Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50543

⸱

10 lipca 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Marine Biology and Fisheries, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences, University of Miami

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Streszczenie

Ślimak morski Aplysia californica ma długą historię jako model funkcjonowania układu nerwowego, ze szczególnym znaczeniem w badaniach nad uczeniem się i pamięcią. Typowymi przygotowaniami do takich badań są te, w których neurony czuciowe i ruchowe pozostają nienaruszone u minimalnie wypreparowanego zwierzęcia lub technicznie wyszukana współkultura neuronalna poszczególnych neuronów czuciowych i ruchowych. Rzadziej spotykany jest izolowany preparat neuronalny, w którym małe skupiska nominalnie jednorodnych neuronów są dysocjowane na pojedyncze komórki w krótkotrwałej hodowli. Takie wyizolowane komórki są przydatne do biofizycznej charakterystyki prądów jonowych przy użyciu technik patch clamp i ukierunkowanej modulacji tych przewodności. Opisano protokół przygotowania takich kultur. Protokół wykorzystuje łatwe do zidentyfikowania glutaminergiczne neurony czuciowe zwojów opłucnej i policzkowej oraz opisuje ich dysocjację i minimalne utrzymanie w hodowli przez kilka dni bez surowicy.

Wprowadzenie

morski, Aplysia, jest użytecznym modelem neurobiologicznym od wielu dziesięcioleci. Najbardziej znany jest jako model habituacji i warunkowania klasycznego 7, 8. Badania nad uczeniem się i pamięcią w tym modelu zdobyły Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 2000 roku dla Erica R. Kandela, w nagrodzie, którą dzielił z Arvidem Carlssonem i Paulem Greengardem 10. Badania z udziałem zapisów elektrycznych ze zredukowanych preparatów, w których elementy układu nerwowego tego bezkręgowca są wycinane ze zwierzęcia z pozostawionymi nerwami i mięśniami, pomogły wyjaśnić rolę poszczególnych neuronów w Aplysia. Identyfikacja precyzyjnych mechanizmów molekularnych, które składają się na uczenie się w Aplysia, często wykorzystywała jednak inną technikę, długoterminowe kohodowle neuronu czuciowego i motoneuronu, uzyskiwane jeden po drugim od poszczególnych zwierząt dawców i pozwalane na utworzenie synapsy w naczyniu hodowlanym 21.

My i inni 1, 3, 6, 14, 15, 16 wykorzystaliśmy łatwość, z jaką zidentyfikowane neurony mogą być celem w tym modelu, jak również ich wytrzymałość w długoterminowych eksperymentach, aby stworzyć dysocjowane krótkoterminowe kultury klastrów nominalnie jednorodnych neuronów, w których badamy prądy jonowe pod zaciskiem napięcia w konfiguracji patch clamp. Wiele neuronów Aplysia wytrzymuje powtarzające się rundy zaciskania łat, aby dać czas na długotrwałe manipulacje eksperymentalne. Technika ta jest przydatna dla neuronów, takich jak komórki torebki neurowydzielniczej zwoju brzusznego oraz neurony czuciowe zwojów opłucnej i policzkowej, których dysocjację opisujemy tutaj, ale nie dla bardzo dużych neuronów o średnicy >60 μm, takich jak L7 lub R2 zwoju brzusznego. Nie stosujemy surowicy Aplysia w naszych hodowlach, w przeciwieństwie do kokultur neuronów czuciowo-ruchowych opisanych w innych miejscach. Większość neuronów uzyskanych przy użyciu tej procedury będzie pozbawiona procesów przez pierwsze 48 godzin w hodowli, co ułatwi rejestrację napięcia całej komórki, ale następnie wykiełkuje i rozwinie aksony i inne procesy przez około 14 dni, zanim umrze z powodu braku składników odżywczych i / lub czynników wzrostu.

Ta technika tworzy pierwotne kultury 50-100 neuronów na talerz z fizjologicznie udokumentowanych regionów zwojów policzkowych i opłucnowych. Protokół ten jest przydatny dla naukowców badających aspekty fizjologii pojedynczej komórki w eksperymentach, które wymagają wielu powtórzeń eksperymentalnych na zwierzę. Wytwarza dopasowaną parę kultur ze względu na anatomiczny podział komórek docelowych na lewą i prawą hemiganglia, co pozwala na badania, które korzystają z dopasowanych kultur poddanych działaniu substancji i kontrolnych.

Protokół jest skierowany do neuronów grupy S (BSC) w zwoju policzkowym oraz neuronów brzuszno-ogonowych opłucnej (PVC) w zwoju opłucnej. Komórki te mają odpowiedni rozmiar do zapisów napięcia całych komórek i wykazują silne odpowiedzi glutaminergiczne. Omawiana metodologia jest odpowiednia dla większości zwojów nerwowych układu nerwowego Aplysia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. W dniu 1 zważ i znieczul zwierzę.
    1. Zważ zwierzę o wadze 30 g-1 kg. Znieczulenie w 5-10 objętościach zwierzęcych 1:1 wody morskiej: izotoniczny MgCl . 6H20 przez 1 godzinę z napowietrzaniem, takim jak elektryczna pompa powietrza do akwarium z dołączonym kamieniem napowietrzającym.
  2. Przygotuj materiały do preparacji.
    1. Zamontuj czystą tacę preparacyjną za pomocą prostych kołków ze stali nierdzewnej, takich jak szpilki z tkaniny. Zebrać kilka szalek Petriego zawierających sztuczną wodę morską (ASW; patrz tabele 1 i 3) + penicylinę/streptomycynę (P/S).
    2. Przygotuj mikroskop o małej mocy. Przygotuj czyste narzędzia do preparacji, takie jak prążkowane nos i cienkie kleszcze chirurgiczne oraz cienkie i duże nożyczki chirurgiczne. Przed użyciem spryskaj narzędzia 70% alkoholem izopropolowym i pozostaw do wyschnięcia.
  3. Umieść zwierzę na tacy sekcyjnej.
    1. Umieść zwierzę brzuszną stroną do dołu w tacce sekcyjnej. Przypnij zwierzę przez krawędzie ściany ciała i granice przypodialne, ale unikaj ogona i głowy, aby odsłonić powierzchnię grzbietową i rowek narządów płciowych
    2. Opłucz powierzchnię grzbietową w wolno płynącej zimnej wodzie z kranu. Nałóż lekki strumień 70% alkoholu izopropolowego z butelki do wyciskania wzdłuż rowka narządów płciowych i na czubek głowy.
  4. Wykonaj początkowe nacięcie.
    1. Używając mikroskopu o małej mocy (patrz Tabela 2) i odbitego światła, aby obserwować punkt, w którym rowek narządów płciowych zaczyna się od przedniego brzegu muszli, napięto przytrzymaj kleszczami z żebrowanym nosem fałd tkanki na lewo od tego początku, jednocześnie wycinając płytką dziurę przez gładki, płaski obszar ściany ciała tuż po prawej stronie rowka narządów płciowych za pomocą cienkich nożyczek pod kątem.
    2. Należy obserwować, jak hemolimfa wylewa się z otworu, czasami niosąc ze sobą ganglion brzuszny i żołądek.
  5. Rozszerz nacięcie.
    1. Użyj dużych nożyczek, aby rozszerzyć nacięcie do przodu do punktu między nosorożcami, jednocześnie ciągnąc w górę dolnym ostrzem, aby uniknąć nacięcia jelita. Będzie można zaobserwować, że narządy wewnętrzne wylewają się z nacięcia.
  6. Usuń zwoje nerwowe.
    1. Zmień położenie tacki i ponownie ustaw ostrość mikroskopu na obszarze głowy.
    2. Za pomocą czystych kleszczy i cienkich nożyczek usuń zwoje głowy, przecinając w pewnym momencie nerwy, które tworzą zwoje głowy w pierścień wokół przełyku, aby usunąć pedał opłucnowy i zwoje mózgowe jako grupę.
    3. Usuń zwój policzkowy, który przylega do brzusznej strony przełyku.
    4. Usuń zwój brzuszny, przecinając 4 duże łączniki nerwowe, które wychodzą z tego ganglionu.
  7. Wyizoluj zwoje zainteresowania.
    1. Rozsuń zwoje głowy, pozostawiając długość łączników przyczepioną do każdego interesującego zwoju, która jest równa co najmniej średnicy zwoju; opóźni to nadmierne trawienie enzymów w interesujących komórkach w następnym kroku.
    2. Przeprowadź każdy docelowy ganglion przez 2 płukania ASW + P/S, przesuwając się między płukaniami czystymi kleszczami.
    3. Jeśli celujesz w komórki PVC, pozostaw prawy hemiganglion opłucnej przymocowany do półramienia prawego pedału i podobnie pozostaw lewy hemiganglion opłucnej przymocowany do półramienia lewego pedału.
    4. Wyrzuć niechciane zwoje i resztę zwierzęcia zgodnie z przyjętą praktyką badawczą.
  8. Enzymatycznie trawić zwoje jaj.
    1. Dla każdego ganglionu przygotować 1 ml roztworu enzymatycznego składającego się z 3,75 mg dypazy, 1 mg hialuronidazy i 0,3 g kolagenazy typu XI na ml ASW + P/S w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    2. Umieść wypłukane zwoje w roztworze enzymu i mocno przykręć nasadkę. Umieścić probówkę na boku na wytrząsarce obrotowej (patrz Tabela 2) na niskich obrotach przez 13-5 godzin przez noc w temperaturze około 23 °C (temperatura pokojowa).
  9. Przygotuj potrawy z kultur.
    1. Przed mikrodysekcją (dzień 2) przygotuj szalki hodowlane pokryte poli-D-lizyną (PDL) w kapturze do hodowli tkankowych. Dodaj ~0,5 ml PDL (0,2 mg/ml sterylnej wody) do środka naczynia o średnicy 35 mm na ~25 min.
    2. Spłucz PDL 3x sterylną wodą. Pozostawić do wyschnięcia. Sterylizuj płytki promieniami UV.
  10. Dzień 2 Wyizoluj neurony.
    1. Napełnij środek naczyń o średnicy 35 mm, które zostały pokryte PDL i wysterylizowane promieniami UV, około 0,5 ml ASW + P/S, aby utworzyć wyspę podłoża wewnątrz suchego naczynia. Można to zrobić na stole, poza kapturem do hodowli tkankowych. Na każde skupisko komórek pochodzących z półzwoju należy przygotować jedno danie.
    2. Przygotować naczynie rozwarstwiające o średnicy 100 mm, wykonane przez powlekanie sylgardem i utwardzanie powierzchni rozwarstwiania o głębokości 5 mm, wyposażone w drobne szpilki preparacyjne o kilku rozmiarach, które mają być używane jako kołki i sondy (patrz Tabela 3). Opłucz to naczynie 70% alkoholem izopropolowym, następnie ASW + P/S, a na koniec napełnij je ASW + P/S.
  11. Przygotować mikrodysekcję strawionych zwojów nerwowych.
    1. Wlać roztwór enzymu zawierający strawiony pedał opłucnowy i zwoje policzkowe do naczynia rozwarstwiającego.
    2. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu na czarnej powierzchni w odbitym świetle.
    3. Za pomocą dołączonej tkanki łącznej przypnij każdą stronę grzbietową hemiganglion pedału opłucnej do góry. Tkanki będą miękkie i nietolerancyjne rozciągania.
  12. Mikrodysekcja neuronów PVC.
    1. Używając 2 par czystych, drobnych kleszczy i trzymając drobną szpilkę do wypreparowania w jednej parze kleszczy jako sondę, odizoluj komórki PVC od półzwoju opłucnej. Trawienie enzymatyczne usunie lub rozbije osłonkę tkanki łącznej pokrywającą klaster PVC, ale komórki będą ze sobą przylegać.
    2. Użyj sondy, aby odłączyć te komórki od łącznika pedał-opłucna18, a następnie pozwól, aby klaster komórek opadł na dno naczynia rozwarstwiającego.
  13. Przenieś neurony do naczynia hodowlanego.
    1. Przenieś klaster komórek do przygotowanego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm, delikatnie zasysając klaster do końcówki lekko wypolerowanej jednorazowej szklanej pipety Pasteura, a następnie powoli dozując go do wyspy pożywki w naczyniu hodowlanym, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do pipety. Powtórzyć izolację klastra PVC drugiego hemiganglionu i umieścić w oddzielnym naczyniu hodowlanym.
  14. Mikrodysekcja i transfer neuronów BSC.
    1. Przypnij zwój policzkowy brzuszną stroną do góry, uważając, aby oszczędzić interesujące komórki. Powtórz krok 1.12 z 2 skupiskami komórek BSC w zwoju policzkowym10.
    2. Izolacja neuronów PVC i BSC pozwoli na uzyskanie 4 szalek hodowlanych zawierających klastry neuronów: 2 szalki zawierające klastry BSC i 2 szalki zawierające klastry PVC. Odrzucić resztę zwojów nerwowych i odłożyć naczynie do rozwarstwiania o średnicy 100 mm.
  15. Oddziel skupiska komórek.
    1. Umieścić naczynie hodowlane zawierające komórki na stoliku mikroskopu małej mocy i zdjąć pokrywę.
    2. Oddziel klaster PCW, delikatnie przesuwając dno naczynia hodowlanego przylegającego do klastra komórkowego za pomocą cienkiej szpilki rozwarstwiającej trzymanej w kleszczach. Flicking to wbijanie końcówki szpilki w plastik dna naczynia, jakby próbował wykopać drobinkę plastiku. Kiedy tarcie o plastik zwalnia punkt szpilki, przez medium wytwarzana jest fala udarowa, która rozbija pobliską kępę komórek.
    3. 5-10 ruchów może być potrzebnych do prawie całkowitego rozdzielenia komórek, ale lepiej jest pozostawić małe skupiska komórek, niż pstrykać zbyt dużo, aby komórki nie zostały zniszczone przez mechaniczne prześwitywanie.
    4. Załóż pokrywę i powtórz z innymi naczyniami hodowlanymi.
  16. Przechowuj kultury komórkowe.
    1. Umieścić szalki hodowlane zawierające wyspy pożywki w ich środkach ze zdysocjowanymi komórkami w dużym pojemniku umożliwiającym cyrkulację powietrza, takim jak okrągła plastikowa szalka Petriego o wymiarach 150 x 25 mm, i umieścić tę szalkę w inkubatorze ustawionym na 17 °C.
    2. Zainstaluj w komorze otwarte naczynie z wodą jako źródło wilgoci. Pozostaw na noc w spokoju. Komórki będą przylegać do powłoki poli-D-lizynowej na środku naczynia.
  17. Naczynia z kulturą powodziową.
    1. W dniu 3 delikatnie zalej szalki 2,5 ml ASW + P/S. Zbadaj i policz komórki za pomocą mikroskopu z odwróconą hodowlą komórek. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 17 °C.

2. Elektrofizjologia

Metoda to standardowe zaciskanie łatek, które zostało opisane w licznych tekstach (np. Sakmann i Neher, 1995)16. Protokół ten będzie działał na komórkach o pojemności ≤100 pF lub komórkach o średnicy <60 μm w dniach 3 i 4 protokołu. Komórki bez procesów są optymalne do nagrywania. Obowiązują następujące uwagi specjalne:

  1. Większe ogniwa można dostosować za pomocą ustawienia konfiguracyjnego wzmacniacza Axopatch 200B ustawionego na β=0,1. Aktywacja bardzo dużych prądów może spowodować ucieczkę ogniw z cęgów napięciowych. Roztwory ASW podstawione zawartością soli (np. frakcja NaCl podstawiona nieprzepuszczalnym chlorkiem N-metylo-D-glukaminy) mogą być stosowane w celu zmniejszenia amplitudy prądu całego ogniwa.
  2. Odpowiednie są pipety z plastrami borokrzemianowymi wypełnione włóknami, naciągnięte na ściągacz do pipet i wypełnione do połowy roztworem wewnątrzkomórkowym (ICS) składającym się z 450 mM KCl i innych soli (patrz Tabela 1), które powinny mieć rezystancję około 0,5-1 MOhms. Jeśli pożądana jest izolacja określonych prądów jonowych, na przykład prądów Na+ przy braku prądów K, K+ w tym roztworze można zastąpić innymi jonami, takimi jak Cs+. Cl- zastąpienie ICS nieprzepuszczalnym anionem jest również uzasadnione, jeśli pożądany jest bardziej naturalny ICS9.
  3. Ogniwa są wytrzymałe i możliwe są zapisy trwające >1 godziny w temperaturze pokojowej. Zapis jest optymalny w 3 i 4 dniu protokołu, co odpowiada 24-48 godzinom w hodowli. Po 48 godzinach pojawiają się trudności z tworzeniem uszczelek gigaOhm, być może z powodu tworzenia się glikokaliksu na powierzchni komórki i problemów z zaciskiem przestrzennym spowodowanych przerostem procesu. Komórki są jednak przydatne do badań bez zacisku punktowego, takich jak toksykologia, które można ukończyć w ciągu <14 d.
  4. ASW i inne roztwory, które mają być dozowane z urządzenia do roztworu zasilanego grawitacyjnie, a także roztwór wewnątrzkomórkowy, powinny być filtrowane przez zamontowany w strzykawce filtr Acrodisk 0,2 μm (Tabela 3) w celu wyeliminowania drobnych cząstek, które zakłócają tworzenie się uszczelnienia gigaOhm.
  5. Odczulanie następuje przy stosowaniu agonistów, takich jak D-asparaginian (D-Asp), dlatego zaleca się ~1-2 minuty między aplikacjami agonistów. I odwrotnie, wzmocnienie jest często obserwowane przy szybkim, powtarzającym się stosowaniu agonistów, takich jak L-glutaminian (L-Glu).
  6. Prądy aktywowane przez agonistów, takie jak L-Glu, można badać, stosując agonistów za pomocą pipety picospritzer. Pipeta ta jest ciągnięta tak samo jak pipeta z plastrem i zawiera agonistę w ASW. Gdy końcówka tej pipety zostanie umieszczona poniżej rury odpływowej urządzenia do roztworu zasilanego grawitacyjnie i pod kątem 45° od rury odpływowej (rysunek 2F), agonista zostanie szybko wypłukany z ogniwa, a odczulanie zostanie zminimalizowane. Pipeta agonistyczna powinna tworzyć kąt 90° lub większy w stosunku do pipety z plastrem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Lokalizacje neuronów sensorycznych w zwojach, które są celem w niniejszym protokole – neuronów BSC i PVC – przedstawiono na Rysunku 1. Neurony BSC znajdują się w dwóch symetrycznych owalnych skupiskach po stronie brzusznej zwoju gębowego, czyli na powierzchni skierowanej w stronę przeciwną do masy gębowej w nienaruszonym zwoju (Rysunek 1A). Neurony PVC tworzą obustronne skupiska w kształcie litery V, które owijają się wokół powierzchni grzbietowej zwoju pleadingowego w kierunku osi centr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj techniki dysocjacji dają kultury neuronów czuciowych zawierające 50-100 izolowanych neuronów przeplatanych niewielką liczbą komórek glejowych i innych niezidentyfikowanych komórek. Najbardziej krytycznymi krokami w protokole są czas, w którym zwoje pozostają w roztworze enzymu, oraz migotanie, dysocjacja strawionych klastrów komórkowych w celu rozbicia klastra na pojedyncze komórki. Trawienie enzymatyczne (krok 1.8) musi być zoptymalizowane w dostępnej temperaturze. W temperaturze 23 °C z powolnym wstrząsan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ufundowane przez NIH P40 OD010952, Fundację Korein, stypendium Uniwersytetu Miami dla SLC i stypendium Maytag dla ATK. Autorzy wyrażają wdzięczność pracownikom National Resource for Aplysia, a także Lauren Simonitis i Hannah Peck, które dostarczyły mikrofotografie do rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sztuczna woda morska ASWSigma-Aldrichróżne(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6
Roztwór wewnątrzkomórkowySigmaróżne(mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA i 40 HEPES-KOH, pH 7,4
Poli-D-lizynaSigmaP6407 
penicylina/streptomycyna dodana do ASW o 1:100Lonzo Walkersville, Inc.17-603E5 000 jednostek/ml penicyliny plus 5 000 mg/ml streptomycyny
Neutralna dyspaza IIRoche Diagnostics10165859001 
hialuronidazaSigma-AldrichH4272 
kolagenaza typu XISigma-AldrichC9407 
L-glutaminian (L-Glu)Sigma-Aldrich49601-100G 
D-asparaginian (D-asp)Sigma-Aldrich11200-10G 
N-metylo-D-asparaginian (NMDA)Biomol100002-268 
L-AspSigmaA6683-25G 
Kwas alfa-amino-3-hydroksylo-5-metylo-4-izoksazolowo-propionowy (AMPA)SigmaA6816-5MG 
Antagoniści L-Glu Rróżne 
agar 
kynurenateSigma-Aldrich61250 
APVSigma-AldrichA5282 
Kwas DL-2-amino-5-fosfonopentanowy (antagonista NMDAR) 
2-propanolVWRSPBDH1133 
Roztwór chlorującySigmaróżne25 g FeCl3 + 25 ml stężonego HCl + 50 ml H2O
Silikon Sylgard 2-częściowy polimerWorld Precision Instruments (WPI)SYL184Zapewnia powierzchnię wyprowadzającą dla małych naczyń preparacyjnych
Mikroskop z powiększeniem 0-40x do sekcjiDziki 
Techniquip 150 watów Oświetlacz światłowodowyMikrooptyka FlorydyTQ FOI-150 
oscylacyjna RotoMix 50800 
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym Nikon Diaphot z obiektywami 4x, 20x (opcjonalnie) i 40xSR Research Ltd.Eyelink II&nbsp;
Oscyloskop cyfrowy TektronixSR Research Sp. z o.o. 
Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych pClamp 10Urządzenia molekularne 
Komputer PC z systemem operacyjnym Windows XP lub nowszymRozwiązaniaThinkserver z półprzewodnikowymi dyskami twardymi (80 GB) i monitorami o niskim poziomie szumów
Ściągacz do mikropipet P87 Flaming/BrownSutter Instruments, Novato, CA&nbsp;
Axon Instruments Wzmacniacz cęgowy Axopatch 200B o zakresie kompensacji pojemności 1-1000 pF; przedwzmacniaczMolecular Devices, Sunnyvale, CA&nbsp;
Zespół uchwytu elektrody Axon instruments do przedwzmacniacza Axopatch 200BMolecular Devices, Sunnyvale, CACV203BU 
Digidata 1200 Przetwornik A/DUrządzenia molekularne, Sunnyvale, CA&nbsp;
Picospritzer, zasilany przez N2 z regulacją ciśnienia i czasu trwaniaParker Hannifin, Cleveland, OH&nbsp;
TMC Micro-G Stół wibroizolacyjnyAmetek 
KlatkaFaradaya produkcja na zamówienie
Burleigh Piezoelektryczne mikromanipulatory z klapkąBurleigh Instruments; Thorlabsobecnie PCS-5000; -6000 seria + mocowania
manipulatorów ręcznych Narishige M-152 (do systemu perfuzyjnego i pikospritzera)Narishige USA&nbsp;
Szklana pipeta z filamentem, 1,5 mm średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna 0,84 mm -WPI1B150-3 
3 cale długości 
Ag/AgCl półogniwoWPIEP4 
Probówki wirówkowe 15 ml, 35-2097 Probówki wirówkowe BD Falcon*VWRSP21008-918 
Nożyczki kątoweNarzędzia do nauki15006-09 
Dumostar Szczypce do drobnych narzędzinaukowych11295-00 
Szalki do hodowli tkankowych sokoła 35 mmVWRSP25382-064 
Szalki do hodowli tkankowych Falcon 150 x 25 mm; 1013VWRSP1013można również przerabiać na małe naczynia rozwarstwiające z sylgardem
sylgard WPISYL184 
Taca do sekcji zwierzątróżne 
Probówki wirówkowe 15 ml, 35-2097 BD FalconVWRSP21008-918Do 6-otworowego grawitacyjnego systemu perfuzyjnego
Aluminiowe klipsy z końcówkami naz narzędziamiDo systemu perfuzyjnego
Igły o rozmiarze 23 (ręcznie piłuj punkty)VWRSPDo systemu perfuzyjnego
Rurka polietylenowa 0,022"ID x 0,042"OD; 427411Becton-DickinsonDo system perfuzyjny
H-7 stojak/uchwyt na pipety do mikronasadki do perfuzjiNarishige USADo
zaworów jednokierunkowychDo systemu perfuzyjnego
Drummond Microcaps 1 μ lVWRSPDo systemu perfuzyjnego
18 igieł do odsysania (punkty spiłowania) 
Rurka polietylenowaCole Parmer4.27436E+11 
drobne szpilki preparacyjneFine Science Tools26002-20 
rurki kapilarneKimble 71900-100polerowane ogniowo i w kształcie litery U w płomieniu palnika Bunsena i wypełnione 3% agarem w
sklepieplasteliną 
uchwyt na talerz do stolika mikroskopowego z izolowaną kąpieląPipety
pasteuraVWRSP14672-412 
żarówki do pipetVWRSP53283-911 
filtry strzykawkowe acrodiskVWRSP28144-040 
grubościenne szkło borokrzemianowe o średnicy 1,5 mmWPI1B150F-3 
Butla z azotem o wysokiej czystości i regulator 

Tabele 1-3. Wykazy odczynników, materiałów i sprzętu.

Mieszarka komputerowe Sklep systemu perfuzyjnego z ECS gruntową produkcji na zamówienie bifurcyjny

Bibliografia

  1. Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
  2. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
  3. Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
  4. Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
  5. Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
  6. Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
  7. Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
  8. Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
  9. Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
  10. Kandel, E. R. Cellular basis of behavior. , W.H. Freeman. New York. (1976).
  11. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  12. Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
  13. Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
  14. R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  15. Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
  16. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).
  17. Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
  18. Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
  19. Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
  20. Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
  21. White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
  22. Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
  23. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja neuronów sensorycznychsekcja zwojutrawienie enzymatycznedysocjacja komórekprzygotowanie szalki hodowlanejclamp napięciowyutrzymanie hodowli neuronalnych
Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.