Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka. Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza. Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Eksperymentalne modele in vivo raka wątrobowokomórkowego (HCC), które rekapitulują ludzką chorobę, stanowią cenną platformę do badań nad patofizjologią choroby i do przedklinicznej oceny nowych terapii. Przedstawiamy różnorodne metody generowania podskórnych lub ortotopowych ludzkich ksenoprzeszczepów HCC u myszy z niedoborem odporności, które można wykorzystać w różnych zastosowaniach badawczych. Koncentrując się na wykorzystaniu pierwotnej tkanki nowotworowej od pacjentów poddawanych resekcji chirurgicznej jako punktu wyjścia, opisujemy przygotowanie zawiesin komórkowych lub fragmentów guza do ksenoprzeszczepu. Opisujemy konkretne techniki ksenoprzeszczepu tych tkanek i) podskórnie; lub ii) dowątrobowo, albo przez bezpośrednią implantację komórek lub fragmentów nowotworowych do wątroby, albo pośrednio przez wstrzyknięcie komórek do śledziony myszy. Opisujemy również zastosowanie częściowej resekcji natywnej wątroby myszy w czasie ksenoprzeszczepu jako strategii indukowania stanu aktywnej regeneracji wątroby u myszy biorcy, która może ułatwić wszczepienie do wątroby pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych. Przedstawiono oczekiwane wyniki tych technik. Opisane protokoły zostały zwalidowane przy użyciu pierwotnych próbek ludzkiego HCC i ksenoprzeszczepów, które zazwyczaj działają mniej solidnie niż dobrze znane ludzkie linie komórkowe HCC, które są szeroko stosowane i często cytowane w literaturze. W porównaniu z liniami komórkowymi omówiono czynniki, które mogą przyczyniać się do stosunkowo niskiej szansy na pierwotne wszczepienie HCC w modelach ksenotransplantacyjnych oraz zwracamy uwagę na kwestie techniczne, które mogą mieć wpływ na kinetykę wzrostu ksenoprzeszczepu. Sugerujemy również metody, które należy zastosować, aby uzyskane ksenoprzeszczepy dokładnie przypominały macierzyste tkanki HCC.
Wprowadzenie
Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest piątym najczęściej występującym nowotworem na świecie i najszybciej rosnącą przyczyną zgonów z powodu raka w Ameryce Północnej. Najbardziej rozpowszechnionym czynnikiem ryzyka HCC jest marskość wątroby, najczęściej występująca z powodu przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby, nadużywania alkoholu, choroby autoimmunologicznej lub dziedzicznych zaburzeń metabolicznych 1.
Pomimo dużego obciążenia chorobowego nałożonego przez HCC na populacje na całym świecie, patofizjologia HCC jest stosunkowo słabo poznana w porównaniu z innymi powszechnymi nowotworami, takimi jak rak jelita grubego, piersi czy prostaty. Na przykład konkretne zdarzenia molekularne i komórkowe napędzające nowotworzenie muszą być jasno określone 2. Podobnie jak w przypadku większości innych nowotworów nabłonka litego, podejścia genomiczne ujawniły heterogeniczność aberracji związanych z HCC 3. Wiele badań wykazało nieuporządkowaną aktywność różnych szlaków sygnałowych zaangażowanych w proliferację, przeżycie, różnicowanie i angiogenezę komórek 4. Ponadto rola nowotworowych komórek macierzystych w patobiologii HCC pozostaje do wyjaśnienia 5.
Z ograniczonym zrozumieniem patofizjologii HCC, arsenał skutecznych terapii HCC również pozostał stosunkowo ograniczony. Pacjenci we wczesnym stadium z guzami ograniczonymi do wątroby są kandydatami do terapii leczniczej za pomocą ablacji guza lub resekcji chirurgicznej, chociaż nawroty są częste. U pacjentów z bardziej zaawansowaną chorobą chemioterapia i radioterapia mają ograniczoną skuteczność i są stosowane głównie do kontroli choroby z zamiarem paliatywnym 6.
Wysokiej jakości modele eksperymentalne in vivo ludzkiego HCC stanowią zatem cenną platformę dla bardzo potrzebnych badań podstawowych nad patofizjologią ludzkiego HCC, jak również dla oceny nowych podejść terapeutycznych. W porównaniu z wykorzystaniem linii komórkowych lub wysoce zdefiniowanych modeli mysich, ksenoprzeszczepy pierwotnych guzów ludzkich u myszy z niedoborem odporności okazały się cennymi narzędziami do takich badań, ponieważ są w stanie podsumować ludzką chorobę z dużą wiernością, jednocześnie uchwycając heterogeniczność, która jest obecna w obrębie i między różnymi pacjentami 7,8. W tym celu opracowaliśmy różne metody oznaczania ludzkich ksenoprzeszczepów HCC u myszy z niedoborem odporności. Podczas gdy większość opublikowanych badań z udziałem ksenoprzeszczepów HCC opisuje wykorzystanie do tego celu dobrze ugruntowanych linii komórek ludzkich HCC, skupiliśmy się na optymalizacji naszych testów w celu generowania ksenoprzeszczepów z pierwotnych próbek HCC uzyskanych natychmiast po resekcji chirurgicznej od pacjentów.
Różne techniki ksenoprzeszczepu mogą być wymagane do różnych zastosowań badawczych. Na przykład ksenoprzeszczepy podskórne generowane z fragmentów guza są generowane szybko, są łatwe do monitorowania i mogą być bardziej odpowiednie do miejscowego podawania nowych terapii z wygodnym monitorowaniem odpowiedzi guza. Ksenoprzeszczepy wewnątrzwątrobowe mogą być bardziej istotne dla badań dotyczących roli mikrośrodowiska wątroby w biologii HCC. Ksenoprzeszczepy wytworzone z zawiesin komórek nowotworowych są niezbędne do identyfikacji i charakterystyki podzbiorów komórek inicjujących nowotwór lub do eksperymentów wymagających manipulacji in vitro komórek nowotworowych przed ksenotransplantacją. W związku z tym opracowaliśmy i zwalidowaliśmy następujące protokoły w celu ustalenia ksenoprzeszczepów podskórnych lub wewnątrzwątrobowych z zawiesin komórkowych lub fragmentów guza pochodzących z pierwotnych próbek HCC u ludzi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Schematyczny przegląd protokołu jest przedstawiony na rysunku 1.
1. Przetwarzanie próbek HCC od ludzi
Zdobądź pierwotne próbki HCC z pisemną zgodą pacjenta i za zgodą instytucjonalnej komisji etyki badań. Protokoły te zostały przeprowadzone w naszej instytucji za zgodą Rady ds. Etyki Badań Naukowych Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.
Zbierz świeże próbki HCC jak najszybciej po zabiegu chirurgicznym, po pobraniu odpowiednich próbek do celów klinicznych. Najlepiej, aby nastąpiło to w ciągu 30 minut po usunięciu tkanki od pacjenta. Jak pokazano na rycinie 2, próbka o wielkości co najmniej 1cm3 uzyskana z obwodu guza jest optymalna, ponieważ środkowa część guza może być martwicza. Guzy, które nie otrzymały żadnego leczenia przed resekcją, takiego jak radioterapia, chemioterapia lub ablacja, są preferowane, aby zmaksymalizować szansę na żywotność komórek nowotworowych. Z pierwotnymi tkankami ludzkimi należy obchodzić się zgodnie ze standardowymi protokołami ochrony osobistej dla materiałów niebezpiecznych biologicznie. Wszystkie manipulacje laboratoryjne tkanek nowotworowych i preparatów komórkowych należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy użyciu technik aseptycznych.
- Umieścić świeżą próbkę HCC w 10-25 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F12 bez surowicy w temperaturze 4 °C i przenieść na lodzie do laboratorium w celu natychmiastowego przetworzenia i przygotowania fragmentów tkanek i/lub komórek do ksenoprzeszczepu u myszy.
- Za pomocą sterylnych kleszczy umieść próbkę guza na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm lub innej odpowiedniej sterylnej powierzchni roboczej. Podziel próbkę guza na fragmenty o wielkości około 2-3 mm3 za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego nr 10. W tym momencie rozważ szybkie zamrożenie lub utrwalenie formaliny niektórych fragmentów guza do innych eksperymentów lub analiz, w zależności od potrzeb.
- W celu ksenoprzeszczepu fragmentów guza należy umieścić niektóre fragmenty HCC w jednej lub kilku probówkach do mikrowirówek zawierających wystarczającą ilość Matrigelu, aby fragmenty pozostały zanurzone. Trzymaj te rurki na lodzie.
- Do przygotowania zawiesiny komórek nowotworowych należy użyć ostrza skalpela chirurgicznego, aby jak najbardziej zmielić pozostałą tkankę HCC i wymieszać z 5-10 ml DMEM-F12 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w zależności od objętości zmielonej tkanki.
- Dodać kolagenazę typu IV i dyspazę II w końcowych stężeniach odpowiednio 200 jednostek/ml i 0,8 jednostki/ml. Dokładnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml.
- Zamknąć probówkę i inkubować mieszaninę z etapu 1.6 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 30-60 minut, w zależności od miękkości tkanki nowotworowej. Pipetować mieszaninę w górę i w dół kilka razy co 10 minut, aby ocenić postęp trawienia enzymatycznego.
- Po zakończeniu trawienia przepuść roztwór nowotworowy przez sitko komórkowe o wielkości 100 μm. Delikatnie zetrzyj pozostałą tkankę na sitku do komórek za pomocą końcówki pipety o pojemności 25 ml, aby umożliwić przejście maksymalnej liczby komórek nowotworowych. Zebrać odcedzoną zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować zawiesinę komórek nowotworowych z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Delikatnie zdekantować supernatant. W zależności od wielkości osadu, dodaj 2-5 ml lodowatego lodu 1x bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC) i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić osad. Trzymaj na lodzie przez 5 minut.
- Dodać DMEM-F12 do całkowitej objętości 15 ml i odwirować z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu wypłukania buforu do lizy RBC.
- Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórek nowotworowych wolnych od erytrocytów w DMEM-F12.
- Policz żywe komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika komórek.
- Odwirować podwielokrotności komórek nowotworowych zawierające pożądaną liczbę komórek do wstrzyknięcia, jak opisano powyżej, ponownie zawiesić powstałe osady komórkowe w 30 μl lodowatego Matrigelu i przechowywać na lodzie.
Opcjonalnie: Po kroku 1.11 rutynowo usuwamy ludzkie komórki CD45+ (leukocyty) z zawiesiny komórek nowotworowych i/lub oczyszczamy podzbiory komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek immunomagnetycznych. Szczegółowe protokoły dla tych technik są dobrze opisane przez producentów odpowiednich przeciwciał, kulek i cytometrów przepływowych.
Uwaga: Protokół opisany powyżej może być również wykorzystany do przetwarzania ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych pobranych od myszy w celu przeprowadzenia seryjnego przeszczepu, zastępując tkankę ksenoprzeszczepu pierwotną ludzką tkanką HCC w kroku 1.1. W tej sytuacji, po kroku 1.11, rutynowo usuwamy naciekające komórki mysie z zawiesiny komórkowej za pomocą przeciwciała przeciwko mysiemu antygenowi zgodności tkankowej H2k.
2. Ksenografia
Przeprowadzaj wszystkie procedury na zwierzętach zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami. Procedury opisane w niniejszym dokumencie zostały przeprowadzone zgodnie ze specjalnym Protokołem Wykorzystania Zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia zgodnie i zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi agencjami, przepisami i wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi.
Sprzęt do dostarczania wziewnych lotnych środków znieczulających małym zwierzętom powinien być używany zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi zakładu dla zwierząt i instytutu badawczego. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać przy użyciu techniki aseptycznej i sterylnych narzędzi w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Wykorzystaj nieotyłe cukrzycowe szczepy ciężkiego złożonego niedoboru odporności (NOD / SCID) lub NOD / SCID / interleukiny 2 receptora gamma zero łańcucha (NSG) myszy obu płci w wieku 6-8 tygodni (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Myszy te muszą być trzymane i utrzymywane w obiekcie zdolnym do zapewnienia warunków wolnych od patogenów, odpowiednich dla zwierząt z niedoborem odporności.
Przygotuj myszy do operacji w komorze dostarczającej 5% (v/v) wdychanego izofluranu w 1 l/min tlenu. Utrzymuj znieczulenie do momentu utraty odruchu rogówki i palców u zwierzęcia (zwierząt). W przypadku ksenoprzeszczepu podskórnego należy ogolić jeden lub więcej małych obszarów na grzbiecie zwierzęcia (zwierząt) i oczyść skórę 70% etanolem. W przypadku ksenoprzeszczepu wewnątrzwątrobowego należy ogolić brzuszną klatkę piersiową i brzuch zwierzęcia (zwierząt) od pach do okolicy pachwinowej i oczyścić skórę 70% etanolem.
2.1 Podskórne wszczepianie fragmentów guza
- Umieść znieczuloną mysz na brzuchu, utrzymując wziewne znieczulenie izofluranem (2% (v/v) w 1 l/min O2) za pomocą ustnika. Zastosuj żel łzowy, aby chronić oczy zwierzęcia przed urazami.
- Wysterylizuj ogolone obszary grzbietowe za pomocą peelingu chirurgicznego Betadine, następnie 70% etanolu, a na koniec roztworu jodu powidonu.
- Wykonaj nacięcie skóry o średnicy 5 mm za pomocą sterylnych ostrych nożyczek.
- Delikatnie włóż zamknięte nożyczki do przestrzeni podskórnej i delikatnie rozprowadź, aby powstała kieszeń wystarczająco duża, aby pomieścić fragment guza.
- Wprowadzić fragment guza przygotowany w kroku 1.3 do kieszonki podskórnej za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków.
- Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwów lub klipsów.
- Zapewnij myszowi opiekę pooperacyjną zgodnie z poniższym opisem.
2.2 Podskórne wstrzykiwanie komórek nowotworowych
- Przygotować zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.1.1 i 2.1.2.
- Załadować zawiesinę komórek nowotworowych w Matrigel przygotowaną w kroku 1.13 do strzykawki insulinowej z igłą 29 G 1/2.
- Wprowadzić igłę do przestrzeni podskórnej i opróżnić zawartość strzykawki. Przesunięcie igły o kilka milimetrów wzdłuż płaszczyzny podskórnej od miejsca nakłucia skóry zapobiega wyciekowi zawiesiny komórek nowotworowych z miejsca wkłucia po wyjęciu igły.
- Zapewnij myszowi opiekę pooperacyjną zgodnie z poniższym opisem.
2.3 Wewnątrzwątrobowa implantacja fragmentów guza
- Za pomocą igły 27 G 1/2 cala na strzykawce o pojemności 1 ml podać podskórnie 350 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej w grzbiet szyi znieczulonego zwierzęcia, aby skompensować śródoperacyjne straty płynów. W celu znieczulenia należy podać 350 μl sterylnego soli fizjologicznej zawierającej buprenorfinę (0,1 mg/kg) podskórnie na bok zwierzęcia, używając igły 27 G 1/2 cala na strzykawce o pojemności 1 ml.
- Umieść mysz na plecach na podgrzanej podkładce z nosem i ustami umieszczonymi wewnątrz ustnika, aby podać podtrzymujące znieczulenie wziewne izofluranem (2% (v/v) w 1 l/minO2).
- Wyprostuj kończyny i przymocuj je taśmą do powierzchni operacyjnej, aby zoptymalizować odsłonięcie brzusznej części brzucha i klatki piersiowej.
- Wykonaj procedurę pod lampą powiększającą, aby zoptymalizować wizualizację.
- Wysterylizuj ogoloną skórę brzusznej części brzucha i klatki piersiowej za pomocą peelingu chirurgicznego Betadyn, następnie 70% etanolu, a na koniec roztworu jodu powidonu.
- Za pomocą sterylnych ostrych nożyczek wykonaj poprzeczne obustronne podżebrowe nacięcie skóry i podziel warstwy mięśni, aby wejść do jamy otrzewnej, aby umożliwić odpowiednią ekspozycję całej wątroby.
- Umieść szew w skórze nad wyrostkiem mieczykowatym i przymocuj go do ustnika taśmą, aby umożliwić lepsze odsłonięcie wątroby i otaczających struktur.
- Użyj dwóch aplikatorów z bawełnianą końcówką przylegających i tylnych do wątroby, aby ją ustabilizować.
- Wykonaj nacięcie o długości i głębokości 3 mm na powierzchni wątroby za pomocą sterylnego ostrza skalpela nr 10.
- Natychmiast zastosuj Surgicel i delikatnie uciskaj miejsce nacięcia, aby uzyskać hemostazę; usuń po 60-90 sekundach i kontynuuj tylko wtedy, gdy osiągnięto całkowitą hemostazę.
- Umieścić fragment guza krok 1.3 w nacięciu wątroby za pomocą sterylnych cienkich kleszczy lub igły 18 G.
- Nałóż mały kawałek Surgicel na nacięcie wątroby, aby zapobiec przemieszczeniu fragmentu guza i zapewnić kontynuację hemostazy.
- Zamknij nacięcie szwami lub klipsami.
- Zapewnij opiekę pooperacyjną zgodnie z poniższym opisem
2.4 Wewnątrzwątrobowa implantacja komórek nowotworowych poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do wątroby
- Przygotuj mysz zgodnie z opisem w krokach od 2.3.1 do 2.3.7 powyżej.
- Załadować zawiesinę komórek nowotworowych (przygotowaną w kroku 1.13) do strzykawki insulinowej za pomocą igły 29 G 1/2 cala.
- Po ustabilizowaniu wątroby za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, włóż igłę strzykawki insulinowej do wątroby i przesuń końcówkę o kilka milimetrów poza miejsce nakłucia wzdłuż płaszczyzny podtorebkowej.
- Delikatnie opróżnić zawartość strzykawki, a następnie wyjąć igłę z wątroby.
- Umieść Surgicel w miejscu nakłucia i delikatnie dociśnij aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórek nowotworowych i uzyskać pełną hemostazę.
- Zamknij nacięcie szwami lub klipsami i zapewnij opiekę pooperacyjną zgodnie z poniższym opisem.
2.5 Ksenograf wewnątrzwątrobowy komórek nowotworowych poprzez wstrzyknięcie do śledziony
- Przygotuj mysz zgodnie z opisem w krokach od 2.3.1 do 2.3.5 powyżej.
- Za pomocą sterylnych ostrych nożyczek wykonaj 1 cm lewe nacięcie podżebrowe, aby wejść do jamy otrzewnej.
- Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby odbić brzuch czaszki i po prawej stronie zwierzęcia, aby odsłonić śledzionę.
- Dotykając otaczającej tkanki tłuszczowej za pomocą sterylnych, cienkich, atraumatycznych kleszczy, wprowadź śledzionę do nacięcia i umieść aplikator z bawełnianą końcówką za śledzioną, aby ją ustabilizować.
- Używając jedwabnego szwu 5-0, umieść luźny, wstępnie zawiązany węzeł wokół śledziony powyżej dolnego bieguna.
- Załadować zawiesinę komórek nowotworowych (przygotowaną w kroku 1.13) do strzykawki insulinowej za pomocą igły 29 G 1/2 cala.
- Włóż igłę strzykawki insulinowej do dolnego bieguna śledziony i przesuń ją poza poziom luźnego, wstępnie zawiązanego węzła.
- Powoli opróżnij zawartość strzykawki, wyjmij igłę ze śledziony i zaciśnij węzeł, aby zapobiec wyciekowi wstrzykniętej zawiesiny komórek nowotworowych.
- Zamień śledzionę do jamy otrzewnej.
- Zamknij nacięcie szwami lub klipsami i zapewnij opiekę pooperacyjną zgodnie z poniższym opisem.
2.6 Częściowa hepatektomia ułatwiająca wewnątrzwątrobowe wszczepienie ludzkiej tkanki nowotworowej
- Przygotuj mysz zgodnie z opisem w krokach od 2.3.1 do 2.3.7.
- Sterylnymi ostrymi nożyczkami podziel więzadło falciform przyczepione do środkowego płata wątroby.
- Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zmobilizuj lewy płat wątroby i umieść luźny, wstępnie zawiązany węzeł jedwabnego szwu 5-0 wokół lewego płata. Przesuń luźny węzeł jak najbliżej szypułki żółciowo-naczyniowej lewego płata i zaciśnij węzeł.
- Wytnij lewy płat dystalnie do ligatury za pomocą sterylnych nożyczek, pozostawiając mały kikut, aby zapobiec zsuwaniu się węzła i późniejszemu krwotokowi.
- Stosując podobną technikę, podwiąż i wytnij większość środkowego płata wątroby, omijając woreczek żółciowy.
- Użyj Surgicel i delikatnie uciskaj aplikatorem z bawełnianą końcówką wzdłuż przeciętych powierzchni miąższu wątroby, aby uzyskać pełną hemostazę.
- W przypadku ksenoprzeszczepu wewnątrzwątrobowego fragmentu guza lub komórek nowotworowych należy postępować zgodnie z krokami od 2.3.8 do 2.3.11 lub od 2.4.2 do 2.4.5, jak opisano powyżej.
- Do ksenoprzeszczepu wewnątrzwątrobowego komórek nowotworowych za pomocą wstrzyknięcia śledziony należy użyć aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby delikatnie odbić żołądek czaszki i po prawej stronie zwierzęcia, odsłaniając śledzionę. Wykonaj kroki od 2.5.4 do 2.5.9 zgodnie z powyższym opisem.
- Zamknij nacięcie szwami lub klipsami i zapewnij opiekę pooperacyjną zgodnie z poniższym opisem.
2.7 Opieka pooperacyjna
- Wyjmij mysz z ustnika do znieczulenia wziewnego.
- Umieść mysz w klatce pod lampą grzewczą na około 20 minut, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu i pełnej mobilizacji.
- Dawkę buprenorfiny należy powtarzać co 8-12 godzin w ciągu pierwszych 2-3 dni po operacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 3 przedstawia typowy wygląd podskórnego ksenoprzeszczepu ludzkiego HCC oraz odpowiadający mu obraz histopatologiczny guza. Rozwój i wzrost ksenoprzeszczepów podskórnych można łatwo monitorować poprzez codzienną obserwację myszy biorców. Przedział czasowy między ksenoprzeszczepieniem a rozwojem guza może znacznie się różnić w zależności od rodzaju tkanki (fragment guza vs. zawiesina komórkowa), źródła tkanki (pierwotna próbka od pacjenta, pasażowany ksenoprzeszczep lub linia komórkowa) oraz ilości...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy różne techniki tworzenia podskórnych i wewnątrzwątrobowych ludzkich ksenoprzeszczepów HCC u myszy z niedoborem odporności, które można zastosować do szerokiej gamy pytań eksperymentalnych i testów. Podczas gdy ksenoprzeszczepy podskórne są szeroko stosowane do badania różnych aspektów biologii HCC, ksenoprzeszczepy wewnątrzwątrobowe są rzadko opisywane w literaturze. Co więcej, większość badań opisujących zastosowanie ksenoprzeszczepów wygenerowała je z dobrze ugruntowanych linii komórkowych. Biorąc pod uwagę ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research Phase 1 Clinician-Scientist Award (A.G.) oraz Grant Operacyjny od Cancer Research Society (A.G.). Autorzy są wdzięczni dr Johnowi Dickowi za wsparcie tego projektu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’ s Mod. Orzeł Średni/Szynka’ s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Kolagenaza typu IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10% buforowany roztwór formaliny | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0,9 % sól fizjologiczna Roztwór (NaCl), sterylny | House Brand | 1011-L8001 | |
| Peeling chirurgiczny Betadine | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorfina (Temegesic) NR 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99,9 %, znieczulenie wziewne | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Żel łzowy | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Mieszanka do zamrażania | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Igła do precyzyjnego ślizgu 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Strzykawka insulinowa, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Ostrze chirurgiczne nr 10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| chirurgiczna Transpore | 3M Opieka zdrowotna | 1577-1 | |
| Aplikator bawełniany | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oksydowana celuloza regenerowana | Ethicon | 1951 | |
| m nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Oświetlenie powiększające z mobilną podstawą | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petrydish sterylny 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Kleszcz do tkanek, 1x2 zęby, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Kleszczyk opatrunkowy Adson 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Kleszczyk opatrunkowy do oczu, ząbkowany, prosty, 4" | Kleszczyki | A19-560 | |
| Hartman, zakrzywione, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Nożyce do irysa, zakrzywione, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Nożyce do irysów, proste, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Sterownik igłowy Olsen-Hegan, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
Bibliografia
- El-Serag, H. B. Hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179(2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L. Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis. Hepatology. 56, 769-775 (1002).
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294(2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
