Method Article

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

DOI:

10.3791/50541

⸱

August 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa charakterystyka interakcji białek jest niezbędna praktycznie w każdej dziedzinie nauk przyrodniczych, szczególnie w odkrywaniu leków. Większość obecnie dostępnych metod oznaczaniaKD wymaga dostępu do oczyszczonego białka będącego przedmiotem zainteresowania, którego wytwarzanie może być czasochłonne i kosztowne. Opracowaliśmy protokół, który pozwala na określenie powinowactwa wiązania za pomocą termoforezy w mikroskali (MST) bez oczyszczania białka docelowego z lizatów komórkowych. Metoda polega na nadekspresji białka połączonego z GFP i lizie komórek w warunkach niedenaturujących. Zastosowanie metody do STAT3-GFP ulegającego przejściowej ekspresji w komórkach HEK293 pozwoliło po raz pierwszy określić powinowactwo dobrze przebadanego czynnika transkrypcyjnego do oligonukleotydów o różnych sekwencjach. Protokół jest prosty i może mieć wiele zastosowań do badania interakcji białek z małymi cząsteczkami, peptydami, DNA, RNA i białkami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa charakterystyka powinowactwa oddziaływań międzycząsteczkowych jest ważna w wielu dziedzinach badań biomedycznych. Stała dysocjacji wiązania (KD) jest niezbędna nie tylko w odkrywaniu leków, ale jest również ważnym parametrem w charakterystyce każdej interakcji binarnej w dowolnym systemie biologicznym. Metody biochemiczne stosowane do wykrywania oddziaływań białko-białko, takie jak immunoprecypitacja i badania przesiewowe drożdży dwuhybrydowych, nie informują nas o tym, jak ścisłe są te interakcje, podczas gdy powinowactwo określa, czy ten konkretny kompleks istnieje w danych warunkach in vivo. W procesie odkrywania leków, opracowanie testu wiązania jest jednym z niezbędnych i często najbardziej czasochłonnych kroków. Do najczęściej stosowanych metod oznaczania KD należą: polaryzacja fluorescencyjna,1 technologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR),2 wiązanie radioligandów,3 izotermiczna kalorymetria miareczkowa,4 dializa równowagowa (ED),5 ultrafiltracja (UF),5 i ultrawirowanie (UC). 6 Wszystkie z nich wymagają znacznych ilości oczyszczonego białka docelowego. Termoforeza w mikroskali (MST) to szybko rozwijająca się metoda, która wykrywa ukierunkowany ruch cząsteczek w mikroskopijnym gradiencie temperatury. Wszelkie zmiany powłoki hydratacyjnej biomolekuł powodują względną zmianę ruchu wzdłuż gradientu temperatury. 7 MST służy do określania powinowactwa wiązania i jest stosowany do badania wiązania ligandów z białkami znakowanymi fluorescencyjnie lub ligandów fluorescencyjnych z białkiem docelowym. 8, 9 MST umożliwia pomiar oddziaływań bezpośrednio w roztworze bez konieczności unieruchamiania na powierzchni (technologia bez unieruchomienia). Praktycznie każdemu powiązaniu towarzyszy zmiana sygnału MST, chociaż wielkość zmiany różni się znacznie w zależności od systemu. Aby wykryć ruch cząsteczek przez MST, muszą być one fluorescencyjne. To poważne ograniczenie metody można przekuć w zaletę. Jeśli białko ulega ekspresji jako fuzja GFP w dowolnym systemie, będzie to jedyna cząsteczka fluorescencyjna, a zatem może być badane bez izolacji od lizatu komórkowego lub bezkomórkowego systemu ekspresji. Głównym wyzwaniem jest generowanie lizatów komórkowych, które pozwalają na warunki wiązania przy minimalnej ilości artefaktów. Tutaj opisujemy protokół przygotowania lizatu komórkowego i eksperymentu MST, który można zastosować do wielu białek rozpuszczalnych i błonowych.

Białka STAT są utajonymi cytoplazmatycznymi czynnikami transkrypcyjnymi aktywowanymi przez fosforylację tyrozyny w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe i biorą udział w wielu procesach biologicznych, w tym w odporności, hematopoezie, zapaleniu i rozwoju. 10 U ssaków rodzina STAT składa się z STAT 1, 2, 3, 4, 5A, 5B i 6. Wiadomo, że wszystkie aktywowane STAT wiążą się z tą samą sekwencją DNA, tak zwanym motywem GAS, sekwencją aktywowaną IFN-gamma. Jednak efekty transkrypcyjne różnych STAT są bardzo różne. 11 Pomimo udziału w wielu procesach patologicznych i szeroko zakrojonych badań zaowocowanych ponad 17 000 publikacji, KD interakcji STAT z różnymi sekwencjami DNA nie zostało określone. Scharakteryzowano jedynie względne powinowactwo różnych STAT do wariantów motywu GAS. 11 Trudności w ekspresji i oczyszczaniu białek są głównymi przeszkodami w charakterystyce selektywności wiązania DNA STAT. Chociaż większość badań koncentrowała się na roli "aktywowanych" STAT, które stały się synonimem czynnika transkrypcyjnego fosforylowanego Tyra, rola niefosforylowanych STAT (U-STATs) w regulacji transkrypcji szybko się pojawia. 12 Mechanizmy te są jednak słabo poznane i nie było jasne, czy U-STAT faktycznie wiążą się z DNA, czy też działają poprzez interakcje z innymi czynnikami transkrypcyjnymi. Niedawno wykazaliśmy, że U-STAT3 może wiązać się z sekwencjami DNA różniącymi się od motywów GAS z jeszcze większym powinowactwem. 13 Odkrycie to ma istotne implikacje dla naszego zrozumienia biologicznych funkcji tego ważnego białka. Zastosowaliśmy termoforezę w mikroskali w celu określenia względnego powinowactwa STAT3 do GAS i oligonukleotydu bogatego w AT S + 100 (ryc. 4). Prawie identyczny protokół został użyty do oznaczania KD w celu wiązania innego liganda STAT3, inhibitora lipopeptydu. 14 Nie wykryto wiązania z pokrewnym czynnikiem transkrypcyjnym, GFP-STAT1, który był używany jako kontrola ujemna, potwierdzając w ten sposób selektywność interakcji. 14

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie lizatu komórkowego

Ten protokół jest przeznaczony dla komórek adherentnych, które wyrażają dowolne białko skonfundowane przez GFP. Potrzebna liczba komórek może wahać się od 106 do nawet 20 x 106 komórek, w zależności od poziomu ekspresji białka. Na przykład lizat komórek HEK z nadekspresją GFP-STAT3 przygotowano przez potraktowanie komórek hodowanych w 10 kolbach T75 do prawie 70% konfluencji za pomocą 1 ml buforu do lizy. Jednak lizat ten musiał zostać rozcieńczony 150-krotnie, aby zapewnić optymalny poziom fluorescencji w eksperymencie MST. Protokół lizy komórek zależy w dużym stopniu od właściwości i lokalizacji wewnątrzkomórkowej badanego białka. Jeśli stosowanie detergentów jest niepożądane ze względu na niestabilność białka, najlepszym wyborem może być sonikacja opisana poniżej. Do buforu do lizy można dodawać różne dodatki, aby zapobiec reakcjom modyfikacji białek: EDTA zapobiega fosforylacji, wanadan sodu hamuje fosfatazy białkowe tyrozyny, fluorek sodu jest inhibitorem fosfataz Ser/Thr.

  1. Przygotować bufor do lizy. W przypadku łatwych do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych dobrze sprawdza się następujący skład: 25 mM Tris HCl, pH 8,0 i koktajl inhibitorów proteazy rozcieńczony 100-krotnie (Sigma-Aldrich P2714, składający się z 2 mM AEBSF, 0,3 μM aprotyniny, 130 μM bestatyny, 1 mM EDTA, 14 μM E-64, 1 μM leupeptyny). Alternatywnie, w przypadku mniej rozpuszczalnych białek, można użyć komercyjnego buforu RIPA z inhibitorami proteazy, koktajlem i niedenaturującymi detergentami. Utrzymuj bufor na lodzie.
  2. Krótko przemyć komórki lodowatym PBS, używając 10 ml buforu na kolbę T75. Trzymać komórki na lodzie przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki zaczną odłączać się od kolby. Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby odłączyć w razie potrzeby.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml lodowatego PBS i przenieść do wstępnie schłodzonej 14 ml okrągłodennej probówki wirówkowej.
  4. Komórki osadu rozdrabniać przez odwirowanie w temperaturze 400-600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. W razie potrzeby połączyć komórki z kilku kolb.
  5. Usunąć supernatant PBS i ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu do lizy, przenosząc zawiesinę do wstępnie schłodzonej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
  6. Utrzymuj komórki na lodzie, aby zminimalizować miejscowe przegrzanie. Lizuj komórki za pomocą 3 impulsów sonikacji po 10 sekund przy amplitudzie 30%, używając wstępnie schłodzonej końcówki o średnicy 2-3 mm. Trzymaj końcówkę pod powierzchnią, aby zminimalizować pienienie. Pomiń ten krok, jeśli używasz buforu zawierającego detergent i zamiast tego inkubuj na lodzie przez 30 minut.
  7. W razie potrzeby skorygować roztwór lizatu tak, aby zawierał fizjologiczne stężenie soli (100 mM NaCl), stosując 5 M NaCl.
  8. Zbierać lizaty przez odwirowanie w temperaturze około 26 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  9. Określić optymalne rozcieńczenie lizatu (zgodnie z opisem w sekcji 3 poniżej) i ilość lizatu potrzebną do jednego miareczkowania (zwykle około 300 μl wstępnie rozcieńczonego lizatu).
  10. Podwielokrotnić lizat i przechowywać w temperaturze odpowiedniej dla badanego białka (w większości przypadków -80 °C).

2. Wybór i przygotowanie bufora MST

  1. Ponieważ oddziaływania białko-ligand są zależne od warunków buforowych, skład bufora MST dobierany jest na podstawie właściwości konkretnego układu. Ogólnie rzecz biorąc, korzystne jest przetestowanie co najmniej dwóch różnych.
  2. Przygotuj 2 MST po 5x. Mieliśmy dobre doświadczenia z tymi dwoma kompozycjami: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 500 mM NaCl; 0,25% NP-40) i Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4; 750 mM NaCl; 50 mM MgCl2; 0,05% Tween-20). Dodatek BSA (5% w końcowej mieszaninie wiążącej) może pomóc w zapobieganiu przywieraniu białek do plastikowych probówek i szklanych naczyń włosowatych. NaN3 (0,5 mM) może być również włączony, aby zapobiec rozwojowi mikroorganizmów.

3. Określenie optymalnego rozcieńczenia lizatu

  1. Wybierz źródło wzbudzenia LED o długości fali λ = 470 nm na przyrządzie MST.
  2. Załaduj naczynia włosowate ekstraktem komórkowym rozcieńczonym 2 i 10x buforem MST.
  3. Wykonaj operację "Znajdź kapilary" w oprogramowaniu sterującym przyrządu MST. Optymalny zakres fluorescencji w rozcieńczonym lizacie wynosi od 400 do 1 500 jednostek fluorescencyjnych.

4. Określenie optymalnego zakresu stężenia ligandów

  1. Najwyższe stężenie liganda powinno być co najmniej 20 razy wyższe niż oczekiwana stała dysocjacji.
  2. Najniższe stężenie liganda powinno być niższe niż stężenie molowe białka fluorescencyjnego.

Zapoznaj się z narzędziem NanoTemper Technologies Concentration Finder, aby oszacować zakres stężenia ligandów.

5. Przygotowanie lizatu komórkowego i rozcieńczeń ligandów

  1. Umieść stojak na probówki z wymaganą liczbą (zwykle 10-16) probówek wirówkowych LoBind o pojemności 0,5 ml na lodzie. Odpipetować 25 μl buforu MST na dno każdej probówki. Dodać 25 μl roztworu podstawowego liganda do pierwszej probówki (#1, najwyższe stężenie liganda) i przeprowadzić seryjne dwukrotne rozcieńczenie liganda przy użyciu pozostałych probówek. Stojak z próbkami ligandów należy przechowywać na lodzie.
  2. Rozmrażaj komórki powoli na lodzie.
  3. Rozcieńczyć lizat komórkowy buforem MST, aby zapewnić optymalny poziom docelowego białka fluorescencyjnego w reakcjach wiązania. Końcowe stężenie białka powinno być bliskie oczekiwanemu KD lub niższe. Należy go dostosować, aby uzyskać niezbędną liczbę fluorescencji w roztworze końcowym. W celu określenia stężenia GFP-STAT3 w lizacie przyrząd został skalibrowany za pomocą fluoresceiny. Stężenie molowe GFP w lizacie oznaczono za pomocą stosunku wydajności kwantowej fluoresceiny i EGFP, odpowiednio 0,85 i 0,61. 15

6. Badania wiązania termoforezy w mikroskali

  1. Wybierz źródło wzbudzenia LED o λ = 470 nm na przyrządzie MST.
  2. Umieścić probówki LoBind o pojemności 0,5 ml w stojaku na probówki naprzeciwko probówek z próbkami do seryjnego rozcieńczania ligandów. Ostrożnie dodaj 15 μl lizatu komórkowego na dno każdej probówki. Staraj się nie dotykać ścianek rurki, aby uniknąć utraty próbki.
  3. Dodać 15 μl próbki liganda o najwyższym stężeniu (#1) do odpowiedniej probówki #1 z lizatem komórkowym. Dobrze wymieszaj i zmień końcówkę pipety. Powtórz ten krok z resztą probówek, z wyjątkiem ostatniej, która nie powinna zawierać liganda.
  4. Dodać 15 μl buforu MST do ostatniej probówki i dobrze wymieszać.
  5. Napełnij około 2/3 pierwszej kapilary mieszaniną wiążącą z probówki #1, przechyl ją, aby przesunąć roztwór w kierunku środka i umieść kapilatę na tacce kapilarnej w pozycji #1 (najbliższa pozycja otworu tacy). Powtórz ten krok z pozostałymi naczyniami włosowatymi. Końce kapilarne można zatkać woskiem w celu przeprowadzenia dłuższych eksperymentów.
  6. Umieść tacę wewnątrz instrumentu MST i zamknij drzwiczki instrumentu.
  7. Wykonaj polecenie "Znajdź kapilary", aby umożliwić instrumentowi znalezienie dokładnych pozycji naczyń włosowatych i zmierzenie fluorescencji próbek.
  8. W zależności od intensywności sygnału fluorescencji dostosuj moc diody LED (od 10-100%), aby ustawić ją w odstępie 400-1,500 jednostek.
  9. Kliknij przycisk "Start", aby przeprowadzić eksperyment termoforezy. Do eksperymentu można wybrać więcej niż jedną moc lasera IR, aby znaleźć optymalny gradient temperatury dla danego systemu. Zbierz dane z 2-3 przebiegów dla tego samego zestawu kapilarek, aby zapewnić powtarzalność pomiarów. Uruchomienie jednego zestawu 16 naczynek zajmuje 10-12 minut.

7. Analiza danych termoforezy w mikroskali

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy.
  2. Załaduj folder projektu. W wyświetlonej przeglądarce Information Run Viewer należy wybrać zebrane przy określonej mocy lasera IR krzywe termoforetyczne. Istnieje możliwość otwarcia wszystkich śladów termoforetycznych pobranych w różnych warunkach, takich jak moc lasera IR, moc diody LED, temperatura, stężenie itp. od razu, a następnie wybierając dowolne krzywe do analizy, włączając je i wyłączając (kliknij na nazwę eksperymentu).
  3. W oknie wykresu Punkty oceny wybierz termoforezę lub termoforezę za pomocą T-jump. Upewnij się, że niebieskie i czerwone linie są prawidłowo ustawione. Aby uzyskać uśrednione punkty z odchyleniami standardowymi, wybierz "Użyj średniej" lub "Rozróżnij przebiegi" dla oddzielnych przebiegów.
  4. Aby wykreślić dopasowanie stałej dysocjacji, wybierz "Użyj średniej", wprowadź i ustal oznaczoną wartość stężenia cząsteczki (sprawdź kwadrat "stężenie" w menu okna dopasowania) i dopasuj krzywą. Wartość K D wraz z odchyleniem standardowym pojawia się w osobnym wyskakującym oknie informacyjnym. Aby wykreślić pasowanie za pomocą metody Hill, wybierz "Średnia", metodę Hill, a następnie dopasuj krzywą. W tym przypadku pokazana jest wartość powinowactwa EC50 wraz z jego odchyleniem standardowym. Cecha "granicy" KD lub Hilla może być również wykorzystana, gdy nie zostanie osiągnięte nasycenie w stanie związanym.
  5. Zapisz dane średniego dopasowania w pliku tekstowym i przenieś je do programu Excel.
  6. Wykres normy F (fluorescencja znormalizowana),norma ΔF (różnica w znormalizowanej fluorescencji, jeśli porównuje się różne eksperymenty) lub frakcja związana (patrz wzór poniżej) w funkcji stężenia cząsteczki nieznakowanej (miareczkowanej).

Frakcja związana (frakcja cząsteczek w kompleksie) = (Therm(C)-niezwiązana)/(związana-niezwiązana), gdzie Therm(C) to termoforeza mierzona dla stężenia C, niezwiązana to termoforeza dla stanu niezwiązanego (gdy cząsteczki nie są w kompleksie), a związana to termoforeza dla stanu całkowicie związanego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar powinowactwa niefosforylowanego białka STAT3 do oligonukleotydów.

Komórki HEK293 wykazujące ekspresję STAT3-GFP zostały użyte jako źródło fluorescencyjnie znakowanego STAT3 do testu wiązania DNA. Lizaty komórkowe przygotowano przy użyciu buforu RIPA (20x106komórek/ml). Do badań wiązania lizaty rozcieńczono 150-krotnie buforem wiążącym DNA MST, aby zapewnić optymalny poziom białka fluorescencyjnego w reakcji wiązania (około 20 nM). Nietransfekowane komórki HEK293...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja i oczyszczanie białek jest pracochłonnym i kosztownym etapem, który jest jednak niezbędny do określenia KD oddziaływań za pomocą większości obecnie stosowanych metod. Zastosowanie MST pozwala uniknąć oczyszczania białek, co znacznie upraszcza i przyspiesza ilościową charakterystykę oddziaływań. Ma ona szczególnie istotne zalety w przypadku białek trudnych do ekspresji i oczyszczenia, takich jak białka błonowe i czynniki transkrypcyjne.

Głównym ograniczeniem i wymogiem MST ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianki o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznaczają poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Program Badań Wewnętrznych NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research; Umowa o współpracy badawczej między NCI i Calidris Therapeutics; Amerykańskie Towarzystwo Onkologiczne przyznało IRG 97-152-17 dla O.T; oraz fundusze federalne z National Cancer Institute, NIH, na podstawie umowy HHSN26120080001E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bufor RIPAMillipore20-188innych producentów również działają
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 Taca kapilarnaNanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 Traktowany standardowo KapilaryNanoTemper Technologies GmbHK002
NT Oprogramowanie sterująceNanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
Oprogramowanie analityczne NTNanoTemper Technologies GmbH1.4.27
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorf5417RInne wirówki z chłodzeniem z mikroprobówkami dostarczające
probówkę Protein LoBind 0,5 mlEppendorf22431064

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100(2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microscale ThermophoresisBinding Affinity DeterminationProtein Purification free MethodGFP fused ProteinCell Lysate AnalysisLigand Dilution SeriesFluorescence MeasurementThermophoresis ExperimentSTAT3 GFP TransfectionOligonucleotide Binding Assay

Related Articles