Artykuł metodologiczny

Pomiar dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii S. typhimurium ukierunkowanych na nowotwór

DOI:

10.3791/50540

⸱

6 lipca 2013

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tych eksperymentów jest wygenerowanie ilościowych danych o przebiegu czasowym wzrostu i dynamiki ekspresji genów osłabionych kolonii bakterii S. typhimurium rosnących wewnątrz guzów. Ten film obejmuje przygotowanie i implantację komórek nowotworowych, przygotowanie i wstrzyknięcie bakterii, obrazowanie luminescencyjne całego zwierzęcia, wycinanie guza i zliczanie kolonii bakteryjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tych eksperymentów jest wygenerowanie ilościowych danych o przebiegu czasowym wzrostu i dynamiki ekspresji genów osłabionych kolonii bakterii S. typhimurium rosnących wewnątrz guzów.

Stworzyliśmy modelowe guzy ksenoprzeszczepu u myszy poprzez podskórne wstrzyknięcie linii komórkowej ludzkiego raka jajnika, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Przekształciliśmy atenuowane szczepy bakterii S. typhimurium (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) z konstytutywnie wyrażonym plazmidem lucyferazy (luxCDABE) dla wizualizacji2. Szczepy te specyficznie kolonizują nowotwory, pozostając zasadniczo niezjadliwe dla myszy1.

Po ustaleniu mierzalnych guzów, bakterie zostały wstrzyknięte dożylnie przez żyłę ogonową z różnymi dawkami. Zlokalizowana w guzie ekspresja genów bakteryjnych była monitorowana w czasie rzeczywistym w ciągu 60 godzin za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS). W każdym punkcie czasowym guzy zostały wycięte, zhomogenizowane i posiane w celu ilościowego określenia kolonii bakteryjnych w celu korelacji z danymi dotyczącymi ekspresji genów.

Razem, te dane dają ilościową miarę dynamiki wzrostu in vivo i ekspresji genów bakterii rosnących wewnątrz guzów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia syntetyczna szybko się rozwinęła w ciągu ostatniej dekady i jest teraz w stanie wpłynąć na ważne problemy w energetyce i zdrowiu. Ekspansja na arenę kliniczną została jednak spowolniona przez obawy dotyczące bezpieczeństwa i brak opracowania kryteriów projektowania obwodów genetycznych in vivo. Przyspieszenie zastosowań medycznych o dużym wpływie będzie wymagało wykorzystania metod, które łączą się bezpośrednio z infrastrukturą medyczną, obwodami genetycznymi, które działają poza kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi oraz bezpiecznymi i akceptowanymi klinicznie gospodarzami mikrobiologicznymi.

Wiele szczepów zostało przebadanych pod kątem terapii raka ze względu na ich zdolność do preferencyjnego wzrostu w nowotworach. Należą do nich C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum i S. typhimurium3-8. S. typhimurium wzbudził szczególne zainteresowanie, ponieważ wykazał bezpieczeństwo i tolerancję w wielu badaniach klinicznych na ludziach9-12. Początkowo wykazano, że bakterie te wywołują działanie przeciwnowotworowe poprzez stymulację układu odpornościowego gospodarza i wyczerpanie składników odżywczych wymaganych do metabolizmu komórek rakowych. Produkcja ładunku terapeutycznego została później rozszerzona poprzez modyfikacje genetyczne. Chociaż badania te stanowią ważny postęp w stosowaniu bakterii w leczeniu nowotworów, większość istniejących wysiłków opierała się na ekspresji na wysokim poziomie, która zwykle skutkuje dostarczaniem wysokich dawek, efektami niezamierzonymi i rozwojem oporności gospodarza13-16.

Teraz, biologia syntetyczna może dodać programowalną produkcję ładunku, wykorzystując obliczeniowo zaprojektowane obwody genetyczne, które mogą wykonywać zaawansowane wykrywanie i dostarczanie17-20. Obwody te można zaprojektować tak, aby działały jako systemy dostarczania, które wyczuwają bodźce specyficzne dla guza i w razie potrzeby samoregulują produkcję ładunku. Jednak badanie funkcji tych obwodów in vivo było do tej pory wyzwaniem.

Ponieważ plazmidy są powszechnym szkieletem dla obwodów syntetycznych, opisujemy metodę charakteryzowania dynamiki ekspresji genów opartych na plazmidzie in vivo za pomocą modelu mysiego. Metody te wykorzystują poklatkowe obrazowanie luminescencyjne i ilościowy pomiar biodystrybucji. Razem podejścia te zapewniają ramy do badania sieci opartych na plazmidach in vivo do zastosowań klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Pasażowanie linii komórkowych przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych. W tym eksperymencie wykorzystaliśmy komórki OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Hoduj komórki do docelowej konfluencji 80 - 100%.
  2. Inkubuj komórki z 5 ml trypsyny przez 5 minut, a następnie dodaj 5 ml pożywki RPMI + FBS, aby dezaktywować trypsynę.
  3. Zbierz i policz komórki na hemocytometrze. Zawiesić w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej w docelowym stężeniu 5 x 107 komórek/ml lub około 200 μl na kolbę.
  4. Dodać 15% zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (BD Biosciences) i utrzymywać zawiesinę komórkową na lodzie do momentu implantacji.

2. Implantacja guza

  1. Znieczulij 4-tygodniowe samice myszy Ncr/Nu za pomocą 3% izofluranu i odczekaj około 5 minut, aby zapewnić głębokie znieczulenie. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Załaduj komórki (100 μl na guz) do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj igłę o rozmiarze 27 1/2.
  3. W każdym z dwóch obustronnych miejsc wstrzyknięcia tylnego boku delikatnie unieś skórę kleszczami, aby utworzyć namiot i wstrzyknąć komórki u podstawy. Uważaj, aby nie wniknąć zbyt głęboko, wytwarzając krew. Użyj pęsety, aby delikatnie usunąć strzykawkę bez rozprysków.
  4. Monitoruj wzrost guza codziennie przez 10 - 20 dni, aż do osiągnięcia średnicy guza 2 - 4 mm.

3. Przygotowanie bakterii

  1. Rozpocznij nocną hodowlę bakterii w 3 ml pożywki LB + Ampicylina z bulionu zamrażarki w temperaturze -80 C lub płyty chłodniczej. W tym eksperymencie użyliśmy szczepu S. typhimurium ELH430 (SL1344 PhoPQ- aroA-).
  2. Rano rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:100 do przefiltrowanego LB i wyrosnąć do OD600 0,4 - 0,6.
  3. Odwirować i przemyć 3 razy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie zawiesić na końcowym OD600 0,1 (około 1 x 107 komórek/ml).

4. Wstrzykiwanie bakterii

  1. Znieczul zwierzę i połóż się na boku z ogonem skierowanym w stronę twojej dominującej ręki. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Rozszerz żyłę ogonową za pomocą ciepłej wody lub lampy grzewczej.
  3. Załaduj bakterie (100 μl na mysz) do strzykawki o pojemności 1 ml i zegnij końcówkę pod kątem mniejszym niż 90 stopni.
  4. Dopasuj końcówkę strzykawki do żyły ogonowej, wniknij na płytką głębokość (nie powinno być odczuwalnego oporu) i wstrzyknij bakterie. Należy obserwować przemieszczenie przepływu krwi, aby wstrzyknięcie zakończyło się sukcesem.

5. Obrazowanie myszy

  1. Znieczulenie zwierząt w komorze indukcyjnej, a następnie umieszczenie każdej myszy na platformie obrazowania. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Utrzymuj precyzyjne pozycjonowanie, aby zapewnić ilościowe wyniki między punktami czasowymi.
  2. Obrazuj zwierzęta za pomocą systemu obrazowania IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Jeśli obrazujesz więcej niż 1 zwierzę, umieść między nimi bariery świetlne, aby zapobiec oświetleniu krzyżowemu. Zwierzęta należy najpierw zobrazować po stronie brzusznej, aby potwierdzić lokalizację bakterii.
  3. Obrazuj zwierzęta grzbietowo za pomocą IVIS co 2 godziny przez cały czas trwania eksperymentu (36 godzin). Wygeneruj przebieg czasowy dla danego zwrotu z inwestycji.

6. Kwantyfikacja biodystrybucji bakterii

  1. Poddaj zwierzęta eutanazji za pomocą CO2 i ułóż na plecach na chłonnej pieluszce.
  2. Obróć zwierzę, aby odsłonić dwa podskórne guzy tylnego boku. Przetnij otaczającą tkankę skórną, aby oddzielić i usunąć guzy. Trzymając guz pęsetą, usuń skórę za pomocą odwróconych ruchów nożycowych. Gdy większość skóry zostanie oddzielona, całkowicie usuń guz za pomocą pęsety.
  3. Umieść narządy w wstępnie zważonych probówkach do mikrowirówek. Ponieważ masa tych probówek może się znacznie różnić, ważne jest, aby je wstępnie zważyć w celu uzyskania wyników ilościowych.

7. Kwantyfikacja biodystrybucji bakterii

  1. Dla każdego punktu czasowego wyciąć i zważyć guzy.
  2. Dodać 500 μl PBS + 15% glicerolu i homogenizować za pomocą Tissue-Tearor (BioSpec). Przepłukać homogenizator 3 razy etanolem między próbkami.
  3. Generuj seryjne rozcieńczenia i płytkę do zliczania kolonii bakteryjnych. Do nakładania wielu rozcieńczeń na jedną płytkę należy używać płytek o wstępnie pokrojonych fragmentach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, jesteśmy w stanie wygenerować dane na temat dynamiki wzrostu in vivo i ekspresji genów bakterii nowotworowych. Ogólny przepływ pracy podsumowano na rysunku 1.

W pierwszym etapie wstrzykujemy bakterie (zielony) i obrazujemy zwierzę za pomocą IVIS do pomiaru ekspresji genów z luminescencją (niebieski) jako reporter.

Następnie, w drugim etapie, wycinamy, homogenizujemy i pokrywamy guzy pod kątem liczby kolonii, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za pomocą tej procedury jesteśmy w stanie wygenerować przebiegi czasowe dla dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii kolonizujących nowotwory. Chociaż pomiary te są rutynowo wykonywane in vitro w hodowlach okresowych lub urządzeniach mikrofluidycznych, są one znacznie trudniejsze do wykonania in vivo.

Istnieje kilka modyfikacji, które można zastosować do tych metod. Podczas gdy użyliśmy linii komórkowej OVCAR-8 do wygenerowania naszych modeli mysich, wiele innych linii ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy H. Flemingowi za krytyczne przeczytanie i redakcję rękopisu. Praca ta była wspierana przez stypendium podoktoranckie Misrock (TD) i stypendium dla absolwentów NDSEG (AP). SNB jest badaczem HHMI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD Biosciences309602
3/10 cc Strzykawka insulinowaBD Biosciences309301
Igła PrecisionGlide BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X), płyn, z L-glutaminąInvitrogen11875-119
AmpicillinSigma AldrichA0166-5G
LB Agar RosółSigma AldrichL2897
Rosół Luria-BertaniBD Biosciences244610

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511(2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bakterie celowane w nowotw robrazowanie in vivoobrazowanie bioluminescencyjneliczenie koloniimodel ksenoprzeszczepu nowotworusystem obrazowania IVISekspresja gen w bakteryjnychkolonizacja nowotworu

Powiązane artykuły