Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Podsumowanie

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Streszczenie

Nanomateriały na bazie węgla, takie jak nanorurki węglowe (CNT), należą do tego typu nanocząstek, które są bardzo trudne do odróżnienia od struktur komórkowych bogatych w węgiel i de facto nadal nie ma ilościowej metody oceny ich rozmieszczenia na poziomie komórek i tkanek. Proponujemy tu innowacyjną metodę pozwalającą na detekcję i kwantyfikację CNT w komórkach za pomocą cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego (ImageStream, Amnis). To nowo opracowane urządzenie łączy w sobie zarówno wysoką przepustowość komórek, jak i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zapewniając w ten sposób obrazy dla każdej komórki bezpośrednio w przepływie, a tym samym statystycznie istotną analizę obrazu. Każdy obraz komórki jest rejestrowany w kanałach jasnego pola (BF), ciemnego pola (DF) i fluorescencyjnych, dając dostęp odpowiednio do poziomu i rozkładu absorpcji światła, rozproszenia światła i fluorescencji dla każdej komórki. Analiza polega następnie na porównaniu piksel po pikselu każdego obrazu z 7000-10 000 komórek pobranych dla każdego warunku eksperymentu. Lokalizacja i kwantyfikacja nanorurek węglowych jest możliwa dzięki pewnym szczególnym właściwościom swoistym: silnej absorbancji i rozpraszaniu światła; rzeczywiście CNT pojawiają się jako silnie wchłonięte ciemne plamy na BF i jasne plamy na DF z precyzyjną kolokalizacją.

Ta metodologia może mieć znaczący wpływ na badania nad interakcjami między nanomateriałami a komórkami, biorąc pod uwagę, że ten protokół ma zastosowanie do szerokiego zakresu nanomateriałów, o ile są one zdolne do wystarczająco silnego absorbowania (i/lub rozpraszania) światła.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci miejsce nanocząsteczek zyskało na znaczeniu w szerokim zakresie zastosowań. W szczególności nanorurki węglowe (CNT) są coraz częściej badane jako nanonarzędzia do różnych zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych; Dzięki swoim szczególnym właściwościom elektrycznym, termicznym i spektroskopowym, CNT mogą działać jako nośniki różnych leków lub środków kontrastowych, a także mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej¹.

Jednak obawy dotyczące potencjalnej toksyczności takich nanomateriałów są nadal przedmiotem dyskusji, głównie dlatego, że los CNT w organizmie pozostaje bardzo kontrowersyjny. Rzeczywiście brakuje odpowiednich metod ich wykrywania i ilościowego oznaczania w żywych komórkach i tkankach: na przykład zasugerowano techniki takie jak spektroskopia Ramana, obrazowanie fotoakustyczne i fotoluminescencyjne w bliskiej podczerwieni, ale każda metoda wykazuje ograniczenia w zależności od rodzaju nanorurek i/lub ich środowiska^2-8.

Tutaj proponowana metoda może być stosowana do wykrywania i kwantyfikacji nanocząsteczek w komórkach. Było to możliwe dzięki zastosowaniu ImageStream, urządzenia łączącego w sobie zarówno cytometrię przepływową, jak i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Łączy w sobie zalety pozyskiwania dużej liczby komórek (do 5000 zdarzeń/s) oraz korzyści płynące z danych statystycznych i obrazów każdej komórki w wysokiej rozdzielczości w tym samym czasie (rozdzielczość przestrzenna 0,5 μm). Ogólnie rzecz biorąc, obrazy są zbierane za pomocą kamery CCD i są dwuwymiarową reprezentacją komórki w skali szarości. Światło jest oznaczane ilościowo dla każdego piksela na obrazie i identyfikuje zarówno intensywność, jak i lokalizację fluorescencji lub składników o rozmiarze subkomórkowym (na przykład w BF), co pozwala na potężną zdolność rozróżniania komórek na podstawie ich wyglądu^9,10.

Celem było zaprojektowanie metody nanometrologicznej, która umożliwiłaby ilościową ocenę rozkładu i zachowania CNT w komórkach. W szczególności metoda ta została opracowana w celu badania wychwytu, przetwarzania i egzocytozy CNT przez komórki. Udowodniliśmy, po pierwsze, złożony transport komórkowy CNT, a po drugie, transfer tych nanomateriałów między komórkami: zinternalizowane przez komórkę CNT uciekają z komórek gospodarza, gdy są zestresowane, rozprzestrzeniają się poza przestrzeń zewnątrzkomórkową i są reinternalizowane przez komórki naiwne, niezależnie od tego, czy są homotypowe, czy heterotypowe¹¹

.

Poprzednie badanie wykazało, że różne mechanizmy pobierania komórek, zarówno aktywne, jak i pasywne, mogą występować w zależności od stanu funkcjonalizacji i agregacji CNT¹². Tutaj wielościenne CNT funkcjonalizowano poprzez cykloaddycję i amidację 1,3-dipolarną, a następnie derywatyzowano za pomocą sondy fluorescencyjnej, fluoryzowano w izotiocyjanianach (FITC). W transmisyjnej mikroskopii elektronowej wydają się być internalizowane przez komórki albo pojedynczo z lokalizacją cytozolową, albo jako wiązki, najczęściej znajdujące się w przedziałach endosomalnych i lizosomalnych¹¹. W ImageStream zgrupowane CNT pojawiają się z wysoką korelacją jako ciemne plamy na BF i jasne plamy na DF, co pozwala na wyraźne rozróżnienie między komórkami znakowanymi CNT a komórkami kontrolnymi. Z drugiej strony, rozkład sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez marker fluorescencyjny funkcjonalizowany CNT nie był tak dobrze kolokalizowany: w rzeczywistości, prawdopodobnie z powodu zjawiska wygaszania, zielone plamki fluorescencyjne niekoniecznie pasują do plamek na BF i DF. Wskazuje to, że po pierwsze, sonda fluorescencyjna nie jest obowiązkowa do wykrywania CNT za pomocą ImageStream, a po drugie - a fortiori - że nie jest w pełni reprezentatywna zarówno dla kwantyfikacji, jak i lokalizacji CNT.

Oprócz statystycznej względnej kwantyfikacji nanocząstek, ta metoda dostarcza również informacji na temat lokalizacji CNT w komórkach, co oznacza, że rozróżnia na przykład CNT we wnętrzu komórki od tych, które są związane z błoną plazmatyczną. Możliwość lokalizacji CNT na obrazach komórkowych wyraźnie przezwycięża ograniczenia konwencjonalnej analizy metodą cytometrii przepływowej¹³. Procedura została opracowana poprzez stworzenie masek dopasowanych do określonych obszarów komórki i wybranie również ciemnych punktów odpowiadających załadowanym CNT.

Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda może być stosowana do szerokiego zakresu eksperymentów wymagających wizualizacji lub kwantyfikacji w komórkach, pod warunkiem, że użyte nanocząstki są w stanie silnie absorbować (i/lub rozpraszać) światło.

Protokół

1. Przygotowanie dyspergowanych w wodzie nanorurek węglowych (CNT)

1. Najpierw zdyspergować CNT w wodzie do hodowli komórkowej, a następnie poddać je sonikacji przez 20 minut w sonikutorze do kąpieli w temperaturze 20 °C. Jeśli CNT są funkcjonalizowane za pomocą sondy fluorescencyjnej, należy je w miarę możliwości chronić przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu.

2. Oznaczanie komórek za pomocą CNT

1. Hodować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) (na przykład) na płytkach o powierzchni 25 cm² w pożywce DMEM, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% streptomycyny penicyliny.
2. Przygotować roztwory CNT o stężeniu 0, 10, 20 i 50 μg/ml w kompletnym pożywce i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin lub w temperaturze 4 °C przez 20 godzin (2 ml zawiesiny CNT na płytkę o powierzchni 25 cm²).

3. Utrwalenie komórek

1. Następnie usunąć pożywkę inkubacyjną; przepłukać komórki PBS, trypsynizować i ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce DMEM. Wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min.
2. Zastąp pożywkę najpierw paraformaldehydem 4% przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie PBS w celu ich konserwacji. W razie potrzeby komórki można przechowywać na tym etapie procesu w temperaturze 4 °C przez kilka dni, aż do analizy cytometrycznej.
3. Każda próbka musi zawierać około 10⁶ komórek skoncentrowanych w 50 μl PBS. Zawieś je prawidłowo, aby uniknąć zagięć podczas analizy i przefiltruj je przez siatkowy barwnik o grubości 50 μm.
   Uwaga: Każdy krok musi być wykonany bardzo delikatnie, aby zachować komórki.

4. Akwizycja strumienia obrazu

Użyj cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego ImageStream, aby uzyskać obrazy komórek.
Należy przestrzegać kilku punktów:

1. Wybierz odpowiednie powiększenie (w tym przypadku używany jest obiektyw 40X).
2. Jeśli stosowane są fluorochromy:
   - przygotować próbkę kontrolną bez fluorochromu.
   - Przygotuj komórki z jednokolorową kontrolą pozytywną dla każdego użytego fluorochromu w
   dodatek do twoich próbek.
3. Użyj lasera 488 nm do wzbudzenia FITC i kanału 02 do zebrania emisji fluorescencji (pasmo przepustowe 480-560 nm). Ponadto należy również użyć kanałów 01 i 06 odpowiednio dla jasnego pola (BF) i ciemnego pola (DF).

5. Przetwarzanie końcowe - Oprogramowanie do analizy IDEAS (wersja 4.0)

1. Spośród wszystkich uzyskanych zdarzeń, analiza musi być najpierw ograniczona do populacji pojedynczych komórek: użyj biparametrycznego wykresu punktowego reprezentującego "współczynnik proporcji" (tj. szerokość/wysokość) w porównaniu z "powierzchnią komórki" (parametry zastosowane do komórek na BF) (rysunek 1). Pojedyncze komórki znajdujące się w obszarze zainteresowania o standardowym obszarze i współczynniku kształtu bliskim 1 są następnie odróżniane od zdarzeń wielokomórkowych (duży obszar i mały współczynnik proporcji) i szczątków (bardzo mały obszar).
2. Aby zaznaczyć komórki w płaszczyźnie ostrości, należy użyć dwuparametrycznego wykresu punktowego dostosowanego do wysoce kontrastowych komórek oznaczonych CNT: narysuj "kontrast" w funkcji "gradientu RMS" (który mierzy jakość ostrości obrazu) na obrazie BF - pozwala to na wykluczenie nieostrych komórek wykazujących zarówno niski gradient skuteczny, jak i niski kontrast na swoich obrazach BF (rysunek 1).
3. 1. Określ parametr, który zapewnia najlepszą separację statystyczną między komórkami oznaczonymi i nieoznaczonymi, korzystając z funkcji "znajdź najlepszą". W naszym badaniu cecha obiektu o średniej liczbie pikseli jest parametrem, który jest najbardziej odpowiedni (rysunek 2).
   2. Prześledź histogram za pomocą tego parametru w porównaniu ze znormalizowaną częstotliwością, aby porównać ilość wychwytywanych CNT dla badanych stężeń (ryc. 3).
   3. Prześledź wykres dwuparametryczny "średni obiekt pikselowy na BF" (notacja: średnia Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) w porównaniu z "intensywnością na DF" (Intensity_MC_Ch06), aby zbadać korelację między tymi dwoma parametrami (rysunek 4).
4. Ocenę ilościową ocenia się również za pomocą masek:
   1. Ponieważ CNT wydają się być silnie absorbującymi ciemnymi plamami na BF, najpierw utwórz maskę progową, która dokładnie je dopasuje, wybierając ograniczony zakres pikseli o niskiej intensywności mieszczący się w zakresie 0-533 w tym badaniu (Maska 1, notacja: Intensywność (M01, BF, 0-533)) (Rysunek 5). Wybór intensywności progowej jest dokonywany na znakowanych komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi.
   2. I odwrotnie, utwórz również maskę dopasowaną do pikseli o dużej intensywności (w tym przypadku 150-4095) DF (Maska 2, notacja: Intensywność (M06, DF, 150-4095)) (Rysunek 6).
   3. Narysuj wykres przy użyciu obszaru maski (1 lub 2; (notacja: Area_Intensity(M01, BF, 0-533) dla maski 1): zapewni względną kwantyfikację internalizacji CNT przy różnych stężeniach (ryc. 7).
   4. Sprawdź stopień korelacji między tymi dwiema maskami (dzięki wykresowi biparametrycznemu "obszar maski 1" w porównaniu z "obszarem maski 2") (rysunek 7).
5. Utwórz inne maski, aby zlokalizować CNT w komórkach:
   1. Maska pasująca do wnętrza komórki: Erode(M01, 7) - odpowiadająca masce całej komórki (M01) (Rysunek 8), która jest dodatkowo zerodowana o 7 pikseli (Rysunek 9).
   2. Maska pasująca do membrany tylko za pomocą równania Boole'a: M01 a nie Erode(M01,7) - maska całej komórki (M01) odjęta od wnętrza (Erode(M01,7)) (Rysunek 10).
   3. Aby uwzględnić ciemne piksele na membranie (odpowiadające CNT), utwórz maskę: Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Rysunek 11).
   4. Wizualizuj różne maski zastosowane do zbioru komórek, aby sprawdzić ich trafność (Rysunek 12) dla komórek oznaczonych i nieoznaczonych.
   5. Zastosuj obszar cechy na masce, zaznaczając czarne piksele na membranie "Area_Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533)" tzw. obszar. Pozwoli to na ilościowe określenie CNT na membranie.
      
      Aby ostatecznie odróżnić CNT, które zostały zinternalizowane, od tych zaadsorbowanych tylko na błonie, wykreśl obszar na błonie w porównaniu z czarnym obszarem na całej komórce (tj. "Area_ Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533' kontra 'Area_ Intensity(M01, BF, 0-533)').
      
      nuta: Ten sam rodzaj procedury jest stosowany w przypadku sygnału fluorescencyjnego FITC: porównaj wzrost intensywności fluorescencji FITC w porównaniu ze spadkiem średniego sygnału piksela na BF lub kolokalizację między ciemnymi plamami na BF i intensywności fluorescencji FITC. W naszym przypadku ten rodzaj analizy nie jest istotny, ponieważ sygnał fluorescencji nie pasuje prawidłowo do ciemnych plam na BF z jednej strony i do jasnego pola na DF z drugiej, co pokazuje, że wewnętrzne właściwości CNT (absorbancja i rozpraszanie światła) są bardziej odpowiednie niż sygnał związany z sondą fluorescencyjną.
6. Po utworzeniu wszystkich wykresów w jednym warunku eksperymentalnym utwórz "szablon raportu statystycznego", zapisz szablon jako plik .ast i zgrupuj wszystkie pliki danych.

Wyniki

Przegląd zasady działania urządzenia ImageStream przedstawiono na Rysunku 1. Urządzenie to generuje wiele obrazów o wysokiej rozdzielczości dla każdej komórki w przepływie, w tym w polu jasnym (BF), polu ciemnym (DF lub światło rozproszone bocznie) oraz w kanałach fluorescencji, co zilustrowano na Rysunku 2 na przykładzie trzech różnych komórek znakowanych CNTs. Przedstawiono również nałożenia tych kanałów, co na pierwszy rzut oka obrazuje występującą korelację.

Biorąc pod uwagę, że cała analiza postprocesowa opiera się na obrazowaniu komórek, wybór komórek w ostrości ma kluczowe znaczenie dla badania (Rysunek 3). W rzeczywistości obecność CNT indukuje zmiany zarówno w kontraście, jak i gradiencie w porównaniu z komórkami nieznakowanymi: komórki w ostrości, które zinternalizowały znaczną ilość CNT, mają tendencję do niskiego gradientu rms (który zazwyczaj jest jedynym parametrem używanym do rozróżniania komórek w ostrości versus komórek poza ostrością), ale także wysoki kontrast, co wyjaśnia, dlaczego niezbędny jest wykres biparametryczny. Na Rysunku 3 przedstawiono rozróżnienie między komórkami poza ostrością (obszar żółty) versus komórkami w ostrości (obszar niebieski).

CNT zinternalizowane w komórkach są wyraźnie rozróżnialne – szczególnie w BF, gdzie jawią się jako silnie absorbujące ciemne punkty (patrz wpływ różnych stężeń znakowania, Rycina 4). Ponadto przeanalizowano średni sygnał piksela w BF, co pozwoliło na względną kwantyfikację poboru: wykresy na Rycynie 5 wykazują jego znaczący wzrost wraz ze stężeniem znakowania CNT (wyniki dla około 7 000 komórek na warunek eksperymentalny).

Po drugie, ilościowe oznaczenie CNT jest możliwe również poprzez zastosowanie masek, nakładanych albo na ograniczony zakres ciemnych pikseli w obrazowaniu BF, albo na piksele o wysokiej intensywności w obrazowaniu DF (patrz przykłady na Rysunku 6), odpowiadające plamkom wynikającym z obecności CNT. W związku z tym, wykreślenie powierzchni tych masek pozwala na uwydatnienie oraz wykazanie wzrostu poboru (zilustrowane na Rysunku 7 za pomocą powierzchni maski w BF, z wyborem pikseli w zakresie 0-533).

Dodatkowo korelacja między plamkami w BF a DF może zostać oceniona poprzez wykreślenie intensywności DF w funkcji średniego sygnału piksela BF (jak na Rysunku 8) (analiza niezależna od maski) lub powierzchni maski w BF (Maska 1) w funkcji powierzchni w DF (Maska 2).

W odniesieniu do procedury opracowanej w celu lokalizacji CNT wewnątrz komórek, Rycina 9A przedstawia stworzone różne maski. Należy pamiętać, że poprawność masek lokalizacji (opartych na erozji domyślnej maski komórki) musi zostać sprawdzona wizualnie na zbiorze komórek znakowanych i nieznakowanych. Te same maski są stosowane dla wszystkich próbek.

Wykreślenie całkowitej powierzchni czarnych plamek na błonie komórkowej w stosunku do powierzchni na całej komórce pozwala określić stopień internalizacji dla komórek inkubowanych przez 20 hr w 37 °C w porównaniu z inkubacją przez 2 hr w 4 °C (patrz Rycina 9B); wskazuje to, że w 4 °C CNTs znajdują się głównie na błonie, natomiast w 37 °C CNTs ulegają internalizacji w ponad 90% komórek.

Wreszcie, w odniesieniu do fluorescencji, parametr ten nie został wykorzystany jako wskaźnik do ilościowego oznaczania CNT ze względu na zbyt niską korelację między plamkami fluorescencyjnymi a plamkami w BF (i DF). Rzeczywiście, korelacja między intensywnością FITC a średnią wartością piksela w polu jasnym wskazuje współczynnik korelacji Pearsona wynoszący -0,2. Na Rysunku 10 przedstawiono dwa przypadki, w których sygnał fluorescencji odpowiednio pokrywa się lub nie pokrywa z czarną plamką w polu jasnym.

Rycina 1. Przegląd ogólnej zasady działania systemu ImageStream.Wielospektralny system obrazowania pozyskuje do 12 obrazów/komórki w trzech różnych trybach: w polu jasnym, polu ciemnym oraz fluorescencji. Układ składa się z 5 laserów wzbudzających, w tym 405, 488, 560 oraz 658 nm. Światło z komórek przepływających przez kuwetę jest zbierane za pomocą różnych obiektywów (w niniejszym badaniu użyto obiektywu 40X) i przekazywane do elementu dekompozycji spektralnej, który składa się z zestawu filtrów długoprzepustowych ułożonych w matrycy kątowej. Kamera CCD rejestrująca obrazy komórek pracuje w technice zwanej integracją z opóźnieniem czasowym (TDI), aby uniknąć smugowania obrazu. Opcjonalnie dostępna jest funkcja rozszerzonej głębi ostrości (EDF).

Rycina 2. Galeria obrazów komórek znakowanych nanorurkami węglowymi (50 μg/mL) wykonana za pomocą systemu ImageStream w różnych kanałach (pole jasne (BF), pole ciemne (DF), fluorescencja (FITC) oraz ich nałożenia). CNTs uwięzione w wewnątrzkomórkowych lizosomach widoczne są jako duże czarne plamy na obrazach w polu jasnym. Z kolei na obrazach w polu ciemnym i fluorescencyjnych tworzą one jasne plamy.

Rysunek 3. Wybór komórek w ostrości. Bivariantny wykres punktowy przedstawiający pierwiastkową średnią kwadratową (rms) gradientu w zależności od kontrastu na obrazach BF umożliwia wykluczenie komórek nieostrych. Tutaj obszar żółty reprezentuje komórki nieostre, natomiast komórki ostre są reprezentowane w kolorze niebieskim. Komórki nieostre charakteryzują się zarówno niskim kontrastem, jak i niską wartością rms gradientu na obrazie w jasnym polu. Oprócz gradientu rms, cecha kontrastu jest wymagana do rozróżnienia komórek ostrych po ich oznakowaniu CNTs.

Rycina 4. Zależne od dawki pobieranie CNT wizualizowane za pomocą systemu ImageStream. Liczba i powierzchnia czarnych punktów na obrazach w polu jasnym zwiększają się wraz z dawką CNT podczas inkubacji z komórkami (w zakresie od 0-50 µg/ml). Należy zauważyć, że komórki kontrolne są pozbawione czarnych punktów.

Rycina 5. Względna kwantyfikacja poboru CNT na podstawie obrazów w polu jasnym. Histogramy średniej cechy pikseli zastosowanej do maski „obiekt” obejmującej całą komórkę wyraźnie wykazują zależność od dawki, co może być wykorzystane do kwantyfikacji. Zakres R9 obejmuje komórki pozytywne pod kątem CNT.

Rycina 6. Tworzenie masek wybierających ciemne punkty na obrazach BF i jasne punkty na obrazach DF. Ponieważ CNT pojawiają się jako silnie absorbujące ciemne punkty na obrazie BF, utworzono maskę progową w celu wybrania ograniczonego zakresu pikseli o niskiej intensywności, mieszczącej się w tym badaniu w przedziale 0-533 (Maska 1, oznaczenie: Intensity(M01, BF, 0-533)). Z kolei maska dopasowana do pikseli o wysokiej intensywności (w tym przypadku 150-4095) na obrazie DF (Maska 2, oznaczenie: Intensity (M06, DF, 150-4095)) służy do wyboru jasnych punktów na obrazie DF, odpowiadających obszarom o wysokim rozproszeniu.

Rysunek 7. Zależne od dawki pobieranie CNT wykazane przez kwantyfikację powierzchni czarnych plamek na obrazach BF. Dzięki zastosowaniu maski progowej (mask 1) na obrazach BF, powierzchnię czarnych plamek można skwantyfikować dla każdej komórki, co wykazuje rozkład zależny od dawki.

Rycina 8. Korelacja metod ilościowego oznaczania CNT w oparciu o obrazy BF (absorpcja) i DF (rozpraszanie). Po lewej stronie: średnia wartość piksela na obrazie BF w stosunku do intensywności na obrazie DF, wykazująca dobrą korelację dla komórek znakowanych CNTs (50 µg/ml) (współczynnik korelacji Pearsona r = -0,68). Po prawej stronie: powierzchnia maski dopasowanej do ciemnych punktów na BF w stosunku do powierzchni maski dopasowanej do jasnych punktów na DF dla komórek znakowanych CNTs (50 µg/ml). Współczynnik korelacji Pearsona wynosi r = -0,83. Wykreślono wartości z 7 000 komórek.

Rysunek 9. Lokalizacja CNT w komórkach z wykorzystaniem specyficznych masek. (A) Maski zostały utworzone tak, aby dopasować do konkretnych obszarów komórki, mianowicie od lewej do prawej – całej komórki, samej błony oraz wnętrza komórki. Kolejna maska dopasowuje do czarnych plamek dzięki progowi intensywności (Maska 1, oznaczenie: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) Ocenę lokalizacji CNT można uzyskać poprzez pomiar powierzchni czarnych plamek w różnych lokalizacjach komórek przy użyciu masek lokalizacji opisanych w części A. Inkubację z CNT (50 µg/ml) przeprowadzono zarówno w 37 °C, jak i w 4 °C w celu zahamowania ścieżki internalizacji. Wykres przedstawiający czarną powierzchnię na błonie w stosunku do czarnej powierzchni całej komórki wskazuje na zależną od dawki absorpcję CNT na błonie w 4 °C, podczas gdy pełna internalizacja CNT jest efektywna w 37 °C.

Rycina 10. Kolokalizacja czarnych punktów indukowanych przez CNT w polu jasnym (BF) z jasnymi punktami fluorescencyjnymi na obrazie FITC. Jasne punkty fluorescencyjne nie zawsze kolokalizują z czarnymi punktami w BF. Odpowiadają one prawidłowo dla dwóch pierwszych wyświetlonych komórek, ale nie dla dwóch ostatnich.

Dyskusja

1. Modyfikacja i rozwiązywanie problemów

W tym badaniu pierwszym celem była ocena ilości i lokalizacji CNT w komórkach. Mikroskopia konfokalna mogła być a priori złotą metodą oceny wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia CNT funkcjonalizowanego markerem fluorescencyjnym FITC^8,14. Jednak główną wadą jest ograniczenie do obrazowania pojedynczych komórek, a co za tym idzie brak statystycznie istotnych danych. ImageStream umożliwia pracę poza tymi przeszkodami: Rzeczywiście, dzięki badaniu przesiewowemu dużej liczby komórek (5 000-10 000) w krótkim czasie (

W porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową, unikalną zaletą ImageStream jest dostarczanie wielospektralnych obrazów każdej komórki i porównanie intensywności sygnału piksel po pikselu. W ten sposób ImageStream łączy w sobie moc statystyczną wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej z zaletami analitycznymi obrazowania konfokalnego dla każdej analizowanej komórki. Ma to kluczowe znaczenie dla względnej kwantyfikacji i lokalizacji CNT w komórkach bez znaczników.

2. Kluczowe etapy w ramach protokołu

Krytyczny etap polega na wyborze parametrów najbardziej odpowiednich dla każdego badania. W naszym przypadku najlepszym sposobem było oparcie analizy na właściwościach absorpcyjnych i rozpraszających nanorurek: dobra korelacja między lokalizacją ciemnych plam na BF a jasnych plam na DF potwierdza, że opracowana metoda jest odpowiednia i wiarygodna - i mogłaby nie być możliwa bez obrazowania komórek.

3. Ograniczenia techniki

Należy podkreślić, że wizualizacja CNT w komórkach była możliwa tylko dlatego, że mają one tendencję do gromadzenia się w endosomalnych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, a następnie pojawiają się jako silne plamki absorpcyjne i rozpraszające. Pojedyncze nanorurki nie powinny być wykrywane w oparciu o tę metodę, podczas gdy ostatecznie można je wykryć za pomocą fluorescencji, co stanowi wyraźne ograniczenie. Po drugie, oznaczanie ilościowe nie jest "bezwzględne", lecz względne dla różnych stężeń znakowania i w porównaniu z kontrolnymi komórkami nieznakowanymi. Niektóre cechy ilościowe (średnia piksel, intensywność itp.) są parametrami bezwzględnymi, podczas gdy inne zależą od wyboru masek (maska progowa, maski lokalizacji).

4. Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod

Jeśli chodzi o fluorescencję, analiza ImageStream podkreśla słabą kolokalizację klastrów CNT między jasnym sygnałem FITC a plamami na innych kanałach. Dlatego wydaje się, że fluorescencja nie była wiarygodnym wskaźnikiem kwantyfikacji i lokalizacji CNT. Niemniej jednak, pokonując ograniczenia konwencjonalnej cytometrii przepływowej, która opiera się głównie na kwantyfikacji fluorescencji, wielospektralny ImageStream o wysokiej przepustowości toruje drogę do statystycznej kwantyfikacji bez znaczników , zapewniając jednocześnie lokalizację nanorurek węglowych wewnątrz komórek.

5. Przyszłe aplikacje

Tę wysokoprzepustową metodę statystycznej nanometrologii można uogólnić na dowolne nanomateriały, które wykazują wysoką absorpcję i rozpraszanie światła podczas interakcji z komórkami. W związku z tym może mieć ważne zastosowania w badaniach nad nano-biointerfejsem, nanotoksykologią i nanomedycyną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ImageStream	Amnis