Uzyskiwanie próbek ze spowolnionym, przyspieszonym i odwróconym starzeniem w modelu pszczoły miodnej

Podsumowanie

U robotnic pszczół miodnych starzenie się zależy od zachowań społecznych, a nie od wieku chronologicznego. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób można uzyskać i przeanalizować typy pracowników o bardzo różnych wzorcach starzenia się pod kątem starzenia się komórek.

Streszczenie

Społeczeństwa wysoce towarzyskich zwierząt charakteryzują się ogromnymi różnicami w długości życia między blisko spokrewnionymi osobnikami. Wśród owadów społecznych pszczoła miodna jest najlepiej ugruntowanym modelem do badania, w jaki sposób plastyczność długości życia i starzenie się tłumaczy się czynnikami społecznymi.

Kasta robotnic pszczół miodnych obejmuje pszczoły pielęgniarki, które opiekują się czerwiem, oraz pszczoły zbieraczki, które zbierają nektar i pyłek. Wcześniejsze prace wykazały, że funkcje mózgu i zdolność do lotu starzeją się szybciej u zbieraczek niż u pielęgniarek. Jednak funkcje mózgu mogą się zregenerować, gdy zbieracze powrócą do zadań pielęgnacyjnych. Takie wzorce przyspieszonego i odwróconego starzenia funkcjonalnego są związane ze zmienionym poziomem zasobów metabolicznych, zmianami w obfitości białek i funkcją immunologiczną. Witellogenina, białko żółtka o dostosowanych funkcjach w kontroli hormonalnej i obronie komórkowej, może służyć jako główny element regulacyjny w sieci, która kontroluje różną dynamikę starzenia się pracowników.

Tutaj opisujemy, jak można monitorować i manipulować wyłanianiem się pielęgniarek i zbieraczek, włączając w to odwrócenie od zazwyczaj krótko żyjących zbieraczy do pielęgniarek o dłuższym życiu. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, jak osobniki o podobnym wieku chronologicznym różnicują się w zbieraczki i pszczoły karmiące w warunkach eksperymentalnych. Pokazujemy, w jaki sposób można zweryfikować odwrócenie zachowania od zbieraczy z powrotem do pielęgniarek. Na koniec pokazujemy, jak różne procesy starzenia się komórek można ocenić, mierząc akumulację lipofuscyny, uniwersalnego biomarkera starzenia.

Do badania mechanizmów, które mogą łączyć wpływy społeczne i plastyczność starzenia, ten protokół dostarcza ustandaryzowany zestaw narzędzi do pozyskiwania odpowiedniego materiału próbnego i poprawy porównywalności danych między przyszłymi badaniami.

Wprowadzenie

Złożone struktury kolonii wysoce społecznych zwierząt są utrzymywane dzięki interakcji kasty reprodukcyjnej i kasty pomocników składającej się z zazwyczaj nierozmnażających się pracowników o różnych zachowaniach związanych z zadaniami społecznymi. U różnych pracowników określone adaptacje fizjologiczne umożliwiają różne zachowania związane z opieką nad rodzeństwem, a także są związane z ekstremalnymi różnicami w długości życia. Pszczoły miodne i kretoszczury reprezentują najlepiej rozwinięte modele zwierzęce do badania, w jaki sposób uspołecznienie jest powiązane z wzorcami przyspieszonego, nieistotnego lub odwróconego starzenia^{się 1-3}.

W koloniach pszczół miodnych pojedyncza królowa składająca jaja jest wspomagana przez tysiące robotnic, które opiekują się czerwiem, poszukują pożywienia i angażują się w ochronę, termoregulację lub zachowania higieniczne⁴. Wśród tych robotnic są niezwykle krótkowieczne zbieraczki, pszczoły karmiące z pszczołami pośrednimi i pszczoły zimowe (diutinus) o najdłuższej żywotności. Jednostki nie są jednak na stałe związane z określonym typem pracownika, ale wykazują elastyczną ontogenezę behawioralną: zmieniają się z jednego zachowania związanego z zadaniem społecznym na inne ("kasty czasowe"). Pszczoły Callow mogą przestawić się na pszczoły pielęgniarki opiekujące się czerwiem, które ostatecznie mogą przejść na żerowanie na zewnątrz. Jednak pszczoły gniazdujące w łojach mogą również przekształcić się w najdłużej żyjące pszczoły zimowe, a krótkotrwałe zbieraczki mogą nawet powrócić do zazwyczaj dłużej żyjących pielęgniarek. Robotnice o ekstremalnej (pszczoły zimowe) i średniej (pszczoły pielęgniarki) długości życia mają dobrze rozwinięte narządy do produkcji i przechowywania pokarmu z obfitymi zasobami - w przeciwieństwie do krótkowiecznych zbieraczek (przegląd w^1,5). Jednak to, że regulacja długości życia jednostki wykracza poza proste zmiany w bilansie zasobów jednostki, sugerują badania nad białkiem żółtka, które ma różnorodne, przystosowane funkcje w kaście pracowników nierozmnażających się, takie jak produkcja galaretki⁶, kontrola hormonalna^, odporność⁸ i obrona przed przeciwutleniaczami9.

Wzorce pogorszenia funkcjonalności (starzenia) odzwierciedlają różnice w długości życia między pracownikami, jak ustalono dla węchu, a także dla innych funkcji mózgu lub motorycznych^10-13. W szczególności znaczny spadek funkcji uczenia się już po dwóch tygodniach żerowania odpowiada podobnemu postępowi śmiertelności u zbieraczek¹⁴, w przeciwieństwie do braku wykrywalnego spadku (znikome starzenie się) u długowiecznych pszczół zimowych¹⁵.

Aby zidentyfikować molekularne odciski palców elastycznego starzenia się, dostosowaliśmy ustalone paradygmaty eksperymentalne, które pozwalają monitorować i manipulować przejściami typu starzenia^{się 8,16,17}. Eksperyment 1 szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać próbki, w których można oddzielić wpływ wieku chronologicznego i specyficznych dla typu pracownika zachowań społecznych na starzenie się. Eksperyment 2 opisuje odwrócenie się zbieraczek z przyspieszonymi pszczołami pielęgniarkami ze spowolnioną dynamiką starzenia. Eksperyment 3 przedstawia podejście do badania skutków starzenia się komórek poprzez anatomiczną kwantyfikację ustalonego biomarkera starzenia się komórek (lipofuscyny)¹⁸.

Protokół

1. Oddzielenie wieku starzenia się od wieku chronologicznego

Ta sekcja opisuje konfigurację kolonii podwójnej kohorty, która składa się z kohorty zidentyfikowanych osobników o tym samym wieku chronologicznym ("kohorta jednowiekowa") i kohorty pszczół gniazdowych. Osobniki w tym samym wieku z pojedynczej kohorty wiekowej ostatecznie rozdzielą się na różne typy robotnic o różnej dynamice starzenia się - są to pszczoły pielęgniarki ze spowolnionym spowolnieniem i pszczoły zbieraczki z przyspieszonym spadkiem funkcjonalnym. Wszystkie procedury są opisane dla jednej rodziny doświadczalnej. Zalecamy jednak przeprowadzenie eksperymentów na co najmniej dwóch powtórzeniach kolonii, tak aby można było kontrolować efekty kolonii (projekt z dwiema powtórzeniami).

1. Przygotowanie pudełek ulowych dla kolonii podwójnej kohorty: Przygotuj jedną zwykłą skrzynkę ula, w której znajdują się dwa plastry z miodem, drugi plaster z pyłkiem i dwa puste plastry. Upewnij się, że zlokalizujesz pokrytą królową, a także kolonię dawcy z ponad 3,000 pszczół gniazdowych. Oba zostaną wprowadzone w późniejszym terminie (1.3).
2. Pozyskiwanie i oznaczanie osobników o podobnym wieku chronologicznym: Zbieraj grzebienie z zapieczętowanym czerwiem, który ma się pojawić. W przypadku jednej repliki spodziewaj się zebrać grzebienie z łączną liczbą 3,000-5,000 zasklepionych komórek lęgowych. Dla każdej kontrpróby należy użyć zrównoważonej ilości czerwiu z co najmniej trzech różnych źródeł ula, aby uniknąć wypaczonego rozkładu genotypów matczynych (pochodzenie ula).
   1. Plastry do czerwiu należy umieścić w inkubatorze ustawionym na 34 °C o wilgotności względnej 60-70%. Upewnij się, że przechowujesz grzebienie w taki sposób, aby pojawiający się czerw nie mógł uciec.
   2. Pozwól pszczołom wynurzyć się na dwa dni i oznacz je małą tabliczką z farbą na klatce piersiowej (np. Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). Znak lakierniczy pozwoli zidentyfikować pszczoły z pojedynczej kohorty wiekowej (dzień wschodów) i odróżnić je od innych replikowanych kolonii.
3. Utworzenie podwójnej kolonii kohortowej, która obejmuje kohortę zidentyfikowanych pszczół w jednym wieku: W dniu, w którym młode pszczoły zostały oznaczone, zbierz około 2500-3000 pszczół gniazdowych z rodziny dawcy (porównaj sekcję 1. w Dyskusji) i dodaj te nieoznaczone pszczoły do pudełka ula, które zostało przygotowane wcześniej (patrz krok 1.1). Te ostatnie osobniki będą stanowić niezidentyfikowaną kohortę pszczół gniazdowych.
   1. Dodaj królową, która początkowo będzie zamknięta w klatce dla królowej (dostępna w handlu). Uszczelnij klatkę jadalnymi cukierkami (np. Apifonda, Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Niemcy), aby pszczoły robotnice powoli uwalniały królową.
   2. Dodaj nowo powstałe i oznaczone pszczoły, które będą stanowić pojedynczą kohortę wiekową. Pszczoły te są jedynymi oznaczonymi osobnikami i stanowią grupę fokusową dla wszystkich kolejnych kroków.
4. Monitorowanie początku żerowania i znakowanie zbieraczy: Aby ocenić początek i dynamikę przejścia od pielęgniarki do zbieraczki w kohorcie pojedynczej grupy, monitoruj rozwój demograficzny aktywności żerowania co drugi dzień dla każdej kolonii. Rozpocznij liczenie pięć dni po założeniu kolonii (ryc. 1).
   1. Policz całkowitą liczbę pszczół powracających z lotów żerowania (liczba wejść) w ciągu 3 x 20 minut okresów obserwacji w ustalonych porach. Upewnij się, że nie liczysz pszczół w okresach lotów orientacyjnych (patrz Dyskusja).
   2. Gdy liczenie wejść wskazuje na rozpoczęcie znacznej aktywności żerowania (>100 wejść dziennie), zacznij oznaczać zbieraczy. W tym celu zbieracze z pojedynczej kohorty wiekowej (pojedyncze oznaczone osobniki) otrzymują drugi znak farby po powrocie z pierwszych lotów żerowania. Ten znak farby określi dzień rozpoczęcia żerowania i pozwoli później określić wiek żerowania dla każdego zbieracza.
   3. Powtarzaj codzienne znakowanie, aż zostanie oznaczona wystarczająca liczba pszczół. Aby oszacować wystarczającą liczbę oznaczonych zbieraczek, spodziewaj się wskaźnika odzyskiwania nie większego niż 5-10% po starzeniu się tych pszczół, zwykle po 14 dniach żerowania.
5. Pobieranie próbek: Ponieważ wszystkie początkowo oznakowane pszczoły mają podobny wiek chronologiczny, grupy karmicieli i starych zbieraczek mogą być zbierane jednocześnie, gdy zbieraczki żerowały przez ≥14 dni.
   1. Pojedynczo oznakowane pszczoły pielęgniarki są zbierane w ulu i są identyfikowane na podstawie zachowań pielęgnacyjnych (karmienie i czyszczenie larw z głowami złożonymi w otwartych komórkach czerwiu).
   2. Podwójnie oznakowane zbieracze są również zbierane w ulu przed rozpoczęciem codziennej aktywności żerowania.
   3. Zbieraj pszczoły w klatkach (tubach, pudełkach), które zapewniają odpowiednią wentylację i trzymaj w ciemności do czasu dalszej obróbki. Alternatywnie, w przypadku badań transkryptomicznych, epigenetycznych lub proteomicznych, należy bezpośrednio zamrozić pszczoły w ciekłym azocie. Zbierz zrównoważoną liczbę osobników ze wszystkich grup testowych i powtórz kolonie.

2. Odwrócenie pracowników z szybkim starzeniem się na pracowników ze spowolnionym starzeniem się poprzez zmianę demografii ula

Ta sekcja szczegółowo opisuje, jak odbywa się odwrócenie od robotnic z przyspieszonym starzeniem się (zbieracze) do robotnic ze spowolnionym starzeniem się (pszczoły pielęgniarki). Takie odwrócenie zachowania jest indukowane, gdy zbieraczki doświadczają braku pszczół karmiące, które zwykle angażują się w opiekę nad czerwiem. Procedura rewersji polega na rozdzieleniu pojedynczej repliki rodziny na dwa ule: jeden ul z frakcją pszczół pielęgniarek ("pochodzącą od pielęgniarki"), a drugi z frakcją zbieraczki ("pochodzącą od zbieraczek"). Po udanym odwróceniu, możliwe objawy plastiku i odwróconego starzenia się mogą być badane w pojedynczej kohorcie wiekowej z odwróconymi robotnicami, kontynuującymi zbieraczkami, pszczołami karmiącymi i nowo zatrudnionymi zbieraczkami. Tak jak poprzednio, zidentyfikowane pszczoły z pojedynczej kohorty wiekowej, a nie z kohorty niezidentyfikowanych pszczół gniazdowych, stanowią eksperymentalną grupę fokusową.

1. Przygotowanie: Ule replikowane z pielęgniarkami (pojedynczo oznakowane) i zbieraczkami (podwójnie oznakowane) są udostępniane zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale. Upewnij się, że nie rozpoczynasz rewersji z mniej niż 500 oznaczonymi zbieraczami na kolonię repliki, aby zapewnić wystarczające odzyskanie po zakończeniu rewersji.
   1. Dla bezpiecznej identyfikacji grup badanych po odwróceniu kluczowe jest, aby cała populacja zbieraczy w pierwotnym ulu została oznaczona przed rewersją. Poniższa procedura została opisana dla jednej repliki.
   2. Dzień przed odwróceniem należy przygotować jedną dodatkową skrzynkę ula dla ula pochodzącego od zbieraczy (patrz krok 1.1). Zlokalizuj dwie królowe i dwa grzebienie czerwiu z uli dawców. Przed przeniesieniem do rodzin doświadczalnych należy zepchnąć wszystkie dorosłe pszczoły z tych plastrów. Jedna królowa w klatce (patrz krok 1.3) i jeden grzebień lęgowy zastąpią grzebienie królowej i czerwiu w oryginalnym pudełku ula. Drugi zestaw królowej i grzebienia czerwiowego zostanie użyty następnego dnia do nowej skrzynki ula. Podobny przydział nowych grzebieni czerwiu i obcych królowych zarówno dla oryginalnego, jak i nowego ula jest zalecany, aby upewnić się, że oddzielone zbieraczki i karmicielki będą w równym stopniu doświadczać zmienionych sygnałów ula.
2. Rewersja: Rano, tuż przed odwróceniem, dodaj królową w klatce i grzebień czerwiu do nowego pudełka, które otrzyma frakcję pochodzącą od zbieraczy. Poczekaj, aż rozpocznie się szczytowy czas żerowania. Następnie przenieś pierwotną rodzinę z oznaczonymi zbieraczami i pszczołami karmiącymi na odległość co najmniej 100 m od pierwotnej lokalizacji.
   1. W pierwotnej lokalizacji ustaw nową skrzynkę dla ula pochodzącego od zbieraczy tylko z czerwiem i królową.
   2. Zbieracze opuszczą zwichniętą oryginalną skrzynkę ula i wrócą do pierwotnej lokalizacji. Pozwól zbieraczom powrócić do pierwotnego miejsca na 2 godziny, aby osiągnąć prawie całkowite oddzielenie populacji zbieraczek od pszczół gniazdowych.
   3. Następnie, aby zakończyć separację, zamknij pierwotny, teraz "wywodzący się od pielęgniarki" ul i przenieś go do pasieki oddalonej o co najmniej 3 km.
3. Utrzymanie i monitorowanie ula w celu pomyślnego odwrócenia zadań społecznych: Regularnie sprawdzaj ule eksperymentalne pod kątem zdrowego, otwartego czerwiu.
   1. W pierwszych dniach po manipulacji kolonią należy wymienić pozostawiony bez opieki i martwy czerw, aby zmniejszyć potencjalne obciążenie patogenami.
   2. Aby potwierdzić pomyślne odwrócenie w ulu pochodzącym od zbieraczy, należy zrobić zdjęcia plastrów czerwiu przed ich wprowadzeniem i ponownie po wymianie grzebieni lub po zakończeniu eksperymentu rewersji (ryc. 2). Obszary z wcześniej niezamkniętym czerwiem i otwartym, żywym czerwiem są wiarygodnymi markerami aktywności pielęgniarskiej w koloniach pochodzących od zbieraczy.
4. Pobieranie próbek: Efekty fizjologiczne, które towarzyszą odwróceniu społecznemu, można wykryć 3-8 dni po rozdzieleniu zbieraczek i pielęgniarek.
   1. Zalecamy pobieranie próbek ze wszystkich grup testowych, tj. odwróconych robotnic i kontynuujących zbieracze (ul pochodzący od zbieraczy), a także kontynuujących karmienie i nowo zrekrutowanych zbieraczek (ul pochodzący od pielęgniarek) 8 dni po rozpoczęciu odwrócenia.
   2. Pobrać próbki zgodnie z opisem w kroku 1.5.

3. Analiza wzorców starzenia się komórek specyficznych dla typu pracownika za pomocą kwantyfikacji lipofuscyny

Lipofuscyna jest uniwersalnym biomarkerem starzenia się komórek. Jako produkt akumulacji wewnętrznej, do wykrywania można wykorzystać specyficzną autofluorescencję lipofuscyny (_maksymalna emisja = 530-650 nm)¹⁸.

1. Sekcja i utrwalenie: Schłodź pszczoły na lodzie do momentu, aż się zatrzymają; usuń i wypreparuj żądaną próbkę tkanki.
   1. Przenieść do utrwalacza (4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, PBS; pH 7,2) do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Umyj próbki 3 razy w PBS.
2. Przetwarzanie i montaż tkanek: Cięcie próbek tkanek na sekcje o grubości nie większej niż 40 μm, na przykład za pomocą mikrotomu z wibracyjnym ostrzem, np. Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Niemcy).
   1. W celu oczyszczenia inkubuj skrawki tkanek przez noc w 30% glicerolu (PBS) i kolejne 2 godziny w 50% glicerolu (PBS).
   2. Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych w 50% glicerolu (PBS). Do długotrwałego przechowywania uszczelnij szkiełka nakrywkowe z lakierem do paznokci.
3. Akwizycja obrazu: Aby wykryć lipofuscynę, sugerujemy użycie laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, który zapewnia linie laserowe o λ = 514, 561 nm lub podobnym do wzbudzenia oraz przy szerokości pasma detektora ustawionej na 570-650 nm.
   1. Aby lepiej zidentyfikować lipofuscynę, dołącz drugi kanał i wykonaj jednoczesne skanowanie przy krótszych widmach fal (wzbudzenie = 405 nm; emisja = 410-450 nm). Dłuższy kanał falowy ujawni zarówno ziarnistą lipofuscynę, ale także niespecyficzne "tło" spowodowane autofluorescencyjną tchawicą i innymi nieziarnistymi strukturami. Drugi, krótszy kanał falowy ujawni tylko niespecyficzną autofluorescencję, ale nie lipofuscynę. W ten sposób identyfikacja lipofuscyny może być ułatwiona poprzez porównanie sygnałów w obu kanałach, przy czym tylko jeden z nich ujawnia granulki z fluorescencją specyficzną dla lipofuscyny.
   2. Do robienia zdjęć o wysokiej rozdzielczości należy używać obiektywu o powiększeniu 40-krotnym lub większym, a najlepiej o aperturze numerycznej 1,25 lub większej. Skanuj stosy obrazów o wymiarach około 100 x 100 x 10 μm³. Każda próbka indywidualna i tkankowa musi być reprezentowana przez wiele stosów obrazów.
   3. Aby zmniejszyć zmienność wewnątrzosobniczą i międzyosobniczą spowodowaną zmiennością techniczną, należy zawsze utrzymywać moc lasera i czułość detektora na stałym poziomie.
   4. Aby zmniejszyć odchylenia wynikające z codziennych różnic technicznych, należy skanować równą liczbę próbek wszystkich grup testowych w każdej z kilku sesji skanowania.
4. Przetwarzanie obrazu: Korzystaj z pakietów oprogramowania z modułami, które pozwalają na zaawansowane przetwarzanie mikroskopijnych stosów obrazów, na przykład ImageJ (U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Wygeneruj maksymalną projekcję 2D dla każdego ze stosów obrazów 3D.
   2. Zastosuj filtr Gaussa o niewielkim rozmiarze ziarna, aby wyciszyć szumy o wysokiej częstotliwości i zachować struktury o wymiarach granulek lipofuscyny.
   3. Połącz oba kanały kolorów, aby ułatwić identyfikację lipofuscyny (patrz krok 3.2).
5. Analizy obrazów: Upewnij się, że osoba wykonująca kroki kwantyfikacji będzie ślepa na testowanie tożsamości grupy.
   1. W przypadku wszystkich obrazów najpierw wybierz obszar zainteresowania (ROI), który obejmuje odpowiednie struktury i ma podobne wymiary jak obszary zainteresowania z innych obrazów.
   2. Następnie wybierz żądaną liczbę granulek lipofuscyny, które reprezentują każdy zwrot z inwestycji. Przy wyborze granulek lipofuscyny w ramach ROI, zastosowanie poniższych zasad zmniejszy subiektywne odchylenia.
      1. Wybierz spójne miejsce, w którym wybierzesz pierwszą granulkę. Może to być na przykład skrajna lewa krawędź ROI, a granulka, która jest najbliżej krawędzi, zawsze będzie pierwszym wyborem.
      2. Jeden po drugim wybierane są granulki, które są najbliżej poprzedniego wyboru (następnego sąsiada).
      3. Wybierając następnego sąsiada, poruszaj się tylko w jednym kierunku, na przykład szukaj tylko w prawo od poprzedniego wyboru. Zasada ta zapobiega sytuacji, w której selekcja jest zdominowana przez sporadyczne skupiska gęsto upakowanych granulek.
      4. Po zakończeniu selekcji oceń wielkość każdej cząsteczki lipofuscyny, obrysowując i mierząc odpowiednią powierzchnię granulek. Użyj odpowiednich testów statystycznych, aby porównać osoby z różnych grup testowych.

Wyniki

Sekcje 1 i 2 protokołu szczegółowo opisują sposób pozyskiwania grup testowych do badania cech starzenia przyspieszonego, spowolnionego i odwróconego w koloniach z pojedynczą kohortą wiekową. Aby monitorować dyferencjację typów robotnic towarzyszącą normalnej ontogenezie, ocenialiśmy liczbę żebraczek („liczenie przy wlocie”) dla 6 kolonii (Rysunek 1, por. sekcja 1). Wykresy pokazują, że znaczącej zmiany ze stanu pielęgniarek na stan żebraczek zazwyczaj nie obserwuje się, dopóki osobniki nie osiągną wieku ...

Dyskusja

Przyjmujemy tutaj wcześniej opisane podejścia^{8,16,17,19,20} i integrujemy je w jeden przepływ pracy, który ułatwi badanie elastycznego starzenia się pszczół miodnych. Naszym celem jest zapewnienie naukowcom, którzy są nowicjuszami w tej dziedzinie, ustandaryzowanego zestawu narzędzi do uzyskania odpowiedniego materiału próbnego oraz poprawa odtwarzalności eksperymentów między różnymi zespołami badawczymi. Chociaż nasze procedury są uproszczone i nie wymagają specjalnego sprzętu, jak we wcześniejszych opisach (p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Apifonda	Sü dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Niemcy
paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	P4417
Glicerol	Merck	1.04094.1000