodzaje tkanek i narządów, które pełnią różne funkcje. Jama nosowa stanowi wejściową część górnych dróg oddechowych, która umożliwia przepływ powietrza do i z płuc. Wdychane powietrze przechodzi przez jamę nosową, gdzie jest poddawane kondycjonowaniu temperatury i wilgotności 1 oraz czyszczeniu lub filtrowaniu w celu usunięcia substancji drażniących i toksycznych oraz zakaźnych mikroorganizmów 2. Oba zabiegi są przeprowadzane przez nabłonek nosa i tkanki podnabłonkowe, w tym gruczoły i naczynia, i mają kluczowe znaczenie dla ochrony dolnych dróg oddechowych i płuc. Oprócz swojej roli w oddychaniu i obronie nabłonka, tkanka nosa zawiera również obwodowe aparaty czuciowe układu węchowego i trójdzielnego, które wykrywają szeroką gamę substancji chemicznych w przepływającym powietrzu. W zależności od tego, który system jest aktywowany, sensoryczne wykrywanie substancji chemicznych w nosie może wywołać zmysł węchu, podrażnienie lub ból 3,4.

Obwodowy układ węchowy jest złożony i składa się z kilku anatomicznie oddzielonych węchowych narządów czuciowych w jamie nosowej. Wśród nich największy jest główny nabłonek węchowy (MOE), który stanowi około 45-52% nabłonka nosa u gryzoni 5 i znajduje się w okolicy tylnej. W okolicy przednio-brzusznej znajduje się para rurkowatych struktur znanych jako narząd lemieszowo-nosowy 6, które znajdują się po obu stronach przegrody nosowej. Dwa dodatkowe małe grupy węchowych neuronów czuciowych, znane jako narząd przegrody Masera 7,8 i zwój Gruneberga 9, znajdują się odpowiednio wzdłuż przegrody brzusznej i grzbietowego obszaru wejściowego jamy nosowej. Te narządy obwodowe zawierają nabłonek nerwowy o charakterystycznych cechach morfologii, ekspresji markerów komórkowych i funkcji fizjologicznych. Razem wykrywają tysiące cząsteczek zapachowych z wyjątkową czułością 10-12.

Oprócz węchowych narządów zmysłów, w jamie nosowej znajdują się również inne systemy sensoryczne. Wiadomo, że peptydergiczne włókna nerwowe nerwu trójdzielnego są obecne w nabłonku nosa, zwłaszcza w nabłonku oddechowym 13,14. Niektóre z tych włókien wykrywają drażniące i toksyczne substancje chemiczne i są odpowiedzialne za inicjowanie odruchów ochronnych, takich jak kaszel i kichanie 4,15. Drażniące związki zapachowe i gorzkie mogą być również wykryte przez niedawno odkrytą populację samotnych komórek chemosensorycznych (SCC), z których wiele jest unerwionych przez włókna nerwowe nerwu trójdzielnego 16-19. Te SCC znajdują się w większej gęstości w obszarze wejściowym jamy nosowej i kanalików wlotowych lemieszowo-nosowych, co sugeruje, że mogą również pełnić funkcję ochronną 16-18. W związku z tym nabłonek nosa może znacznie różnić się funkcją, morfologią i składem komórek w zależności od ich lokalizacji anatomicznej.

Nawet w obrębie pojedynczego i wyspecjalizowanego nabłonka występują różnice regionalne. MOE jest jednym z takich przykładów. MOE wyściela różne małżowiny, które są skomplikowanymi i zwiniętymi strukturami. Z ich powodu różne regiony MOE doświadczają różnych natężeń przepływu powietrza, a tym samym różnych szybkości dyfuzji i usuwania cząsteczek zapachowych unoszących się w powietrzu 20. Wiadomo również, że węchowe neurony czuciowe (OSN) wyrażające dany receptor zapachowy znajdują się w jednej z czterech obwodanych stref MOE 21,22. W dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób ta różnica lokalizacji wpływa na reakcję OSN na substancje zapachowe. Ponadto niektóre populacje OSN wykazują preferencje regionalne. OSN eksprymujące cyklazę guanylylu-D (GC-D) mają rozkłady strefowe faworyzujące regiony ślepej uliczki ektoturbinatów 23,24. Niedawno znaleźliśmy subpopulację kanonicznych OSN, która wyraża przejściowy kanał potencjału receptora M5 (trpM5) i jest preferencyjnie zlokalizowana w regionach bocznych i brzusznych 25. Wyniki te wskazują, że MOE nie jest jednorodny. Jednak to, w jaki sposób te regionalne różnice wpływają na kodowanie węchowe, nie jest zrozumiałe. Dzieje się tak po części dlatego, że dokładne badania fizjologiczne MOE i nosa zostały ograniczone przez trudności w uzyskaniu nienaruszonego nabłonka nosa z zachowaną organizacją anatomiczną przy użyciu obecnych metod.

Nabłonek nosa jest głównie otoczony przez przednie kości czaszki, w tym kości nosowe, szczękowe, podniebienne, jarzmowe i sitowe. U dorosłych myszy i innych modeli gryzoni kości te są twarde i trudne do usunięcia bez uszkodzenia ściśle przylegającej tkanki nosowej, zwłaszcza delikatnych małżowin usznych. Często odwapnienie oparte na chemikaliach stosuje się w celu zmiękczenia kości, aby umożliwić kriosekcję tkanek nosa do badań morfologicznych, immunohistochemicznych i hybrydyzacji in situ; Jednak w zależności od wieku zwierzęcia proces odwapnienia może trwać przez noc do 7 dni 24,26-28. Zabieg ten jest również ograniczony, ponieważ wymaga zachowania utrwalacza tkanki. Ponadto chemiczne odwapnienie może być ostre i wpływać na znakowanie immunologiczne niektórych wrażliwych przeciwciał 29,30. Do badań fizjologicznych wymagana jest żywa tkanka, dlatego eksperymenty te są często przeprowadzane na izolowanych OSN lub wycinkach MOE uzyskanych od noworodków, których kości czaszki są cienkie i miękkie 17,31,32. W badaniach fizjologicznych można również wykorzystać całe preparaty do montażu poprzez rozszczepienie głowy 25,33,34, ale zwykle tylko przyśrodkowa powierzchnia nosa jest łatwo dostępna, co ogranicza zapisy fizjologiczne w innych obszarach.

Tutaj opisujemy skuteczną, ręczną metodę odkostniania w celu przygotowania nienaruszonych tkanek nosa z zachowaną oryginalną organizacją anatomiczną i morfologią. Sekwencyjnie usuwamy główne kości przedniej części czaszki pod mikroskopem preparacyjnym, aby odsłonić prawie całkowicie nienaruszony nabłonek nosa, zachowując nienaruszone cienkie kości małżowin usznych, chyba że myszy są bardzo stare i konieczna jest kriosekcja. Rozszerzamy również metodę, aby zachować połączenie między tkankami nosa a opuszkami węchowymi, a także resztą mózgu, ułatwiając w ten sposób jednoczesne badanie zarówno obwodów obwodowych, jak i centralnych. Nasza metoda może być stosowana do przygotowania utrwalonej paraformaldehydu, a także świeżej, żywej tkanki nosa. W związku z tym oczekuje się, że nasza metoda ułatwi badania morfologiczne, immunohistochemiczne i fizjologiczne nad oddychaniem, węchem oraz uszkodzeniem i chorobą nosa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie nosa myszy

W badaniu wykorzystano dorosłe myszy w linii C57BL/6. Wszystkie procedury i opieka nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komisję Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Maryland, Baltimore County.

1.1 Pobieranie nosa z myszy utrwalonych w paraformaldehydzie

Schemat anatomii czaszki; opisane części kości, widok z przodu i z boku; do celów edukacyjnych.
Rysunek 1. Kości czaszki myszy. A: Widok grzbietowy czaszki. B: Widok brzuszny czaszki po usunięciu żuchwy. Czaszka została przygotowana z 40-dniowej myszy. Poszczególne kości są kolorowe w celu lepszej wizualizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

  1. Wykonaj perfuzję przezsercową w celu utrwalenia poszczególnych myszy zgodnie z protokołem Lin, et al., (2008)16. W skrócie, myszy zostały głęboko znieczulone tribromoetanolem (Avertin 250 μg/g masy ciała), poddano perfuzji przezsercowej buforem fosforanowym 0,1M (PB, 30-50 ml), a następnie utrwalaczem w buforze fosforanowym zawierającym 3% paraformaldehydu, 19 mM L-lizyny monowodorochlorku i 0,23% m-periodanu sodu (około 35-50 ml). Można również postępować zgodnie z krokami opisanymi w artykule JoVE dotyczącym perfuzji zwierząt 35.
  2. Za pomocą nożyczek odetnij żuchwę (dolną szczękę) i usuń skórę z głowy.
  3. Oddziel całą głowę od reszty ciała.
  4. Usuń podniebienie. Następnie oczyść i usuń pozostałą tkankę łączną oraz mięśnie z powierzchni czaszki, aby uzyskać preparat pokazany na Rysunkach 1A i 1B.
  5. Pod mikroskopem sekcyjnym usuń kości czaszki pokrywające mózg i opłaty węchowe. Odetnij nadmiar tkanek i kości. Uwaga: w przypadku rozszerzonego przygotowania tkanek, w którym mózg i nos pozostają połączone, usuwa się wyłącznie kości czaszki. W przypadku eksperymentów immunohistochemicznych tkankę dotrwalano przez 1,5 hr, a następnie przeniesiono na noc do 0,1M soli fosforanowo-buforowanej (PBS) z 25% sacharozą. Tkanka nosowa powinna być utrzymywana w stanie uwodnienia przez cały czas trwania sekcji poprzez wielokrotne zanurzanie jej w buforowym roztworze sacharozy.

1.2 Pobieranie nosa od świeżo uśpionych myszy

  1. Poszczególne myszy przeniesiono do czystej klatki i poddano działaniu gazu CO2, po czym 5 min po ostatnim oddechu wykonano zwichnięcie szyi. Aby zmniejszyć ilość krwi w tkance nosa, należy użyć nożyczek, aby otworzyć klatkę piersiową i przeciąć serce, co pozwoli na odpływ krwi.
  2. Powtórz kroki od 1.1.2 do 1.1.5, z pominięciem post-fiksacji oraz krioprotekcji 25% sacharozą. Próbkę należy utrzymać w warunkach wilgotnych, stosując sól Tyrode’a zawierającą (w mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 pirogronianu sodu, 10 D-glukozy oraz bufor N-2-hydroksyetylopiperazyny-N'-2-etanosulfonowy (HEPES, pH 7,4). Alternatywnie można złożyć kawałek chusteczki Kimwipes, nasączyć go roztworem Tyrode’a i umieścić pod próbką podczas preparowania, a następnie okresowo zanurzać próbkę w roztworze Tyrode’a lub nanosić niewielką ilość roztworu na tkankę, aby utrzymać jej wilgotność i zapewnić żywotność komórek oraz tkanek.

2. Usunięcie siekaczy, przedniej części kości lemieżowej i kości szczęki

  1. Zacznij od widoku brzusznego. Zlokalizuj kość lemiesza i przełam ją wzdłuż jej długości, używając kaniuli lub kleszczyk z ząbkami, aby usunąć najbardziej brzuszna część kości.
  2. Używając kleszczyk karbowanych, usuń przełamane fragmenty kości lemiesza, delikatnie odsuwając odłamki od narządu lemieszo-nosowego (VNO). Uwaga: w przypadku myszy młodszych niż miesiąc lub jeśli interesuje nas tylko nabłonek węchowy (MOE), można pominąć te dwa kroki.
  3. Mocno przytrzymaj głowę kleszczykami. Użyj kaniuli, aby przełamać przednią część obu siekaczy oraz obszar stawowy przedniej części szczęki między dwoma siekaczami a kością lemiesza.
  4. Przełam brzuszną część prawej szczęki w obszarze bezpośrednio przed łukiem jarzmowym, aż do poziomu grzbietowej płytki jarzmowej.
  5. Obróć nos, aby uzyskać widok grzbietowy. Użyj kaniuli, aby przełamać prawą szczękę przed grzbietową płytką jarzmową. Cała prawa szczęka przed płytką jarzmową powinna być obluzowana. Użyj precyzyjnych kleszczyk, aby delikatnie oddzielić wszelkie tkanki nosowe znajdujące się pod szczęką, a następnie ostrożnie unieś fragment kości.
  6. Powtórz kroki 2.4 i 2.5, aby obluzować lewy siekacz oraz lewą przednią część szczęki, a następnie usuń je po usunięciu kości nosowej.

3. Usunięcie kości nosowej i grzbietowej płytki jarzmowej

  1. Używając pęsety ząbkowanej lub kleszczy kostnych, usuń pozostałą część kości czołowych, znajdującą się tuż za kośćmi nosowymi (strona gorsza). Po usunięciu tego fragmentu kości, tylną część kości nosowej można chwycić pęsetą.
  2. Za pomocą kleszczy kostnych przełam przednią część łuku jarzmowego, która jest połączona z płytką jarzmową.
  3. Chwyć precyzyjną pęsetą boczny brzeg tylnego końca płytki jarzmowej, delikatnie odchyl kość i usuń ją. Jeśli kość nie jest luźna, użyj kleszczy kostnych, aby delikatnie ją ucisnąć i poluzować przed usunięciem.
  4. Używając precyzyjnej pęsety lub żyletki, poluzuj szew pośrodkowy między prawą a lewą kością nosową.
  5. Użyj pęsety ząbkowanej, aby chwycić tylny koniec prawej kości nosowej. Delikatnie poruszaj kością na boki, aby oddzielić ją od tkanki podścielającej. W celu poruszania kością na boki warto przesuwać pęsetę wzdłuż tylnej jednej trzeciej kości nosowej. W miarę oddzielania się kości nosowej, powoli podnoś ją od strony tylnej.
  6. Gdy kość nosowa jest lekko uniesiona, przechyl ją bocznie, aby odsłonić boczny występ kostny wyścielony cienką tkanką nabłonkową układu oddechowego. Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie oddziel tę tkankę od kości nosowej. Kontynuuj unoszenie kości nosowej. Po całkowitym oddzieleniu kości od tkanki podścielającej, odetnij kość nosową w części przedniej za pomocą nożyczek.
  7. Powtórz kroki 3.1, 3.5 i 3.6 w celu usunięcia lewej kości nosowej.
  8. Powtórz kroki 3.2 i 3.3 dla lewej strony nosa.

4. Usunięcie bocznej płytki kości jarzmowej

  1. Usuń płytkę kości jarzmowej, wykonując tę czynność po jednej stronie. Można zacząć od dowolnej płytki jarzmowej.
  2. Patrząc od strony brzusznej, przełam żuchwę poniżej łuku jarzmowego, aż pęknięcie dotrze do łuku jarzmowego.
  3. Patrząc od strony grzbietowej, delikatnie chwyć łuk jarzmowy i unieś go do przodu i na boki. Jeśli płytka jarzmowa jest nadal przytwierdzona do jakiejkolwiek tkanki, użyj pęsety precyzyjnej i delikatnie przetnij połączenia między tkanką a kością.
  4. Powtórz procedurę dla płytki jarzmowej po drugiej stronie nosa.

5. Usunięcie kości oczodołu

  1. Z perspektywy brzusznej złam kość podniebienia między trzonowcami w obrębie nosa.
  2. Użyj kleszczy kostnych, aby usunąć 3 trzonowce oraz żuchwę górną po każdej stronie nosa.
  3. Złam i usuń wszelkie pozostałe grube fragmenty kości znajdujące się brzusznie i z tyłu w stosunku do małżowin nosowych po każdej stronie nosa.

6. Usunięcie kości sitowej

  1. Złam wszelkie części kości sitowej wystające gudało od małżowin nosowych. Jest to konieczne, aby uniknąć utraty tkanki małżowin podczas usuwania cienkich fragmentów kości sitowej pokrywających małżowiny.
  2. W przypadku prawej strony nosa, umieść precyzyjną pęsetę na przedniej krawędzi kości sitowej i delikatnie ją usuń. Jeśli część kości pozostała, powtarzaj tę procedurę aż do usunięcia całej cienkiej kości pokrywającej małżowiny. W większości preparatów kości małżowin nie muszą być usuwane. U starszych myszy blaszka sita staje się krucha. Jeśli wymagane jest krioceinowanie tkanki nosowej, usuń małe fragmenty blaszki precyzyjną pęsetą, aby zmniejszyć potencjalne uszkodzenia spowodowane przez kość.
  3. Powtórz krok 6.2) dla lewej strony nosa.
  4. Przed przystąpieniem do cięcia usuń wszelkie pozostałe fragmenty kości. Uwaga: u zwierząt starszych niż rok tylno-grzbietowy region kości przegrody jest nieco gruby i twardy. Część tę można usunąć za pomocą precyzyjnej pęsety. Wprowadź końcówkę pęsety po obu stronach kości, aby oddzielić grzbietową część kości przegrody od wyściełającego ją nabłonka. Użyj jednej pęsety, aby chwycić kość i przytrzymać preparat. Użyj drugiej pęsety, aby oddzielić górną część kostną od dolnej części chrzestnej przegrody i delikatnie ją usuń.

7. Przygotowanie nosa do kriosekcji

  1. Przygotuj pompową pompę próżniową do aspiracji.
  2. Umieść nos w formie do zatapiania. Zanurz nos w medium OCT.
  3. Użyj próżni, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w tkance nosa. Proces ten trwa do 5 min.
  4. Po usunięciu pęcherzyków powietrza ustaw tkankę w pożądanej orientacji.
  5. Zamroź medium OCT i tkankę w formie, używając suchego lodu. Zatopioną tkankę można następnie bezzwłocznie poddać kriosekcjonowaniu lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując tę metodę, możemy niezawodnie uzyskać niemal całkowicie nienaruszoną tkankę nosową. Rysunek 2A przedstawia obraz dorosłego preparatu nosowego z głowy utrwalonej w paraformaldehydzie. W tym preparacie wszystkie cztery podolfaktorowe organy zmysłów, w tym MOE, organ przegrody, zwoje Grüneberga oraz VNO, są nienaruszone. Zachowane są również nabłonki oddechowe oraz tkanki podnabłonkowe, takie jak gruczoły i naczynia. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w szeregu badań, w których analizowaliś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj zademonstrowaliśmy krok po kroku procedurę izolowania nienaruszonej tkanki węchowej i oddechowej z nosa myszy poprzez sekwencyjne usuwanie otaczających kości, oszczędzając tkankę poniżej. Pokazujemy, że staranne usunięcie kości może zachować nawet najdelikatniejsze tkanki w całości. Dzielimy się również spostrzeżeniami na temat możliwych modyfikacji tej techniki, w której izolujemy razem zarówno tkankę mózgu, jak i nosa, aby zachować połączenie nerwowe. Ta nowa metoda umożliwia izolowanie całych tkanek węchowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty badawcze (granty NIH/NIDCD 009269, 012831 i administracyjne uzupełnienie ARRA NIH) dla Weihong Lin. Szczególne podziękowania kierujemy do Pana Tima Forda z UMBC za jego pomoc techniczną w nagrywaniu i przetwarzaniu filmów. Pragniemy również podziękować dr Daphne Blumberg, pani Chere Petty z UMBC i panu Nicholasowi McCollumowi z Olympus America Inc. za ich pomoc sprzętową w filmowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dissection
Rongeur, 1,0 mm Szerokość szczękWorld Precision Instruments (WPI)501333
Szczypce precyzyjne, Dumont 3 WPI503235
Szczypce precyzyjne, Dumont 55WPI14099
Szczypce precyzyjne, Dumont AAFine Science Tools (FST)11210-20
Kleszczyki do próbek, Ząbkowanenożyczki operacyjne VWR82027-440
WPI501753
Nożyczki do irysów, prostyMiltexV95-304
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZ40
[nagłówek]
Osadzanie w tkankach
Mieszanka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)Sakura Finetek4583
Plastikowa forma do zatapianiaVWR15160-215
Pompa próżniowa aspiratoraFisher Scientific09-960-2
[nagłówek]
Barwienie sekcji
czerwonyACROS OrganicCAS 553-24-2Barwienie jąder

Bibliografia

  1. Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
  2. Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
  3. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  4. Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. , 2nd, Wiley-Liss. (2000).
  5. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
  6. Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
  7. Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
  8. Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
  9. Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
  10. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
  11. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
  12. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  13. Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
  14. Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
  15. Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
  16. Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
  17. Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
  18. Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
  19. Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
  20. Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
  21. Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
  22. Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
  23. Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
  24. Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
  25. Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
  26. Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
  27. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
  28. Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
  29. Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
  30. Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
  31. Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
  32. Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
  33. Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
  34. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850(2010).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  36. Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
  37. Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114(2008).
  38. Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924(2010).
  39. Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Usuni cie ko ciprzygotowanie tkaneksekcjonowanie pr niowenab onek w chowynab onek oddechowyanaliza ma owin nosowychbarwienie histologiczne

Powiązane artykuły