Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Podsumowanie

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Streszczenie

Nanomateriały na bazie węgla, takie jak nanorurki węglowe (CNT), należą do tego typu nanocząstek, które są bardzo trudne do odróżnienia od struktur komórkowych bogatych w węgiel i de facto nadal nie ma ilościowej metody oceny ich rozmieszczenia na poziomie komórek i tkanek. Proponujemy tu innowacyjną metodę pozwalającą na detekcję i kwantyfikację CNT w komórkach za pomocą cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego (ImageStream, Amnis). To nowo opracowane urządzenie łączy w sobie zarówno wysoką przepustowość komórek, jak i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zapewniając w ten sposób obrazy dla każdej komórki bezpośrednio w przepływie, a tym samym statystycznie istotną analizę obrazu. Każdy obraz komórki jest rejestrowany w kanałach jasnego pola (BF), ciemnego pola (DF) i fluorescencyjnych, dając dostęp odpowiednio do poziomu i rozkładu absorpcji światła, rozproszenia światła i fluorescencji dla każdej komórki. Analiza polega następnie na porównaniu piksel po pikselu każdego obrazu z 7000-10 000 komórek pobranych dla każdego warunku eksperymentu. Lokalizacja i kwantyfikacja nanorurek węglowych jest możliwa dzięki pewnym szczególnym właściwościom swoistym: silnej absorbancji i rozpraszaniu światła; rzeczywiście CNT pojawiają się jako silnie wchłonięte ciemne plamy na BF i jasne plamy na DF z precyzyjną kolokalizacją.

Ta metodologia może mieć znaczący wpływ na badania nad interakcjami między nanomateriałami a komórkami, biorąc pod uwagę, że ten protokół ma zastosowanie do szerokiego zakresu nanomateriałów, o ile są one zdolne do wystarczająco silnego absorbowania (i/lub rozpraszania) światła.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci miejsce nanocząsteczek zyskało na znaczeniu w szerokim zakresie zastosowań. W szczególności nanorurki węglowe (CNT) są coraz częściej badane jako nanonarzędzia do różnych zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych; Dzięki swoim szczególnym właściwościom elektrycznym, termicznym i spektroskopowym, CNT mogą działać jako nośniki różnych leków lub środków kontrastowych, a także mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej¹.

Jednak obawy dotyczące potencjalnej toksyczności takich nanomateriałów są nadal przedmiotem dyskusji, głównie dlatego, że los CNT w organizmie pozostaje bardzo kontrowersyjny. Rzeczywiście brakuje odpowiednich metod ich wykrywania i ilościowego oznaczania w żywych komórkach i tkankach: na przykład zasugerowano techniki takie jak spektroskopia Ramana, obrazowanie fotoakustyczne i fotoluminescencyjne w bliskiej podczerwieni, ale każda metoda wykazuje ograniczenia w zależności od rodzaju nanorurek i/lub ich środowiska^2-8.

Tutaj proponowana metoda może być stosowana do wykrywania i kwantyfikacji nanocząsteczek w komórkach. Było to możliwe dzięki zastosowaniu ImageStream, urządzenia łączącego w sobie zarówno cytometrię przepływową, jak i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Łączy w sobie zalety pozyskiwania dużej liczby komórek (do 5000 zdarzeń/s) oraz korzyści płynące z danych statystycznych i obrazów każdej komórki w wysokiej rozdzielczości w tym samym czasie (rozdzielczość przestrzenna 0,5 μm). Ogólnie rzecz biorąc, obrazy są zbierane za pomocą kamery CCD i są dwuwymiarową reprezentacją komórki w skali szarości. Światło jest oznaczane ilościowo dla każdego piksela na obrazie i identyfikuje zarówno intensywność, jak i lokalizację fluorescencji lub składników o rozmiarze subkomórkowym (na przykład w BF), co pozwala na potężną zdolność rozróżniania komórek na podstawie ich wyglądu^9,10.

Celem było zaprojektowanie metody nanometrologicznej, która umożliwiłaby ilościową ocenę rozkładu i zachowania CNT w komórkach. W szczególności metoda ta została opracowana w celu badania wychwytu, przetwarzania i egzocytozy CNT przez komórki. Udowodniliśmy, po pierwsze, złożony transport komórkowy CNT, a po drugie, transfer tych nanomateriałów między komórkami: zinternalizowane przez komórkę CNT uciekają z komórek gospodarza, gdy są zestresowane, rozprzestrzeniają się poza przestrzeń zewnątrzkomórkową i są reinternalizowane przez komórki naiwne, niezależnie od tego, czy są homotypowe, czy heterotypowe¹¹

.

Poprzednie badanie wykazało, że różne mechanizmy pobierania komórek, zarówno aktywne, jak i pasywne, mogą występować w zależności od stanu funkcjonalizacji i agregacji CNT¹². Tutaj wielościenne CNT funkcjonalizowano poprzez cykloaddycję i amidację 1,3-dipolarną, a następnie derywatyzowano za pomocą sondy fluorescencyjnej, fluoryzowano w izotiocyjanianach (FITC). W transmisyjnej mikroskopii elektronowej wydają się być internalizowane przez komórki albo pojedynczo z lokalizacją cytozolową, albo jako wiązki, najczęściej znajdujące się w przedziałach endosomalnych i lizosomalnych¹¹. W ImageStream zgrupowane CNT pojawiają się z wysoką korelacją jako ciemne plamy na BF i jasne plamy na DF, co pozwala na wyraźne rozróżnienie między komórkami znakowanymi CNT a komórkami kontrolnymi. Z drugiej strony, rozkład sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez marker fluorescencyjny funkcjonalizowany CNT nie był tak dobrze kolokalizowany: w rzeczywistości, prawdopodobnie z powodu zjawiska wygaszania, zielone plamki fluorescencyjne niekoniecznie pasują do plamek na BF i DF. Wskazuje to, że po pierwsze, sonda fluorescencyjna nie jest obowiązkowa do wykrywania CNT za pomocą ImageStream, a po drugie - a fortiori - że nie jest w pełni reprezentatywna zarówno dla kwantyfikacji, jak i lokalizacji CNT.

Oprócz statystycznej względnej kwantyfikacji nanocząstek, ta metoda dostarcza również informacji na temat lokalizacji CNT w komórkach, co oznacza, że rozróżnia na przykład CNT we wnętrzu komórki od tych, które są związane z błoną plazmatyczną. Możliwość lokalizacji CNT na obrazach komórkowych wyraźnie przezwycięża ograniczenia konwencjonalnej analizy metodą cytometrii przepływowej¹³. Procedura została opracowana poprzez stworzenie masek dopasowanych do określonych obszarów komórki i wybranie również ciemnych punktów odpowiadających załadowanym CNT.

Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda może być stosowana do szerokiego zakresu eksperymentów wymagających wizualizacji lub kwantyfikacji w komórkach, pod warunkiem, że użyte nanocząstki są w stanie silnie absorbować (i/lub rozpraszać) światło.

Protokół

1. Przygotowanie dyspergowanych w wodzie nanorurek węglowych (CNT)

1. Najpierw zdyspergować CNT w wodzie do hodowli komórkowej, a następnie poddać je sonikacji przez 20 minut w sonikutorze do kąpieli w temperaturze 20 °C. Jeśli CNT są funkcjonalizowane za pomocą sondy fluorescencyjnej, należy je w miarę możliwości chronić przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu.

2. Oznaczanie komórek za pomocą CNT

1. Hodować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) (na przykład) na płytkach o powierzchni 25 cm² w pożywce DMEM, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% streptomycyny penicyliny.
2. Przygotować roztwory CNT o stężeniu 0, 10, 20 i 50 μg/ml w kompletnym pożywce i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin lub w temperaturze 4 °C przez 20 godzin (2 ml zawiesiny CNT na płytkę o powierzchni 25 cm²).

3. Utrwalenie komórek

1. Następnie usunąć pożywkę inkubacyjną; przepłukać komórki PBS, trypsynizować i ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce DMEM. Wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min.
2. Zastąp pożywkę najpierw paraformaldehydem 4% przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie PBS w celu ich konserwacji. W razie potrzeby komórki można przechowywać na tym etapie procesu w temperaturze 4 °C przez kilka dni, aż do analizy cytometrycznej.
3. Każda próbka musi zawierać około 10⁶ komórek skoncentrowanych w 50 μl PBS. Zawieś je prawidłowo, aby uniknąć zagięć podczas analizy i przefiltruj je przez siatkowy barwnik o grubości 50 μm.
   Uwaga: Każdy krok musi być wykonany bardzo delikatnie, aby zachować komórki.

4. Akwizycja strumienia obrazu

Użyj cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego ImageStream, aby uzyskać obrazy komórek.
Należy przestrzegać kilku punktów:

1. Wybierz odpowiednie powiększenie (w tym przypadku używany jest obiektyw 40X).
2. Jeśli stosowane są fluorochromy:
   - przygotować próbkę kontrolną bez fluorochromu.
   - Przygotuj komórki z jednokolorową kontrolą pozytywną dla każdego użytego fluorochromu w
   dodatek do twoich próbek.
3. Użyj lasera 488 nm do wzbudzenia FITC i kanału 02 do zebrania emisji fluorescencji (pasmo przepustowe 480-560 nm). Ponadto należy również użyć kanałów 01 i 06 odpowiednio dla jasnego pola (BF) i ciemnego pola (DF).

5. Przetwarzanie końcowe - Oprogramowanie do analizy IDEAS (wersja 4.0)

1. Spośród wszystkich uzyskanych zdarzeń, analiza musi być najpierw ograniczona do populacji pojedynczych komórek: użyj biparametrycznego wykresu punktowego reprezentującego "współczynnik proporcji" (tj. szerokość/wysokość) w porównaniu z "powierzchnią komórki" (parametry zastosowane do komórek na BF) (rysunek 1). Pojedyncze komórki znajdujące się w obszarze zainteresowania o standardowym obszarze i współczynniku kształtu bliskim 1 są następnie odróżniane od zdarzeń wielokomórkowych (duży obszar i mały współczynnik proporcji) i szczątków (bardzo mały obszar).
2. Aby zaznaczyć komórki w płaszczyźnie ostrości, należy użyć dwuparametrycznego wykresu punktowego dostosowanego do wysoce kontrastowych komórek oznaczonych CNT: narysuj "kontrast" w funkcji "gradientu RMS" (który mierzy jakość ostrości obrazu) na obrazie BF - pozwala to na wykluczenie nieostrych komórek wykazujących zarówno niski gradient skuteczny, jak i niski kontrast na swoich obrazach BF (rysunek 1).
3. 1. Określ parametr, który zapewnia najlepszą separację statystyczną między komórkami oznaczonymi i nieoznaczonymi, korzystając z funkcji "znajdź najlepszą". W naszym badaniu cecha obiektu o średniej liczbie pikseli jest parametrem, który jest najbardziej odpowiedni (rysunek 2).
   2. Prześledź histogram za pomocą tego parametru w porównaniu ze znormalizowaną częstotliwością, aby porównać ilość wychwytywanych CNT dla badanych stężeń (ryc. 3).
   3. Prześledź wykres dwuparametryczny "średni obiekt pikselowy na BF" (notacja: średnia Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) w porównaniu z "intensywnością na DF" (Intensity_MC_Ch06), aby zbadać korelację między tymi dwoma parametrami (rysunek 4).
4. Ocenę ilościową ocenia się również za pomocą masek:
   1. Ponieważ CNT wydają się być silnie absorbującymi ciemnymi plamami na BF, najpierw utwórz maskę progową, która dokładnie je dopasuje, wybierając ograniczony zakres pikseli o niskiej intensywności mieszczący się w zakresie 0-533 w tym badaniu (Maska 1, notacja: Intensywność (M01, BF, 0-533)) (Rysunek 5). Wybór intensywności progowej jest dokonywany na znakowanych komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi.
   2. I odwrotnie, utwórz również maskę dopasowaną do pikseli o dużej intensywności (w tym przypadku 150-4095) DF (Maska 2, notacja: Intensywność (M06, DF, 150-4095)) (Rysunek 6).
   3. Narysuj wykres przy użyciu obszaru maski (1 lub 2; (notacja: Area_Intensity(M01, BF, 0-533) dla maski 1): zapewni względną kwantyfikację internalizacji CNT przy różnych stężeniach (ryc. 7).
   4. Sprawdź stopień korelacji między tymi dwiema maskami (dzięki wykresowi biparametrycznemu "obszar maski 1" w porównaniu z "obszarem maski 2") (rysunek 7).
5. Utwórz inne maski, aby zlokalizować CNT w komórkach:
   1. Maska pasująca do wnętrza komórki: Erode(M01, 7) - odpowiadająca masce całej komórki (M01) (Rysunek 8), która jest dodatkowo zerodowana o 7 pikseli (Rysunek 9).
   2. Maska pasująca do membrany tylko za pomocą równania Boole'a: M01 a nie Erode(M01,7) - maska całej komórki (M01) odjęta od wnętrza (Erode(M01,7)) (Rysunek 10).
   3. Aby uwzględnić ciemne piksele na membranie (odpowiadające CNT), utwórz maskę: Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Rysunek 11).
   4. Wizualizuj różne maski zastosowane do zbioru komórek, aby sprawdzić ich trafność (Rysunek 12) dla komórek oznaczonych i nieoznaczonych.
   5. Zastosuj obszar cechy na masce, zaznaczając czarne piksele na membranie "Area_Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533)" tzw. obszar. Pozwoli to na ilościowe określenie CNT na membranie.
      
      Aby ostatecznie odróżnić CNT, które zostały zinternalizowane, od tych zaadsorbowanych tylko na błonie, wykreśl obszar na błonie w porównaniu z czarnym obszarem na całej komórce (tj. "Area_ Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533' kontra 'Area_ Intensity(M01, BF, 0-533)').
      
      nuta: Ten sam rodzaj procedury jest stosowany w przypadku sygnału fluorescencyjnego FITC: porównaj wzrost intensywności fluorescencji FITC w porównaniu ze spadkiem średniego sygnału piksela na BF lub kolokalizację między ciemnymi plamami na BF i intensywności fluorescencji FITC. W naszym przypadku ten rodzaj analizy nie jest istotny, ponieważ sygnał fluorescencji nie pasuje prawidłowo do ciemnych plam na BF z jednej strony i do jasnego pola na DF z drugiej, co pokazuje, że wewnętrzne właściwości CNT (absorbancja i rozpraszanie światła) są bardziej odpowiednie niż sygnał związany z sondą fluorescencyjną.
6. Po utworzeniu wszystkich wykresów w jednym warunku eksperymentalnym utwórz "szablon raportu statystycznego", zapisz szablon jako plik .ast i zgrupuj wszystkie pliki danych.

Wyniki

Przegląd zasady działania urządzenia ImageStream jest podany na rysunku 1. Tworzy wiele obrazów o wysokiej rozdzielczości każdej komórki w przepływie, w tym jasnego pola (BF), ciemnego pola (DF lub światło rozproszone bocznie) i kanału (kanałów) fluorescencji, jak pokazano na rysunku 2 z trzema różnymi komórkami oznaczonymi CNT. Pokazane są również nakładki tych kanałów, które na pierwszy rzut oka ilustrują korelację.

Biorąc pod uwagę, że cała analiza post-processingu opiera się na obrazowaniu komórek, wybór skoncentrowanych komórek jest kluczowy dla badania (Rysunek 3). W rzeczywistości obecność CNT wywołuje zmiany zarówno w kontraście, jak i gradiencie w porównaniu z komórkami nieznakowanymi: skoncentrowane komórki, po zinternalizowaniu znacznej ilości CNT, mają zwykle niski gradient rms (który jest zwykle unikalnym parametrem używanym do dyskryminacji komórek skupionych i nieostrych), ale także ważny kontrast, wyjaśniający, dlaczego wykres dwuparametryczny jest niezbędny. Na rysunku 3 pokazano rozróżnienie między komórkami nieostrymi (żółty obszar) a komórkami zogniskowanymi (obszar niebieski).

Uwewnętrznione przez komórki CNT są wyraźnie rozróżnialne - szczególnie na BF wyglądają jak silnie absorbujące ciemne plamy (zobacz efekt zróżnicowanego stężenia znakowania, Rysunek 4). Co więcej, przeanalizowano średni sygnał pikselowy na BF, dając względną kwantyfikację wychwytu: wykresy na rysunku 5 pokazują jego znaczny wzrost wraz ze stężeniem znakowania CNT (wyniki dla około 7000 komórek na warunki eksperymentalne).

Po drugie, kwantyfikacja CNT jest również możliwa za pomocą masek, nakładanych albo na ograniczony zakres ciemnych pikseli BF, albo na piksel o dużej intensywności DF (patrz przykłady na rysunku 6), odpowiadające plamom wynikającym z obecności CNT. W ten sposób wykreślenie obszaru tych masek pozwala na podświetlenie, a także zwiększenie absorpcji (zilustrowane na rysunku 7 z obszarem maski na BF, wybierając piksele w zakresie od 0 do 533).

Ponadto korelację między plamkami na BF i DF można ocenić, wykreślając intensywność DF w stosunku do średniego sygnału piksela BF (jak na rysunku 8) (analiza niezależna od maski) lub obszar maski na BF (Maska 1) w porównaniu z obszarem na DF (Maska 2).

Jeśli chodzi o procedurę stworzoną do lokalizacji CNT wewnątrz komórek, Rysunek 9A pokazuje różne maski, które zostały utworzone. Należy pamiętać, że niezawodność masek lokalizacji (na podstawie erozji domyślnej maski komórki) musi być sprawdzana wizualnie w kolekcji komórek oznaczonych i nieoznaczonych. Te same maski są używane do wszystkich próbek.

Wykreślenie całkowitej powierzchni czarnych plam na błonie komórkowej w porównaniu z obszarem na całej komórce zapewnia wynik internalizacji dla komórek, które były inkubowane przez 20 godzin w temperaturze 37 °C w porównaniu do 2 godzin inkubacji w temperaturze 4 °C (patrz Rysunek 9B); wskazuje, że CNT są najczęściej zlokalizowane na błonie w temperaturze 4 °C, natomiast w temperaturze 37 °C CNT są internalizowane w ponad 90% komórek.

Na koniec, jeśli chodzi o fluorescencję, ten parametr nie był używany jako wskaźnik do kwantyfikacji CNT z powodu zbyt niskiej korelacji między plamkami fluorescencyjnymi a plamami na BF (i DF). Rzeczywiście, korelacja między intensywnością FITC a średnim pikselem jasnego pola wskazuje na współczynnik korelacji Pearsona wynoszący -0,2. Na rysunku 10 zilustrowano dwa przypadki, w których sygnał fluorescencji pasuje prawidłowo lub nie do czarnej plamki w jasnym polu.

Rysunek 1. Przegląd ImageStream - ogólna obsługa. System obrazowania wielospektralnego rejestruje do 12 obrazów/komórkę w trzech różnych trybach: jasnego pola, ciemnego pola i fluorescencji. Układ składa się z 5 laserów wzbudzających, w tym 405, 488, 560 i 658 nm. Światło jest zbierane z komórek przepływających w kuwecie z różnymi soczewkami obiektywowymi (w tym badaniu użyto soczewki obiektywu 40X) i przekazywane do elementu dekompozycji widmowej, który składa się z zestawu filtrów długoprzepustowych w układzie kątowym. Kamera CCD zbierająca obrazy z komórek jest obsługiwana przy użyciu techniki zwanej integracją z opóźnieniem czasowym, aby uniknąć smug obrazu. Rozszerzona głębia ostrości (EDF) jest opcją.

Rysunek 2. Galeria zdjęć komórek znakowanych nanorurkami węglowymi (50 μg/ml) przechwyconych przez ImageStream przez różne kanały (jasne pole (BF), ciemne pole (DF), fluorescencja (FITC) i ich nakładki). CNT zamknięte w lizosomach wewnątrzkomórkowych pojawiają się jako duże czarne plamy na obrazach w jasnym polu. I odwrotnie, tworzą jasne plamy na ciemnym polu i na obrazach fluorescencyjnych.

Rysunek 3. Zaznaczanie komórek, na których ustawiona jest ostrość. Dwuwymiarowy wykres punktowy reprezentujący gradient średniej kwadratowej (rms) w funkcji kontrastu na obrazach BF umożliwia wykluczenie nieostrych komórek. Tutaj żółty obszar reprezentuje nieostre komórki, podczas gdy skoncentrowane komórki są reprezentowane na niebiesko. Nieostre komórki charakteryzują się zarówno niskim kontrastem, jak i niskim gradientem rms na obrazie w jasnym polu. Oprócz gradientu rms, funkcja kontrastu jest wymagana do rozróżniania skoncentrowanych komórek po ich znakowaniu CNT.

Rysunek 4. Wychwyt CNT zależny od dawki wizualizowany przez ImageStream. Liczba i obszar czarnych plam na obrazach jasnego pola zwiększa się wraz z dawką CNT podczas inkubacji z komórkami (w zakresie 0-50 μg/ml). Zwróć uwagę, że komórki kontrolne są pozbawione czarnych plam.

Rysunek 5. Względna kwantyfikacja wychwytu CNT na podstawie obrazów jasnego pola. Histogramy cechy średniego piksela zastosowane do "obiektu" maski obejmującego całą komórkę wyraźnie pokazują zachowanie zależne od dawki, które można wykorzystać do oceny ilościowej. Zakres R9 otacza komórki CNT-dodatnie.

Rysunek 6. Tworzenie masek zaznaczających czarne punkty na obrazach BF i jasne punkty na obrazach DF. Ponieważ CNT pojawiają się jako silnie absorbujące ciemne plamy na obrazie BF, tworzona jest maska progowa w celu wybrania ograniczonego zakresu pikseli o niskiej intensywności mieszczącego się w zakresie 0-533 w tym badaniu (Maska 1, notacja: Intensywność (M01, BF, 0-533)). I odwrotnie, maska dopasowana do pikseli o dużej intensywności (w tym przypadku 150-4095) na obrazie DF (Maska 2, notacja: Intensywność (M06, DF, 150-4095)) służy do wyboru jasnego punktu na DF, odpowiadającego obszarom o wysokim rozproszeniu.

Rycina 7. Zależny od dawki wychwyt CNT wykazano poprzez ilościowe określenie obszaru czarnej plamki na obrazach BF. Za pomocą maski progowej (maski 1) nałożonej na BF, obszar czarnych plam można określić ilościowo dla każdej komórki, pokazując rozkład zależny od dawki.

Rysunek 8. Metody kwantyfikacji CNT oparte na obrazach BF (absorpcja) i DF (rozpraszanie) są ze sobą skorelowane. Po lewej stronie średni piksel na obrazie BF w porównaniu z intensywnością na obrazie DF wykazuje dobrą korelację dla komórek znakowanych CNT (50 μg / ml) (współczynnik korelacji Pearsona r = -0,68). Po prawej stronie obszar maski pasujący do ciemnych plam na BF w porównaniu z obszarem maski pasującym do jasnych punktów na DF dla komórek znakowanych CNT (50 μg/ml). Współczynnik korelacji Pearsona wynosi r = -0,83.Wykreślane są wartości z 7 000 komórek.

Rysunek 9. Lokalizacja CNT w komórkach przy użyciu określonych masek. (A) Maski są tworzone aby pasowały do określonego miejsca komórki, mianowicie od lewej do prawej - całej komórki, tylko błony, oraz wnętrza komórki. Kolejna maska dopasowuje się do czarnych plam dzięki intensywności progowej (Maska 1, notacja: Intensywność (M01, BF, 0-533)). (B) Ocenę lokalizacji CNT można uzyskać, mierząc obszar czarnych plam w różnych lokalizacjach komórek przy użyciu masek lokalizacyjnych opisanych w A. Inkubację z CNT (50 μg/ml) przeprowadzono zarówno w temperaturze 37 °C, jak i w 4 °C w celu zahamowania szlaku internalizacji. Wykres przedstawiający obszar na błonie w porównaniu z czarnym obszarem na całej komórce pokazuje zależne od dawki wchłanianie CNT na błonie w temperaturze 4 °C, podczas gdy pełna internalizacja CNT jest skuteczna w temperaturze 37 °C.

Rysunek 10. Kolokalizacja czarnych plam wywołanych CNT na BF z fluorescencyjnymi jasnymi plamami na obrazie FITC. Jasne plamy fluorescencji nie zawsze są kolokalizowane z czarnymi plamami na BF. Są one prawidłowo dopasowane do pierwszych dwóch wyświetlanych komórek, ale nie do dwóch ostatnich komórek.

Dyskusja

1. Modyfikacja i rozwiązywanie problemów

W tym badaniu pierwszym celem była ocena ilości i lokalizacji CNT w komórkach. Mikroskopia konfokalna mogła być a priori złotą metodą oceny wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia CNT funkcjonalizowanego markerem fluorescencyjnym FITC^8,14. Jednak główną wadą jest ograniczenie do obrazowania pojedynczych komórek, a co za tym idzie brak statystycznie istotnych danych. ImageStream umożliwia pracę poza tymi przeszkodami: Rzeczywiście, dzięki badaniu przesiewowemu dużej liczby komórek (5 000-10 000) w krótkim czasie (

W porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową, unikalną zaletą ImageStream jest dostarczanie wielospektralnych obrazów każdej komórki i porównanie intensywności sygnału piksel po pikselu. W ten sposób ImageStream łączy w sobie moc statystyczną wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej z zaletami analitycznymi obrazowania konfokalnego dla każdej analizowanej komórki. Ma to kluczowe znaczenie dla względnej kwantyfikacji i lokalizacji CNT w komórkach bez znaczników.

2. Kluczowe etapy w ramach protokołu

Krytyczny etap polega na wyborze parametrów najbardziej odpowiednich dla każdego badania. W naszym przypadku najlepszym sposobem było oparcie analizy na właściwościach absorpcyjnych i rozpraszających nanorurek: dobra korelacja między lokalizacją ciemnych plam na BF a jasnych plam na DF potwierdza, że opracowana metoda jest odpowiednia i wiarygodna - i mogłaby nie być możliwa bez obrazowania komórek.

3. Ograniczenia techniki

Należy podkreślić, że wizualizacja CNT w komórkach była możliwa tylko dlatego, że mają one tendencję do gromadzenia się w endosomalnych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, a następnie pojawiają się jako silne plamki absorpcyjne i rozpraszające. Pojedyncze nanorurki nie powinny być wykrywane w oparciu o tę metodę, podczas gdy ostatecznie można je wykryć za pomocą fluorescencji, co stanowi wyraźne ograniczenie. Po drugie, oznaczanie ilościowe nie jest "bezwzględne", lecz względne dla różnych stężeń znakowania i w porównaniu z kontrolnymi komórkami nieznakowanymi. Niektóre cechy ilościowe (średnia piksel, intensywność itp.) są parametrami bezwzględnymi, podczas gdy inne zależą od wyboru masek (maska progowa, maski lokalizacji).

4. Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod

Jeśli chodzi o fluorescencję, analiza ImageStream podkreśla słabą kolokalizację klastrów CNT między jasnym sygnałem FITC a plamami na innych kanałach. Dlatego wydaje się, że fluorescencja nie była wiarygodnym wskaźnikiem kwantyfikacji i lokalizacji CNT. Niemniej jednak, pokonując ograniczenia konwencjonalnej cytometrii przepływowej, która opiera się głównie na kwantyfikacji fluorescencji, wielospektralny ImageStream o wysokiej przepustowości toruje drogę do statystycznej kwantyfikacji bez znaczników , zapewniając jednocześnie lokalizację nanorurek węglowych wewnątrz komórek.

5. Przyszłe aplikacje

Tę wysokoprzepustową metodę statystycznej nanometrologii można uogólnić na dowolne nanomateriały, które wykazują wysoką absorpcję i rozpraszanie światła podczas interakcji z komórkami. W związku z tym może mieć ważne zastosowania w badaniach nad nano-biointerfejsem, nanotoksykologią i nanomedycyną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ImageStream	Amnis