Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Podsumowanie

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Streszczenie

Komórki Mauthnera (komórki M) to duże neurony siateczkowo-rdzeniowe zlokalizowane w tyłomózgowiu ryb teleost. Są to kluczowe neurony zaangażowane w charakterystyczne zachowanie znane jako reakcja C-start lub ucieczka, która występuje, gdy organizm dostrzega zagrożenie. Limfocyt M był szeroko badany u dorosłych złotych rybek, gdzie wykazano, że otrzymuje szeroki zakres sygnałów pobudzających, hamujących i neuromodulujących¹. Badaliśmy aktywność komórek M u embrionalnego danio pręgowanego w celu zbadania aspektów rozwoju synaptycznego w preparacie kręgowców. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych Ali i jego współpracownicy opracowali preparat do rejestracji klamry krosowej z komórek M w zarodkach zebry danio pręgowanego, w których OUN był w dużej mierze nienaruszony^2,3,4. Celem w tamtym czasie było zarejestrowanie aktywności synaptycznej neuronów tyłomózgowia, neuronów rdzenia kręgowego i mięśni szkieletowych tułowia przy jednoczesnym utrzymaniu funkcjonalnych połączeń synaptycznych w nienaruszonym preparacie mózg-rdzeń kręgowy. Preparat ten jest stosowany w naszym laboratorium do dziś. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw plastyczności synaptycznej rozwoju, rejestrujemy pobudzające (za pośrednictwem AMPA i NMDA)^5,6 i hamujące (GABA i glicyna) prądy synaptyczne od rozwijających się komórek M. Co ważne, ten unikalny preparat pozwala nam powrócić do tej samej komórki (M-komórki) z przygotowania na preparat, aby dokładnie zbadać plastyczność synaptyczną i rozwój neurologiczny w organizmie embrionalnym. Korzyści płynące z tego preparatu to m.in. 1) nienaruszone, funkcjonalne połączenia synaptyczne z komórką M, 2) stosunkowo niedrogie preparaty, 3) duża ilość łatwo dostępnych zarodków, 4) zdolność do powrotu do tego samego typu komórki (tj. komórki M) w każdym preparacie, dzięki czemu rozwój synaps na poziomie pojedynczej komórki może być badany od ryby do ryby, oraz 5) obrazowanie całych preparatów ze względu na przezroczysty charakter zarodków.

Wprowadzenie

Jedno z nierozstrzygniętych pytań w neurobiologii rozwojowej dotyczy roli zjawisk plastyczności synaptycznej podczas dojrzewania synaptycznego. Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów plastyczności, które leżą u podstaw rozwoju synaptycznego, a ogólnym celem jest zrozumienie zachowania zwierząt w kontekście rozwoju synaptycznego. W tym celu opracowaliśmy w dużej mierze nienaruszony preparat w organizmie (danio pręgowany, Danio rerio), który pod koniec lat 90. zyskał znaczną popularność w badaniach rozwojowych.

Danio pręgowany oferuje kilka wyraźnych zalet w badaniach neurorozwojowych. Na przykład jego genom jest sekwencjonowany i można wykonywać knockdowny morfolino i nokauty nukleazy palca cynkowego, aby wyciszyć aktywność genów i ekspresję białka. Można również wykonywać badania nadekspresji i konstruować linie transgeniczne^7-9. Zarodki są stosunkowo łatwe i obfite do pozyskania, a przezroczysta natura zarodka dobrze nadaje się do badań obrazowych i optogenetycznych. Dodatkowo można przeprowadzić analizę behawioralną i przeprowadzić eksperymenty elektrofizjologiczne na włóknach mięśniowych, neuronach rdzenia kręgowego i neuronach tyłomózgowia w w dużej mierze nienaruszonych organizmach, co pozwala na zbadanie funkcji komórkowych in vivo. Co ważne, jesteśmy w stanie badać aktywność synaptyczną nie tylko w tej samej klasie komórek, ale w tej samej parze neuronów, od przygotowania do przygotowania. Innymi słowy, jest to jeden z nielicznych preparatów kręgowców, w którym można powrócić do tego samego neuronu, in situ, aby zbadać jego rozwój.

Aby utrzymać obwody neuronalne tak żywotne, jak to tylko możliwe, opracowaliśmy preparat, w którym tyłomózgowie i rdzeń kręgowy pozostały nienaruszone, podczas gdy łaty zaciskały się na komórkach M. W tym preparacie oczy, szczęka i skóra pokrywające mózg są delikatnie usuwane, a tyłomózgowie jest odklejane od struny grzbietowej, umożliwiając dostęp do brzusznej powierzchni tyłomózgowia. Neurony siateczkowo-rdzeniowe znajdują się na głębokości kilku mikrometrów i są stosunkowo łatwo dostępne. Po 48 godzinach od zapłodnienia (hpf; niektóre skróty podano w tabeli 1) komórki są elektrycznie zwarte i można z nich wiernie rejestrować aktywność synaptyczną (zarówno prądy pobudzające, jak i hamujące), prądy bramkowane napięciem i potencjały czynnościowe.

Nasze odkrycia sugerują, że wiele aspektów rozwoju i dojrzewania synaps występuje w ciągu 24 godzin przed wykluciem, dlatego większość naszej uwagi skupia się na organizmach w wieku od 24 hpf do 72 hpf. Jednak przy 72 hpf ogniwa M są mniej kompaktowe elektrycznie i trudno jest je prawidłowo rozmieścić. Technika ta może być wykorzystana do nagrywania nie tylko z komórek M, ale także z ich homologów, MiD2 cm i MiD3 cm. Teoretycznie można również wykonać podwójne nagrania, z neuronu rdzenia kręgowego, takiego jak pierwotny neuron ruchowy, oraz z komórki M, ale jest to trudne i można argumentować, że korzyści uzyskane z tak trudnej techniki mogą nie być warte nadzwyczajnego wysiłku, który jest wymagany.

Protokół

1. Przygotowanie i rozbiór

1. Przygotuj naczynie preparacyjne wyłożone Sylgardem. Komory nagraniowe firmy WPI (Sarasota, Floryda, USA; Dostawcy są wymienieni w tabeli 2) są używane jako naczynia preparacyjne (rysunek 1). Komory są przystosowane do umieszczania szklanych szkiełek, a małe plastikowe podkładki służą jako formy do Sylgarda. Podkładki najpierw mocuje się do suwaka za pomocą smaru, a na środek podkładki dodaje się płyn Sylgard. Sylgard utwardza się przez noc, a gdy to robi, tworzy małe, okrągłe łoże na szkiełku podstawowym, które staje się podstawą naczynia preparacyjnego. Szkiełko umieszcza się w komorze zapisu i służy jako podstawa komory, do której mocowany jest preparat (rys. 1).
2. Przygotować roztwory wymienione w tabeli 3. Roztwory zewnątrzkomórkowe należy pozostawić w temperaturze pokojowej, podczas gdy roztwory wewnątrzkomórkowe powinny być utrzymywane w sterylności. Można również dodać żółcień Lucyfera (0,1%) do roztworu wewnątrzkomórkowego, aby można było przeprowadzić wizualizację morfologii komórek M pod koniec eksperymentu. Służy to potwierdzeniu tożsamości komórki (ryc. 2).
3. Hodować zarodki danio pręgowanego typu dzikiego w wodzie z jajami w temperaturze 28,5 °C, a następnie zbierać i etapizować zgodnie z Kimmel i wsp. ¹⁰. W celu przeprowadzenia sekcji należy przenieść zarodki do naczynia sekcyjnego, które służy również jako komora rejestracyjna. Znieczulać przez 7-10 minut w znieczulającym roztworze soli (0,02% tricainy; roztwór 1, tabela 3), który jest bardzo zbliżony do fizjologicznej soli fizjologicznej. Można określić, czy są one odpowiednio znieczulone, badając reakcję na delikatne uszczypnięcie ogona.
4. Przypnij zarodki przez strunę grzbietową i umieść na szalce wyłożonej Sylgardem drutem wolframowym 0,001" (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) przy użyciu 25-krotnego powiększenia pod mikroskopem preparacyjnym (ryc. 1). Drut wolframowy można łatwo ciąć na małe segmenty za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych.
5. Dostosuj powiększenie lunety do sekcji na 40-50X, aby przeprowadzić sekcję. Po przypięciu zarodka do naczynia, szczęka, oczy i przodomózgowie są usuwane za pomocą cienkiej pary kleszczy (Dumont #5).
6. Tyłomózgowie jest delikatnie odrywane od leżącej poniżej struny grzbietowej poprzez ostrożne przesuwanie kleszczy między struną grzbietową a mózgiem. Tyłomózgowie jest następnie delikatnie odwracane tak, aby powierzchnia brzuszna była skierowana do góry. Takie ustawienie zapewnia dobry dostęp do komórek M, które zwykle znajdują się w odległości 5-10 μm od powierzchni brzusznej u młodych zarodków i ~20-50 μm u starszych larw (ryc. 2A).
7. Ostrożnie przenieś preparat do konfiguracji nagrywania, w której można przeprowadzić eksperyment z zaciskiem krosowym. Komórki M są wizualizowane za pomocą Nomarskiego Differential Interference Contrast (DIC), chociaż można również stosować inne tryby obrazowania (np. kontrast modulacyjny Hoffmana lub gradientowe obrazowanie kontrastowe Dodt firmy Luigs i Neumann z Niemiec).

2. Nagrywanie z użyciem zacisku krosowego (tryb całej komórki)

1. Wszystkie nagrania wykonywane są w trybie clampu krosowego całego ogniwa¹¹. Komory rejestracyjne umieszcza się na stoliku mikroskopowym w układzie elektrofizjologicznym. Nasze stoliki są zamocowane, a pionowy mikroskop z zaciskiem krosowym jest przykręcony do ruchomej platformy mikroskopu lub translatora mikroskopowego.
2. Pipety z zaciskiem krosowym są naciągane na poziomy ściągacz (P-97; Sutter Instruments Co.) z cienkościennego, borokrzemianowego szkła otrzymywanego z WPI. Średnice końcówek pipet są rzędu 0,2-0,4 μm po wypolerowaniu ogniowym do gładkiej krawędzi, a stożek trzpienia ma długość ~4 mm.
3. Podłącz pipetę do amplifier head-stage w konfiguracji elektrofizjologii. Ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45° do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia pipety, który jest odpowiedni do tworzenia uszczelek o wysokiej rezystancji na kuwecie Mauthnera.
4. Tuż przed wejściem do roztworu do kąpieli należy przyłożyć niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zabrudzenia końcówki. Podczas rejestrowania mEPSC, roztwory do kąpieli zawierają 1 μM TTX do blokowania potencjałów czynnościowych, 5 μM strychniny do blokowania receptorów glicyny i 10 μM bicukuliny lub 100 μM pikrotoksyny do blokowania receptorów GABA_A. Podczas rejestrowania mIPSC, roztwory do kąpieli zawierają 1 μM TTX, kwas kynureninowy i bikukulinę lub strychninę, w zależności od aktywności receptora będącego przedmiotem zainteresowania.
5. Zbliżyć się do M-cell z niewielką ilością dodatniego ciśnienia w pipecie. Nadciśnienie delikatnie popycha komórkę z boku na bok, a po umieszczeniu bezpośrednio nad komórką tworzy mały wgłębienie na błonie komórkowej. Pozostaw pipetę na miejscu na kilka sekund, aby delikatnie oczyścić powierzchnię komórki, aby można było utworzyć mocne uszczelnienie między pipetą a membraną. Uwolnienie nadciśnienia w pipecie pozwala na zainicjowanie zgrzewu, a niewielka ilość podciśnienia w połączeniu z ujemnym potencjałem pipety powoduje powstanie zgrzewów GigaΩ w ciągu kilku sekund.
6. Zmień potencjał podtrzymania na wzmacniaczu na -60 mV. Rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania. Natychmiast rejestruj potencjały membranowe i minimalizuj artefakty pojemności. Kompensacja pojemności ogniwa (_CM) i rezystancji dostępu (szeregowego) (Ra_{) o} 70-85%. R_a powinien być rutynowo monitorowany, co 30 sekund do minuty, a jeśli nastąpi zmiana o 20% lub więcej, przerwać eksperyment.
7. Po zakończeniu eksperymentu i zebraniu wystarczającej ilości danych, preparat poświęca się poprzez usunięcie tyłomózgowia za pomocą kleszczy. W tym momencie można rozpocząć analizę danych.

Wyniki

W tym manuskrypcie prezentujemy metodę rejestracji patch-clamp w trybie całokomórkowym z neuronów siateczkowo-rdzeniowych u zebryka, szczególnie skupiając się na limfocytach M. Oczywiście możliwe jest również nagrywanie w innych trybach zacisku krosowego, takich jak dołączanie do komórki, na lewą stronę i na zewnątrz. Rodzaj danych, które można uzyskać, nie ogranicza się do tego, co tutaj przedstawiliśmy, ale staramy się podać przykład zarówno aktywności synaptycznej (pobudzającej i hamującej) w trybie zacisku napięciowego, jak i potencjałów czynnościowych w cęgach prądowych. Wraz ze starzeniem się organizmu i rozwojem komórek M bardziej rozległych i skomplikowanych dendrytów, zdolność do odpowiedniego zacisku napięcia i zacisku przestrzennego komórki jest zagrożona, a tryb zacisku prądu staje się zapisem z wyboru.

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne nagrania pobudzających prądów receptorów AMPA i NMDA uzyskanych z 48 zarodków hpf w obecności TTX (1 μM) i środków farmakologicznych blokujących receptory GABA i glicyny. Gdy komórki M są napięte na poziomie -60 mV, prądy synaptyczne są spowodowane aktywacją receptorów AMPA (ryc. 3A). Rejestracja i analiza tych zdarzeń pozwala na rejestrację takich parametrów jak czas narastania, czas zaniku, amplituda i częstotliwość. Zdarzenia AMPA mają zazwyczaj szybki czas narastania (20-80% czasu narastania ~0,1 ms) i czas zaniku (~0,5 ms), a także wykazują średnią amplitudę około 25 pA. Gdy komórki M są zaciśnięte pod napięciem +40 mV, powstałe prądy zewnętrzne są spowodowane aktywnością receptorów AMPA i NMDA (ryc. 3C i 3D). Prądy receptora NMDA wykazują dłuższe przebiegi czasowe niż prądy receptora AMPA i muszą być rejestrowane przy dodatnim potencjale lub w roztworze wolnym od Mg, aby usunąć blok Mg receptorów NMDA^2,6. Średnia mEPSC pokazana na rysunku 3D reprezentuje mieszane prądy AMPA i NMDA zarejestrowane przy +40 mV.

Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne wyniki podczas rejestracji mIPSC z komórek Mauthnera. Zdarzenia te występowały w obecności TTX (1 μM) i kwasu kynureninowego (1 mM) w celu zablokowania receptorów AMPA i NMDA. Zdarzenia te wykazują dość szybką kinetykę narastania i zaniku o 48 hpf i są na tyle częste, że wiele z nich można uzyskać w ciągu 2-3 minut^nagrania3. Rysunek 5 przedstawia potencjały czynnościowe rejestrowane w wyniku wstrzyknięcia prądu depolaryzującego do ogniwa. Limfocyty M 48 zarodków hpf zwykle wystrzeliwują pojedynczy potencjał czynnościowy (ryc. 5B), chociaż czasami wystrzeliwują wiele AP po wstrzyknięciu bodźców ponadprogowych (ryc. 5A).

)

	skrót	Imię i nazwisko
Rozdział 1.	mPSC (Sieć psów)	Miniaturowy prąd postsynaptyczny
cyfra arabska.	mEPSC (Certyfikat Medyczny	Miniaturowy pobudzający prąd postsynaptyczny
cyfra arabska	Protokół mIPSC	Miniaturowy hamujący prąd postsynaptyczny
Rozdział 3.	MΩ	Mega Ohm (jednostka rezystancji; 106 Ohm)
Rozdział 4.	GΩ	Giga Ohm (jednostka rezystancji; 109 Ohm)
Rozdział 4.	MOsm (Język Żydowski)	Milli osmolar (jednostka osmolarności; 10-3 osmole)
Rozdział 4.	Mechanizm TTX	tetrodotoksyna
Rozdział 5.	Atp	trifosforan adenozyny
Lokal mieszkalny	GTP (GTP)	trifosforan guanozyny
Rozdział 7.	Dobra praktyka rolna	Białko zielonej fluorescencji

Tabela 1.

powiedział:

	Nazwa sprzętu	firma	Numer katalogowy
Rozdział 1.	Naczynie preparacyjne	Instrumenty Warnera	Nr kat. 64-0291
cyfra arabska.	0,001 "Drut wolframowy	Usługi Instrumentów Naukowych Inc.	Zobacz materiał W406
cyfra arabska	Mikroskop preparacyjny	Mikrosystemy Leica	MZ9.5
Rozdział 3.	Ściągacz do pipet	Instrumenty Sutter Co.	Zobacz materiał P-97
Rozdział 4.	Mikrokuźnia	Grupa Narishige	Drukarka MF-900
Rozdział 5.	Pionowy mikroskop z zaciskiem krosowym	Mikrosystemy Leica	DMLFSA (Biblioteka DMLFSA)
Lokal mieszkalny	Mikromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500
Rozdział 7.	Digidata (dane cyfrowe)	Urządzenia molekularne	1322A
Rozdział 8.	wzmacniacz	Urządzenia molekularne	200 mld
Rozdział 9.	Oprogramowanie do akwizycji	Urządzenia molekularne	pClamp9
Rozdział 10.	Aksograf X	Aksograf	Aksograf X

Tabela 2.

	Nazwa rozwiązania	Odczynnik i stężenie (mM)
Rozdział 1.	Roztwór preparacyjny	134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozy i 0,02% trikainy
cyfra arabska.	mPSC Roztwór zewnątrzkomórkowy	134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukozy i 0,001 TTX
Rozdział 3.	mPSC Roztwór wewnątrzkomórkowy	134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na2-ATP, 0,4 Li-GTP
Rozdział 4.	Potencjał czynnościowy Roztwór zewnątrzkomórkowy	137 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES i 10 Glucose (z 10 μM D-tubokuraryną)
Rozdział 5.	Potencjał czynnościowy Roztwór wewnątrzkomórkowy	130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4Mg-ATP i 0,4 Li-GTP.

Tabela 3. Wszystkie roztwory zewnątrzkomórkowe są dostosowane do 290 mOsm i pH 7,8. Wszystkie roztwory wewnątrzkomórkowe są dostosowane do 280 mOsm i pH 7,4.

Rysunek 1. Naczynie preparacyjne i nienaruszone przygotowanie rdzenia kręgowego tyłomózgowia. (A) Rozwarstwianie i rejestrowanie naczynia uzyskanego z WPI. Cienką podkładkę ostrożnie zamyka się na szklanym szkiełku na dnie naczynia i nakłada się Sylgard na studzienkę. (B) 48 hpf preparat rdzenia kręgowego tyłomózgowia. Brzuszna powierzchnia tyłomózgowia jest skierowana do góry, a komórka M znajduje się tuż pod powierzchnią tkanki na poziomie grotu strzały.

Rysunek 2. (A) Obraz kontrastowy interferencji różnicowej Nomarskiego komórki M uzyskany z zarodka o nasileniu 2 dpf wkrótce po wykluciu. Obraz został wykonany po zarejestrowaniu spontanicznej pobudzającej aktywności synaptycznej z komórki M. (B) Komórka została wypełniona żółtym Lucyferem podczas eksperymentu. Na podstawie¹² za zgodą.

Rysunek 3. (A) Spontaniczne mEPSC AMPA zarejestrowane z komórki M przy potencjale podtrzymania -60 mV. (B) Średnie mEPSC uzyskane z zapisu w (A). (C) Spontaniczne mEPSC AMPA i NMDA (groty strzałek) zarejestrowane z komórki M przy potencjale utrzymywania +40 mV. (D) Średnie mEPSC uzyskane z zapisu w (C). MEPSC glutaminianu zarejestrowano w obecności TTX (1 μM) w celu zablokowania potencjałów czynnościowych, strychniny (5 μM) i pikrotoksyny (100 μM) w celu zablokowania prądów glicyny i GABA.

Rysunek 4. (A) Spontaniczne mIPSC zarejestrowane z komórki M przy potencjale podtrzymania -60 mV. (B) Średnie mEPSC uzyskane z zapisu w (A). mIPSC rejestrowano w obecności TTX (1 μM) w celu blokowania potencjałów czynnościowych, kwasu kynureninowego (1 mM) w celu blokowania aktywności receptora glutaminianu i bicukuliny (10 μM) w celu blokowania prądów GABA.

Rysunek 5. Potencjały czynnościowe zarejestrowane z komórki M. W tej konkretnej komórce bodziec ponadprogowy (0,48 nA) wywołał kilka potencjałów czynnościowych (A), ale bodziec do progu powoduje tylko wytworzenie pojedynczego potencjału czynnościowego (B). (C) Aktualne protokoły dla śladów pokazanych w A i B.

Dyskusja

Opisany powyżej protokół pozwala na łatanie rekordu zaciskowego z komórek M i ich homologów. Technika jest trudna i należy zachować ostrożność w kilku kluczowych obszarach podczas całej procedury. Omówimy teraz niektóre z tych obszarów i udzielimy pomocnych wskazówek, które zapewnią sukces.

Konstrukcja komory prosektoryjnej/rejestracyjnej jest kluczowym aspektem eksperymentu. Komórki M są trudne do zobaczenia, chyba że stosuje się kontrast interferencyjny. Nomarski DIC działa najlepiej z czystymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, ale stwierdziliśmy, że bardzo cienka warstwa Sylgard (~1-2 mm) nie zniekształci DIC do tego stopnia, że zakłóci identyfikację komórek M. Dlatego używamy komory nagraniowej, która ma cienkie szklane szkiełko nakrywkowe na dnie, na którym umieszcza się małą plastikową podkładkę (średnica ~5 mm). Mieszamy Sylgard 184 na szalce Petriego i ostrożnie dodajemy płynny Sylgard do wnętrza myjki za pomocą pipety Pasteura. Sylgard można utwardzać w temperaturze pokojowej przez kilka dni lub można go podgrzać w celu szybkiego utwardzenia. Myjkę można wyjąć po utwardzeniu Sylgardu, chociaż nie jest to konieczne. Po wykonaniu komory preparcyjnej/rejestracyjnej można jej używać przez kilka tygodni, zanim potrzebne będzie świeże szkiełko wyłożone Sylgardem.

Kolejnym krokiem w procedurze jest sporządzenie wszystkich odpowiednich roztworów w dniu doświadczenia (Tabela 3). Roztwory wewnątrzkomórkowe zawierające wszystko oprócz ATP i GTP są przygotowywane z wyprzedzeniem i przechowywane w podwielokrotnościach o pojemności 5 ml w temperaturze -20 °C. W dniu rejestracji podwielokrotność rozmraża się do temperatury pokojowej i dodaje świeże ATP i GTP. Roztwór dostosowuje się do 280 mOsm i pH 7,4. W naszych rękach widzimy, że codzienne dodawanie świeżego ATP i GTP skutkuje dobrymi nagraniami. Wszystkie roztwory muszą być utrzymywane w sterylności, aby mieć największe szanse na sukces.

Roztwory wewnątrzkomórkowe muszą być filtrowane przez filtr 0,22 μm (Sigma) w celu usunięcia małych cząstek i zanieczyszczeń, które mogą mieć wpływ na zapis. Aby to zrobić, najpierw pobieramy roztwór wewnątrzkomórkowy do strzykawki o pojemności 1 ml, przymocowujemy filtr do końca strzykawki i dodajemy plastikową końcówkę pipety, która została podgrzana i pociągnięta do drobnej końcówki, do końca filtra. Dzięki temu możemy nanieść przefiltrowany roztwór wewnątrzkomórkowy bezpośrednio do wnętrza pipet ze szklanymi plastrami.

Po przygotowaniu roztworów zarodek można znieczulić i wypreparować. Przed przystąpieniem do sekcji należy zadbać o odpowiednią ocenę wieku organizmu. Każdy zarodek w lęgu starzeje się w nieco innym tempie. Dlatego przy ocenie wieku organizmu ważne jest, aby robić to zgodnie z ustalonymi procedurami ^10,13, wykorzystując wskazówki fenotypowe, takie jak liczba somitów, ogólny kształt ciała i czas zapłodnienia jaj. Wszystkie sekcje są wykonywane za pomocą cienkiej pary kleszczy Dumont #5. Muszą być ostre i w dobrym stanie technicznym, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie usunąć skórę pokrywającą tyłomózgowie i tkankę łączną na brzusznej powierzchni tyłomózgowia. Często musimy naostrzyć kleszcze po kilku tygodniach użytkowania i zrobić to sami za pomocą kamienia do ostrzenia.

Aby przypiąć rybę do cienkiej warstwy sylgardu, używamy szpilek wykonanych z cienkiego drutu wolframowego o średnicy 0,001 cala. Szpilki są wycinane starymi nożyczkami do mikropreparacji pod mikroskopem preparacyjnym i są na tyle małe, że mieszczą się w strunie grzbietowej. Przypinanie zarodków w jakimkolwiek innym miejscu nie unieruchamia ich i sprawia, że sekcje są prawie niemożliwe do wykonania. Kiedy po raz pierwszy uczysz się wykonywać nagrania, może być trudno zidentyfikować komórkę M na podstawie jej homologów (szczególnie MiD2 cm, która znajduje się w sąsiednim rombomerze - rombomerze 5). W niektórych zarodkach te dwie pary komórek wydają się mieć podobną wielkość. Otolity stanowią wygodny punkt orientacyjny, który pomaga w identyfikacji komórek M. Przy 48 hpf komórki M znajdują się tuż obok otolitów i mimo że otolity są usuwane podczas sekcji, pozostawiają lekko uszkodzony boczny obszar tyłomózgowia, który służy jako marker ich pierwotnej pozycji. Transgeniczne ryby, które wykazują ekspresję GFP lub innego markera fluorescencyjnego w komórce M, stanowią doskonałe przygotowanie dla nowych eksperymentatorów. W naszych rękach komórki M mają pojemność błony około 18-24 pF przy 48 hpf, podczas gdy mniejsze homologi są bliższe 12-14 pF. Ogniwa o większej powierzchni mają większe wartości pojemności błony (mierzone w pico Faradach (pF)) w porównaniu z mniejszymi ogniwami. W ten sposób pojemność membrany może być używana jako przybliżony wskaźnik wielkości komórki, przy czym większe ogniwa mają większe wartości pojemności. Ta cecha elektrofizjologiczna służy jako kolejna właściwość, dzięki której komórkę M można zidentyfikować na podstawie jej homologów. Wreszcie, często używamy żółtego Lucyfera w naszych rozwiązaniach do nagrywania (wewnątrzkomórkowego), co pozwala nam na przeprowadzenie pewnej identyfikacji badanego typu komórki za pomocą obrazowania fluorescencyjnego po zakończeniu nagrań.

Rezystancje końcówek pipet w zakresie 3,5-4,5 MΩ są najlepszym kompromisem pomiędzy rozmiarem końcówki a niską rezystancją dostępu, która zwykle wynosi od 8 do 15 MΩ. Jest to szczególnie ważne w przypadku zdarzeń z szybką kinetyką; ~0,1 ms (20-80%) czasy narastania i ~0,5 ms wykładnicze rozpady ^12,14,15 (rys. 3A i 3B). Dane są pozyskiwane z szybkością digitalizacji 50-100 kHz i filtrowane z częstotliwością dolnoprzepustową 5-10 kHz. Jeśli chodzi o pipety z plastrami, stwierdziliśmy, że nie muszą one być polerowane ogniowo, aby uzyskać nagranie, ale anegdotycznie wydaje się, że oferują nieco większą szansę na uzyskanie dobrych uszczelnień w porównaniu z pipetami niepolerowanymi. Ponieważ końcówki pipet są stosunkowo duże, nie dodajemy zbyt dużego nadciśnienia do pipety przed wprowadzeniem do roztworu. Wymaga to praktyki w decydowaniu o odpowiedniej ilości nadciśnienia, które należy zastosować, ponieważ nadmierne ciśnienie zbyt mocno przesunie komórkę i zapobiegnie tworzeniu się uszczelnienia. Może również uszkodzić kontakty synaptyczne, ponieważ komórka jest delikatnie przemieszczana z pierwotnej pozycji. Z drugiej strony, zbyt mały nacisk powoduje zabrudzenie końcówek i nie czyści powierzchni ogniwa na tyle dobrze, aby utworzyć dobre uszczelnienia. Złoty środek można osiągnąć tylko dzięki znacznej praktyce i doświadczeniu. Tworzenie uszczelnień można usprawnić poprzez zastosowanie ujemnych napięć w pipecie. Zazwyczaj mamy uszczelki o mocy 1,2-2 GΩ, które doskonale nadają się do przełamywania w trybie całego ogniwa.

Gdy konieczne jest zastosowanie środków farmakologicznych do cytoplazmy komórki, włączamy je do roztworu wewnątrzkomórkowego przed napełnieniem pipety. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania roztworów pipet, aby uniknąć utraty środków w wyniku związania ich z filtrem 0,22 μm. Dlatego najpierw filtrujemy pożywkę wewnątrzkomórkową, a następnie ostrożnie dodajemy środek farmakologiczny do przefiltrowanego roztworu. Zastosowanie związków do kompartmentu wewnątrzkomórkowego wiąże się z unikalnym zestawem wyzwań. Na przykład dodanie leków do pożywki wewnątrzkomórkowej zwykle zmniejsza szanse na utworzenie uszczelki GΩ, ale nie do tego stopnia, aby stanowiło główną przeszkodę w eksperymencie.

Należy zdawać sobie sprawę, że zastosowanie środków farmakologicznych w ten sposób nie pozwala eksperymentatorowi na zarejestrowanie najwłaściwszej kontroli, ponieważ czynnik ma natychmiastowy dostęp do komórki od początku całej konfiguracji komórki. Dlatego, chociaż rejestrujemy dane w tego typu eksperymencie, należy mieć świadomość, że następną najlepszą kontrolą jest wewnątrzkomórkowe zastosowanie nieaktywnej formy środka. W wielu przypadkach przybiera to postać związku inaktywowanego termicznie, zaszyfrowanego peptydu lub nieaktywnego izomeru otrzymanego od dostawcy.

Pozyskujemy dane w postaci prądów synaptycznych (mPSC), prądów bramkowanych napięciem oraz potencjałów czynnościowych. Prądy miniaturowe mogą być analizowane przez kilka doskonałych programów (pClamp, Axograph itp.), chociaż my wolimy używać Axograph X (John Clements). Axograph X działa zarówno na platformach Windows, jak i Macintosh i może być używany zarówno do pozyskiwania, jak i analizy danych elektrofizjologicznych. mEPC są pozyskiwane za pomocą wybranego przez eksperymentatora szablonu, uzyskanego z samego zapisu. Poszczególne zdarzenia mogą być analizowane pod kątem takich właściwości, jak czas narastania, amplituda, połowa szerokości i czas zaniku itp. Eksportujemy arkusz kalkulacyjny z danymi do Kaleidagraph (Synergy Software), gdzie możemy wyprodukować liczby, w tym kopie śladów zdarzeń z Axograph X.

Jednym z trudniejszych aspektów eksperymentu jest ustalenie, czy zapis został wykonany na tyle dobrze, aby dostarczyć czystych, wiarygodnych danych. Na przykład mogą wystąpić problemy z zaciśnięciem przestrzeni podczas rejestrowania mPSC z komórek M, które mają duże aksony i rozległe procesy dendrytyczne. Podczas zaciskania napięcia można na ogół dość dobrze kontrolować napięcie na końcówce pipety (zwłaszcza jeśli rezystancja dostępu_(Ra) jest niska), ale może nie być właściwej kontroli potencjału membrany w procesach dendrytycznych lub aksonach znajdujących się daleko od końcówki pipety. Jedną z metod określenia, czy komórka była prawidłowo zaciśnięta przestrzennie, jest utworzenie wykresu punktowego czasu narastania w funkcji amplitudy zarejestrowanych mPSC. Korelacja między danymi sugeruje niewystarczające ograniczenie przestrzeni. Innymi słowy, jeśli zacisk przestrzenny jest słaby, wówczas mPSC, które występują w pobliżu pipety, będą miały krótsze czasy narastania i większe amplitudy niż zdarzenia zachodzące w pewnej odległości od pipety. Jeśli korelacja istnieje, dane są problematyczne i nie można ich wykorzystać.

Innym aspektem zapisów elektrofizjologicznych, którym należy się zająć, są prądy upływowe. Jest to szczególnie ważne, gdy ogniwo jest zaciskane napięciem w celu rejestrowania prądów bramkowanych napięciem, takich jak prądy Na⁺ lub K⁺ . Gdy potencjał membranowy jest odchylony od spoczynku, prądy upływowe mogą być rejestrowane wraz z aktywnością bramkowaną napięciem. Prądy upływowe (I_L), kombinacja prądu potasu (I_K), sodu (I_Na) i chlorku (I_Cl) przepływające przez kanały bramkowane napięciem zaciemnią interesującą nas aktywność i muszą zostać odjęte od zapisu. Wzmacniacz jest w stanie wykonywać tę funkcję w trybie online podczas nagrywania, uruchamiając to, co zwykle nazywa się protokołem P/N. Podczas protokołu P/N wzmacniacz przeprowadzi kilka małych depolaryzacji (lub hiperpolaryzacji) ze spoczynku i zarejestruje wynikający z tego prąd upływu, który wystąpi. Ważne jest, aby używać wystarczająco małych impulsów, które nie aktywują kanałów bramkowanych napięciem. Prądy, które występują podczas tych impulsów, są rejestrowane i uśredniane, dzięki czemu te prądy upływowe można odjąć od aktywności kanału bramkowanego napięciem.

Na koniec należy wziąć pod uwagę potencjał połączeniowy, który występuje na końcu elektrody między roztworami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi. Roztwory wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe zazwyczaj składają się z różnych jonów o różnej aktywności i ruchliwości. Większe jony o mniejszej ruchliwości będą oferować większą oporność na ruch jonów niż mniejsze, co może skutkować niewielką, ale znaczącą różnicą potencjałów na styku roztworów. Ten potencjał złączowy musi być brany pod uwagę przy określaniu odpowiednich napięć doświadczanych przez ogniwo.

Przedstawiona tu technika jest stosowana przez nasze laboratorium od wielu lat. Istnieją jednak alternatywne metody nagrywania z komórki M. Przede wszystkim Joseph Fetcho i współpracownicy opracowali doskonały preparat, w którym można rejestrować z komórek M starszych larw (w wieku 4-5 dni) w sposób mniej inwazyjny niż przedstawiony tutaj, gdzie do komórki M zbliża się od powierzchni grzbietowej¹⁶. Próbowaliśmy podobnej techniki, ale okazało się, że łatwiej jest zbliżyć się do komórki M od brzusznej strony tyłomózgowia, gdzie komórka jest bliżej powierzchni mózgu, szczególnie u młodych ryb (tj. 24 hpf do 72 hpf). Co więcej, podejście od powierzchni grzbietowej zwykle wymaga użycia linii transgenicznej, która wyraża znacznik fluorescencyjny w komórce M, co może wprowadzić dodatkowe zmienne do zapisu. Ten problem nie występuje w przypadku używania ryb typu dzikiego. Jednak w przypadku przedstawionej tutaj techniki jesteśmy ograniczeni do badania młodszych zwierząt (od 24 hpf do 72 hpf). Każde podejście ma więc swoje zalety i ograniczenia.

Test t Studenta może być używany do porównywania dwóch grup danych, podczas gdy analiza wariancji (ANOVA) może być używana do porównywania wielu grup. Należy dołożyć starań, aby wybrać odpowiednie badanie post hoc dla danych parametrycznych i nieparametrycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie preparacyjne	Warner Instruments	64-0291
0,001" Drut wolframowy	Scientific Instruments Services Inc.	W406
Mikroskop preparacyjny	Leica Microsystems	MZ9.5
Ściągacz do pipet	Sutter Instruments Co.	P-97
Microforge	Narishige Group	MF-900
Pionowy mikroskop zaciskowy	Leica Microsystems	DMLFSA
Mikromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500
Digidata	Urządzenia molekularne	1322A
Wzmacniacz	Urządzenia molekularne	200B
Oprogramowanie do akwizycji	Urządzenia molekularne	pClamp9
Aksograf X	Aksograf	X