Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Summary

Opisujemy metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Protokół ten obejmuje czyszczenie powierzchni, funkcjonalizację powierzchni i powlekanie PEG. Wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach, co zapewnia lepszą jakość pasywacji w porównaniu z istniejącymi metodami.

Abstract

Spektroskopia fluorescencji pojedynczych cząsteczek okazała się pomocna w zrozumieniu szerokiego zakresu zjawisk biologicznych w nanoskali. Ważnymi przykładami tego, co ta technika może przynieść naukom biologicznym, są mechanistyczne spostrzeżenia na temat interakcji białko-białko i białko-kwas nukleinowy. Gdy oddziaływania białek są badane na poziomie pojedynczej cząsteczki, białka lub ich substraty są często unieruchomione na szklanej powierzchni, co pozwala na długotrwałą obserwację. Ten schemat unieruchomienia może wprowadzić niepożądane artefakty powierzchniowe. Dlatego konieczne jest pasywowanie powierzchni szkła, aby była obojętna. Powlekanie powierzchni za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) wyróżnia się wysoką wydajnością w zapobieganiu niespecyficznej interakcji białek z powierzchnią szklaną. Jednak procedura powlekania polimerami jest trudna ze względu na komplikacje wynikające z serii obróbki powierzchni i rygorystyczny wymóg, aby powierzchnia była wolna od jakichkolwiek cząsteczek fluorescencyjnych pod koniec procedury. Tutaj zapewniamy solidny protokół z instrukcjami krok po kroku. Obejmuje czyszczenie powierzchni, w tym trawienie piranii, funkcjonalizację powierzchni grupami aminowymi i wreszcie powlekanie PEG. Aby uzyskać wysoką gęstość warstwy PEG, wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch cyklach, co znacznie poprawia jakość pasywacji. Zapewniamy reprezentatywne wyniki, a także praktyczne porady dla każdego krytycznego etapu, aby każdy mógł osiągnąć wysoką jakość pasywacji powierzchni.

Introduction

Podczas badania białka jednocząsteczkowego ważne jest osiągnięcie wysokiej jakości pasywacji powierzchniowej, tak aby eksperyment był wolny od jakichkolwiek indukowanych powierzchniowo nieprawidłowości białkowych lub denaturacji ^1,2. Podczas gdy szklana powierzchnia poddana działaniu środków powierzchniowo czynnych, takich jak albumina surowicy bydlęcej, jest powszechnie stosowana do badań pojedynczych cząsteczek kwasów nukleinowych ³, stopień jej pasywacji nie jest wystarczająco wysoki do badań białek. Szklana powierzchnia pokryta polimerem (glikol polietylenowy, PEG) jest lepsza pod względem pasywacji ^4-6. W związku z tym stał się powszechnie stosowany do badań białek jednocząsteczkowych, odkąd został wprowadzony do badania fluorescencji pojedynczych cząsteczek ^7-10. Procedura powlekania polimerowego wymaga wielu zabiegów powierzchniowych ^7,11,12. Dlatego trudno jest prześledzić całą procedurę bez szczegółowych instrukcji. Często stopień pasywacji powierzchni różni się w zależności od przestrzeganego protokołu. W tym miejscu przedstawiamy solidny protokół z instrukcjami krok po kroku, który usunie jedno z głównych wąskich gardeł w badaniach nad białkami jednocząsteczkowymi. Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem.

Protocol

1. Przygotowanie i czyszczenie szkiełek

Komora mikroprzepływowa składa się ze szkiełka kwarcowego i szkiełka nakrywkowego. W mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia typu pryzmatycznego (TIRF) obrazowana jest powierzchnia szkiełka kwarcowego. Dlatego ważne jest, aby dokładnie wyczyścić szkiełko kwarcowe za pomocą roztworów_H2O, acetonu, KOH i piranii. Wieloetapowe czyszczenie eliminuje fluorescencyjne cząsteczki organiczne na powierzchni, które zakłócają pomiary fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Dodatkowo trawienie piranii sprawia, że powierzchnia kwarcu staje się hydrofilowa poprzez wytwarzanie grup hydroksylowych. Wolne grupy hydroksylowe są niezbędne w reakcji aminosilanizacji w kroku 3.

1. Wiercenie zjeżdżalni kwarcowych. Wywierć parę otworów w szkiełku kwarcowym za pomocą wiertła diamentowego 3/4 mm (Rysunek 2a). Jeśli pożądanych jest wiele kanałów, wywierć więcej par otworów (Rysunek 2b). Otwory te służą do wstrzykiwania roztworów do komory mikroprzepływowej w kroku 7.
   Podczas
   1. wiercenia utrzymuj wiertło mokre w H₂O. H₂O działa jako smar, co wydłuża żywotność wiertła.
   2. Okazjonalne wycieranie końcówki wiertła pomaga w wierceniu otworów.
   3. Po wywierceniu otworów należy oznaczyć jedną stronę szkiełka, aby ułatwić identyfikację podczas procesu PEGylacji. Znaczniki mogą służyć jako odniesienie, aby uniknąć późniejszych nieporozumień. Do znakowania można użyć wiertła diamentowego. Nie używaj długopisu, ponieważ atrament może dostać się na powierzchnię.
2. Czyszczenie za pomocą_H2O. Umieścić szkiełka w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od 5 do 15 szkiełek. Opłucz szkiełka za pomocą MilliQ H₂O. Powtórz to 3 razy i poddaj sonikacji szkiełek za pomocą MilliQ H₂O przez 5 minut, aby usunąć brud. Wylać wodę i ponownie przepłukać szkiełka 3 razy za pomocą MilliQ_{H 2}O. Należy pamiętać, że 130 W to moc sonikacji używana w tym protokole. Wyższa moc sonikacji może skrócić żywotność szkiełek kwarcowych.
3. Czyszczenie acetonem. Zastąp MilliQ H₂O acetonem. Sonikować szkiełka acetonem przez 20 minut lub dłużej.
4. Płukanie za pomocą_H2O. Wyrzucić aceton i przepłukać szkiełka MilliQ_H2O. Powtórzyć tę czynność 3 razy w celu usunięcia pozostałości acetonu.
5. Czyszczenie za pomocą KOH. Zastąp wodę 1 M KOH i sonikuj szkiełka przez 20 minut lub dłużej. Nadmierne trawienie (np. nocna obróbka KOH) poprawi jakość powierzchni, ale wprowadzi rysy, które mogą zakłócać obrazowanie fluorescencyjne.
6. Płukanie za pomocą_H2O. Przepłukać szkiełka środkiem MilliQ_{H 2}O 3 razy, aby usunąć ślady KOH.
7. Akwaforta pirania.
   1. Przenieś szkiełka do uchwytu na szkiełka Duran lub wykonanego na zamówienie uchwytu teflonowego i umieść je w zlewce (1 l) znajdującej się w kapturze chemicznym.
   2. Napełnić zlewkę 450 ml H₂SO₄.
   3. Dodać 150 ml_H2O2w stosunku 3:1 między_H2SO4 i_H2O2. Gdy roztwór zaczyna spontanicznie wrzeć, temperatura wzrasta o ponad 90 °C. Przed rozpoczęciem reakcji upewnić się, że roztwór_H2O2ma temperaturę pokojową. W przeciwnym razie temperatura wrzącego roztworu może być niższa niż 90 °C.
   4. Wymieszaj roztwór w celu prawidłowego wymieszania i pozostaw zlewkę w spokoju przez 20 minut.
   5. Wyjąć szkiełka z roztworu piranii wraz z uchwytem szkiełka i umieścić je w uchwycie na szkiełko zawierające MilliQ H₂O. W międzyczasie wyrzuć roztwór piranii do wyznaczonej butelki na odpady, gdy osiągnie temperaturę pokojową.
   6. Przepłukać szkiełka 3 razy preparatem MilliQ H₂O. W dalszych krokach należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia szkiełek. Przejdź do kroku 3. Zaleca się natychmiastowe wykonanie następujących kroków.
      * Uwaga: Roztwór piranii jest wyjątkowo reaktywny. Podczas obchodzenia się z tym roztworem należy zachować szczególną ostrożność. Ponadto, gdy zostanie przypadkowo zmieszany z rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak aceton, może spowodować wybuch.

2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

Komora mikroprzepływowa składa się ze zjeżdżalni kwarcowej i pokrywy. Gdy używany jest pryzmatyczny mikroskop TIRF, powierzchnia szkiełka nakrywkowego nie jest obrazowana. Dlatego wystarczy wyczyścić szkiełko nakrywkowe tylko za pomocą_H2Oi KOH. W przypadku, gdy konieczne jest zobrazowanie szkiełka nakrywkowego (np. za pomocą obiektywowego mikroskopu TIRF), zaleca się potraktowanie szkiełek nakrywkowych roztworem piranii (krok 1.7). Należy zauważyć, że jeśli pegylacja powierzchni szkiełka nakrywkowego nie jest wysokiej jakości, może działać jako pochłaniacz dla białek i powodować zmiany w stężeniu białka.

1. Płukanie za pomocą_H2O. Umieścić szkiełka nakrywkowe (24 x 30, 24 x 40 lub 24 x 50 mm²) w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od 5 do 15 szkiełek nakrywkowych. Spłucz szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą MilliQ H₂O.
2. Czyszczenie za pomocą KOH. Zastąp wodę 1M KOH i sonikuj szkiełka nakrywkowe przez 20 minut lub dłużej.
3. Płukanie za pomocą_H2O. Spłukać szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą MilliQ_H2O, aby usunąć ślady KOH. Przejdź do kroku 3.

3. Amino-silanizacja szkiełek i szkiełek nakrywkowych

Funkcjonalizacja powierzchni szkiełek kwarcowych i szkiełek nakrywkowych grupą aminową za pomocą chemii amino-silanizacyjnej. Metanol jest stosowany jako rozpuszczalnik, a kwas octowy jako katalizator reakcji aminosilanizacji.

1. Płukanie metanolem. Zastąp MilliQ H₂O w naczyniach do barwienia (z kroków 1 i 2) metanolem. Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w metanolu do kroku 3.3. Nie należy przechowywać szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych w metanolu przez niepotrzebnie długi okres czasu (np. kilka godzin), ponieważ zanieczyszczenia zawarte w metanolu będą adsorbować się na powierzchni.
2. Przygotowanie roztworu aminosilanizacy.
   1. Przepłukać kilkakrotnie kolbę Pyrexu metanolem. Sonikować kolbę metanolem przez 5 minut lub dłużej. Zaleca się posiadanie dedykowanej kolby, która jest utrzymywana w czystości.
   2. Wlać 100 ml metanolu do kolby.
   3. Dodać 5 ml kwasu octowego.
   4. Dodać 3 ml APTES (3-aminopropylotrimetoksysilanu) i delikatnie wymieszać, wstrząsając.
3. Amino-silanizacja. Zastąp metanol w naczyniach barwiących, które zawierają szkiełka i szkiełka nakrywkowe, mieszaniną reakcji aminozylanizacji.
   1. Inkubować przez 20-30 min. Podczas inkubacji sonikować raz przez 1 minutę.
4. Płukanie metanolem. Zastąp reakcję aminozylanizacji metanolem. Wyrzuć metanol i dodaj świeży roztwór metanolu. Powtórz tę procedurę trzy razy.

4. Pasywacja powierzchni za pomocą polimeru (pierwsza runda)

Pasywacja pokrytej aminą powierzchni szkiełek kwarcowych i nakrywkowych poprzez sprzężenie estru polietylenu (PEG) z NHS. Reakcję tę przeprowadza się przy nasycającym stężeniu roztworu PEG o pH 8,5 przez noc.

1. Suszenie szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych. Osuszyć szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe za pomocą gazu_N2 i umieścić je w czystych pudełkach na pipety w taki sposób, aby strona, która ma być PEGylowana, była skierowana do góry. Pudełko z pipetami jest częściowo wypełnione MilliQ H₂O. To wilgotne środowisko zapobiega wysychaniu roztworu PEGylacji podczas nocnej inkubacji.
2. Przygotowanie buforu reakcyjnego. Przygotować 0,1 M świeżego buforu wodorowęglanowego sodu (pH 8,5), rozpuszczając 84 mg wodorowęglanu sodu w 10 ml MilliQ_{H 2}O. Nie ma potrzeby dostosowywania pH. Roztwór ten może być przechowywany w stanie zamrożonym do następnego użycia (np. Krok 6.1).
3. Przygotowanie roztworu PEGylacji.
   1. Przygotuj mieszaninę PEG składającą się z 0,2 mg biotynylowanego estru NHS PEG (5 000 Da) ¹³ i 8 mg estru NHS mPEG (5 000 Da) w probówce o pojemności 1,5 ml. Przygotowując N liczbę szkiełek, należy przygotować N razy większą ilość mieszanki PEG w jednej tubce.
   2. Dodać 64 μl (lub N razy 64 μl dla N liczby szkiełek) świeżo przygotowanego buforu (krok 4.2). Pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie je rozpuścić.
   3. Wirować z 16 100 x g przez 1 minutę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Nie należy pipetować pipetowania. W przeciwnym razie utworzą się pęcherzyki powietrza, które zakłócają pegylację w kroku 4.4.
4. PEGylacja.
   1. Upuść 70 μl mieszaniny PEGylacji do wysuszonego szkiełka kwarcowego z kroku 4.1. Użyć 90 μl w przypadku szkiełka nakrywkowego 24 x 50^mm2.
   2. Delikatnie umieść wysuszone szkiełko nakrywkowe z kroku 4.1 na roztworze.
   3. Aby uzyskać jednolitą i wysoką jakość pegylacji, należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza. Ze względu na napięcie powierzchniowe większość pęcherzyków powietrza może spontanicznie opuścić objętość reakcji w ciągu pięciu minut z powodu napięcia powierzchniowego.
   4. Inkubuj szkiełka w ciemnym i wilgotnym środowisku. Okres półtrwania NHS-ester PEG, którego używamy przy pH 8, wynosi około jednej godziny. Inkubuj je co najmniej przez 2 godziny. Inkubacja przez noc prowadzi do wyższej jakości PEGylacji (dane nie pokazane).

5. Długoterminowe przechowywanie

Przechowywanie preparatów PEGylowanych i nakrywek w N₂ w temperaturze -20 ºC.

1. Suszenie szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych. Ostrożnie zdemontować szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe, przesuwając je na bok, przepłukać preparatem MilliQ H₂O i osuszyć preparatem N₂.
2. Przechowywanie szkiełek podstawowych i nakrywek. W celu natychmiastowego użycia postępuj zgodnie z procedurą dla drugiej rundy PEGylacji (Krok 6). Aby przechowywać dane przez dłuższy czas, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Umieścić parę szkiełek podstawowych i szkiełko nakrywkowe w probówce o pojemności 50 ml w taki sposób, aby powierzchnie pegylowane były skierowane od siebie.
   2. Częściowo zamknij probówkę, odkurz probówkę, a następnie napełnij ją_N2. Te kroki pomagają zachować powierzchnię PEGylowaną przez długi czas. Mocno przykręcić rurkę i przechowywać ją w temperaturze -20 °C. Jakość preparatów utrzymuje się na dobrym poziomie przez okres do 3 miesięcy (Rysunek 3a, po prawej).

6. Pasywacja powierzchni za pomocą polimeru (druga runda)

Dodatkowa runda pegylacji, aby zagęścić warstwę PEG, a także wygasić wszelkie pozostałe grupy aminowe na powierzchni. Zastosowanie krótkich cząsteczek estrowych PEG NHS (333 Da) może być skuteczne w przenikaniu do istniejącej warstwy PEG. Zaleca się wykonanie drugiej rundy PEGylacji tuż przed użyciem szkiełka.

1. Przygotowanie buforu reakcyjnego. Przygotować 0,1 M świeżego buforu wodorowęglanu sodu (pH 8,5). Można również użyć zamrożonego roztworu z kroku 4.2.
2. Przygotowanie roztworu PEGylacji. Rozpuścić 7 μl 250 mM MS4-PEG w 63 μl buforu wodorowęglanowego sodu.
3. PEGylacja. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 4.4. Inkubować przez 30 minut do nocy.
4. Suszenie szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych. Zdemontować parę szkiełek podstawowych i szkiełko nakrywkowe, przepłukać je roztworem MilliQ H₂O, wysuszyć roztworem N₂ i przechowywać w czystym pudełku na pipety. Przystąp do montażu komory mikroprzepływowej w kroku 7.

7. Montaż komory mikroprzepływowej

Montaż komory mikroprzepływowej za pomocą pary szkiełka kwarcowego PEGylowanego i szkiełka nakrywkowego. Dwustronna taśma klejąca służy jako przekładka. Komora jest uszczelniona klejem epoksydowym, a roztwory są wprowadzane przez otwory w zjeżdżalni kwarcowej.

1. Umieść szkiełko kwarcowe na płaskiej powierzchni stroną z PEGylacją skierowaną do góry.
2. Wykonaj kanał (szerokość od 5 do 7 mm) po przekątnej na powierzchni PEGylowanej, nakładając dwustronne taśmy klejące na szkiełko. Upewnij się, że otwory są umieszczone na środku kanału. Uważaj, aby nie uszkodzić PEGylowanej powierzchni podczas procesu tworzenia komory. Możliwe jest wykonanie slajdu wielokanałowego poprzez umieszczenie i przyklejenie dwustronnych taśm klejących w inny sposób (patrz rysunek 2).
3. Delikatnie umieść pegylowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uzupełnić komorę. Strona PEGylowana powinna być skierowana w dół.
4. Uszczelnij komorę, dociskając szkiełko nakrywkowe do obszaru, w którym umieszczane są taśmy dwustronne. Zrób to delikatnie, ale dokładnie, aby komora stała się wodoszczelna.
5. Zamknij krawędzie komory klejem epoksydowym.
6. Unieruchomić streptawidynę lub neutrawidynę na biotynylowanej warstwie PEG, dodając 50 μl 0,1 mg/ml roztworu streptawidyny lub neutrawidyny w T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM bufor NaCl) za pomocą pipety p200. Po 1 minucie inkubacji przepłukać 100 μl buforu T50.
7. Dodaj biotynylowane cząsteczki biologiczne do obrazowania pojedynczych cząsteczek.

8. Recykling slajdów

Recykling zjeżdżalni kwarcowych. Zużyte szkiełka są poddawane recyklingowi poprzez usunięcie szkiełek nakrywkowych i dwustronnych taśm klejących.

1. Po użyciu przechowuj komory w wodzie z kranu. Długotrwała inkubacja w wodzie ułatwia demontaż komór.
2. Zagotuj komory w wodzie z kranu za pomocą kuchenki mikrofalowej. Użyj zlewki Pyrex. Gotować przez 10 minut lub dłużej.
3. Usuń szkiełka nakrywkowe i dwustronne taśmy klejące za pomocą żyletki. Nie naciskaj szkiełka kwarcowego prostopadle do jego płaszczyzny. W przeciwnym razie się zepsuje. Trzymaj żyletkę z dala od kanału. W przeciwnym razie wprowadza rysy na kanale.
4. Opłucz szkiełka domowym detergentem, pocierając je palcami.
5. Umieść szkiełka w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od 5 do 15 szkiełek. Dodaj 10% domowego detergentu i sonikuj szkiełka przez 20 minut lub dłużej. Przepłukać szkiełka dużą ilością wody w tabletkach.
6. Przejdź do kroku 1.2.

Results

Po złożeniu komory mikroprzepływowej (Krok 7.1 - 7.6) i przed przeprowadzeniem Kroku 7.7, zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości powierzchni pegylowanej.

Jeśli pasywacja powierzchni została przeprowadzona pomyślnie, obserwuje się mniej niż 10 niespecyficznie zaadsorbowanych białek na obszar obrazowania (25 mm x 25 mm), gdy do komory dodaje się 1-10 nM znakowanego fluorescencyjnie białka (Rysunek 3a, po lewej).

Gdy którykolwiek z etapów czyszczenia lub reakcji nie został prawidłowo przeprowadzony, liczba niespecyficznie zaadsorbowanych białek znacznie wzrasta, a ekran CCD może być nasycony sygnałami fluorescencyjnymi. Na przykład, jeśli trawienie piranii zostanie pominięte, obserwuje się 100 razy większą ilość niespecyficznej adsorpcji (ryc. 3a; porównaj po lewej stronie ze środkiem). Gdy drugi etap pegylacji zostanie pominięty, zaobserwowano około 3 razy większą ilość niespecyficznej adsorpcji (Figura 3b). Niski stopień PEGylacji obserwuje się, gdy stosuje się przeterminowane chemikalia (np. APTES przechowywane w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy) (dane nie pokazane). Jakość powierzchni spada również, gdy upłynęło dużo czasu od jej pegylacji (ryc. 3a; porównaj po lewej z prawą).

O naszej najlepszej wiedzy, po raz pierwszy wprowadza się dwie rundy pegylacji do badań nad pojedynczymi cząsteczkami. Dwie rundy PEGylacji gwarantują najwyższą jakość tworzenia warstwy PEG (rysunek 3b). Nadrzędna natura podwójnej pegylacji jest wyraźnie pokazana w filmach (Porównaj film 1a z filmem 1b). Na tych filmach zaobserwowano, że sygnały tła z cząsteczek fluorescencyjnych w roztworze są znacznie słabsze, gdy zastosowano podwójną pegylację, co wskazuje, że białka są skuteczniej odpychane przez podwójnie pegylowaną warstwę. Chociaż ten dwuetapowy proces jest zdecydowanie zalecany, drugi etap pegylacji może zostać pominięty, jeśli eksperyment jest tolerowany na nieoptymalną pasywację.

Rysunek 1: Schemat obróbki powierzchni.(a) Szkiełko mikroskopowe czyści się roztworami acetonu, KOH i piranii. Jest funkcjonalizowany za pomocą APTES i PEGylowany za pomocą NHS-ester PEG. b) Szkiełko nakrywkowe czyści się KOH, jak również, jeśli to konieczne, roztworem piranii. Jest funkcjonalizowany APTES i PEGylowany estrem NHS PEG.
 

Rysunek 2: Komora mikroprzepływowa. (a) Komora jednokanałowa. Szkiełko mikroskopu posiada wywiercone dwa otwory. Składa się go ze szkiełka nakrywkowego za pomocą dwóch plasterków dwustronnej taśmy klejącej. (b) Komora trzykanałowa. Szkiełko mikroskopowe posiada wywierconych sześć otworów. Składa się go ze szkiełka nakrywkowego za pomocą czterech plasterków dwustronnej taśmy klejącej.

Rycina 3: Obrazy CCD wykonane z białkami znakowanymi barwnikiem w roztworze. (a) Obrazy CCD wykonano za pomocą pryzmatycznej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem przy użyciu soczewki obiektywowej 60X z 10 nM Cy3 Rep w roztworze. (Po lewej) Nawierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem zawartym w tym artykule. (Środek) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w tym artykule, ale trawienie piranią zostało pominięte. (Po prawej) Powierzchnię przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w tym artykule i przechowywano przez 3 miesiące w temperaturze -20 ºC pod azotem. (b) Obrazy CCD wykonane przy użyciu 10 nM Cy3 znakowanego Rep w roztworze. (Po lewej) Nawierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem zawartym w tym artykule. (Po prawej) Powierzchnię przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w tym artykule, ale druga runda PEGylacji została pominięta. Podziałka = 5 μm.

Film 1: Filmy CCD wykonane z białkami znakowanymi barwnikiem w roztworze. Filmy CCD wykonano za pomocą pryzmatycznej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem przy użyciu soczewki obiektywowej 60X z 10 nM Cy3 Rep w roztworze. Rozdzielczość czasowa wynosi 100 ms. (a) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w tym artykule. (b) Powierzchnię przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w tym artykule, ale druga runda PEGylacji została pominięta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 1a i kliknij tutaj, aby wyświetlić film 1b.

Discussion

Krytyczne kroki w ramach tego protokołu

Konieczne jest, aby powierzchnia była hydrofilowa przed reakcją aminosilanizacji. Udało się to osiągnąć poprzez wytrawianie piranii, które generuje wolne grupy hydroksylowe na powierzchni szkła/kwarcu. Zaleca się, aby nie wystawiać powierzchni wytrawionej piranią na działanie_H2Olub powietrza przez długi czas, ponieważ hydrofilowość powierzchni stopniowo spada.

Cząsteczki NHS-ester PEG są reaktywne. Zaleca się wykonanie podwielokrotności i przechowywanie ich w atmosferze azotu w temperaturze -20 ºC. Okres trwałości substancji chemicznej APTES w temperaturze pokojowej jest krótki. Zaleca się wymianę go na nowy co miesiąc.

Modyfikacje tego protokołu

Jeśli z jakiegokolwiek praktycznego powodu nie możesz użyć trawienia piranii, możesz wytrawiać za pomocą KOH przez długi czas (np. przez noc), co również spowoduje odsłonięcie grup hydroksylowych. Pułapka tego alternatywnego podejścia polega na tym, że zjeżdżalnia staje się bezużyteczna po kilku recyklingach z powodu poważnych zadrapań.

Często praktykuje się spalanie powierzchni szklanej/kwarcowej za pomocą palnika propanowego, który skutecznie eliminuje fluorescencyjne materiały organiczne ⁷. Procedura ta nie została uwzględniona w tym protokole, ponieważ jest zbędna do trawienia piranii. Należy pamiętać, że ta procedura potencjalnie doprowadzi do utlenienia grup hydroksylowych. Dlatego tej procedury nie należy przeprowadzać, gdy powierzchnia została wytrawiona za pomocą KOH lub roztworu piranii.

Gdy do obrazowania pojedynczych cząsteczek stosuje się bufor o pH niższym niż 7, konformacja PEG zmienia się z "grzyba" na "szczotkę", co zmniejsza stopień pasywacji. Dlatego, gdy stosuje się pH niższe niż 7,0, zaleca się dalszą pasywację powierzchni za pomocą wintaranu disuccinimidylu ⁷.

Perspektywy

Prace te dostarczyły solidnego protokołu umożliwiającego osiągnięcie wysokiej jakości pasywacji powierzchni. Protokół ten będzie przydatny w badaniach fluorescencji pojedynczych cząsteczek, które są zaangażowane w białka ¹⁴ , a także kompleksy białkowe w ekstraktach komórkowych i immunoprecypitatach ¹⁵. Będzie szeroko stosowany w innych technikach jednocząsteczkowych, takich jak spektroskopia sił i spektroskopia momentu obrotowego ¹⁶. Będzie również przydatny do zapobiegania adsorpcji komórek na powierzchni ¹⁷.

Protokół przedstawiony w tej pracy jest wymagający ze względu na wieloetapowe procedury. Pasywacja powierzchni przy użyciu lipid-PEG ⁸ i polilizyny PEG ⁹ jest dostępna jako alternatywne podejście. Ponieważ nie wymagają żadnych reakcji chemicznych, są łatwe do wdrożenia. Jednak stopień pasywacji nie jest tak wysoki, jak ten osiągany w wyniku chemicznej modyfikacji powierzchni.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Przygotowanie i czyszczenie szkiełek ślizgowych
Aceton	Sigma	32201	1 L
Szkiełka nakrywkowe	VWR	631-0136 631-0144 631-0147	24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2  ( No.1½, Prostokątny)
Wiertła diamentowe	MTN-Giethoorn, Holandia	LA-0564-00DB	3/4 mm
Uchwyt do prowadnic Duran	LGS, Holandia	213170003
Witraże szklane	Fisher Scientific	300101
H2O2	Boom	6233905	1 L, nadtlenek wodoru 30%. Otwarte butelki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
H2SO4	Boom	80900627.9010	Kwas siarkowy 95-98%
KOH	Sigma	30603	Wodorotlenek potasu
Metanol	Sigma	32213	1 L
Sonicator	Branson		Myjka ultradźwiękowa stołowa, 3510
Zjeżdżalnie kwarcowe	Finkenbeiner		1" x 3", 1 mm gruby
2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
Duran uchwyt do szkiełek	ślizgowych LGS, Holandia	213170003
KOH	Sigma	30603	Sonicator wodorotlenku potasu
	Branson		Myjka ultradźwiękowa stołowa, 3510
3. Aminosilanizacja szkiełek i szkiełek nakrywkowych
Acetic acid	Sigma	320099-500ML	Kwas octowy, lodowaty
APTES	Sigma-Aldrich	281778-100ML	3-aminopropylotrimetoksysilan. Przechowywać w temperaturze pokojowej pod N2. Wymieniaj raz w miesiącu.
Kolba (200 ml)	VWR	(200 ml)	Kolba Pyrex. Należy mieć jedną kolbę przeznaczoną do aminozylanizacji.
Metanol	Sigma	32213	1 L
Sonicator	Branson		Myjka ultradźwiękowa stołowa, 3510
4. Pasywacja powierzchni za pomocą polimeru (pierwsza runda)
Biotin-mPEG	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000-100mg	Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Przechowywać porcje 1-2 mg (wystarczają na 10 szkiełek) w temperaturze -20 ° C pod N2.
mPEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000-1g	mPEG-walerianian sukcynimidylu (SVA), MW 5,000 Da. Przechowywać podwielokrotności 80 mg (wystarcza na 10 szkiełek) w temperaturze -20 ° C pod N2.
Wodorowęglan sodu	Sigma	S6014-500G
5. Pasywacja powierzchniowa (druga runda)
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Bioodczynnik do biologii molekularnej, ≥ 99,9%
DST	Pierce	20589	Wintaran disuccinimidylu
MS4-PEG	Pierce	22341	Krótki NHS-ester PEG, MW 333 Da. Rozpuść 100 mg MS4-PEG w 1,1 ml DMSO. Sklep 20 &mikro; l podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
Wodorowęglan sodu	Sigma	S6014-500G
6. Montaż komory mikroprzepływowej
Podwójna taśma klejąca	Scotch		o szerokości 10 mm
Epoksydowa	Thorlabs	G14250	Devcon 5 minutowa żywica epoksydowa
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-1 KG	Chlorek sodu
Neutrawidyna	Pierce	31000	ImmunoPure NeutrAvidin Białko wiążące biotynę. Zapas w 5 mg/ml w H2O w 4 stopniach C.
Streptavidin	Invitrogen	S-888	Stock 5 mg/ml w H2O lub T50 w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Podstawa Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1 KG	Tris