Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

Summary

Opisujemy przygotowanie trzech próbek testowych i jak można je wykorzystać do optymalizacji i oceny wydajności mikroskopów STORM. Na tych przykładach pokazujemy, jak pozyskiwać surowe dane, a następnie przetwarzać je w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w komórkach o rozdzielczości około 30-50 nm.

Abstract

STORM to niedawno opracowana technika mikroskopii superrozdzielczej o rozdzielczości do 10 razy lepszej niż standardowe techniki mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ jednak obraz jest pozyskiwany w zupełnie inny sposób niż normalnie, poprzez budowanie obrazu cząsteczka po cząsteczce, istnieją pewne poważne wyzwania dla użytkowników w próbie optymalizacji pozyskiwania obrazu. Aby wspomóc ten proces i uzyskać lepszy wgląd w działanie STORM, przedstawiamy przygotowanie 3 próbek testowych oraz metodykę pozyskiwania i przetwarzania obrazów STORM w superrozdzielczości o typowych rozdzielczościach w zakresie 30-50 nm. Łącząc próbki testowe z wykorzystaniem ogólnodostępnego oprogramowania do przetwarzania rainSTORM, możliwe jest uzyskanie wielu informacji na temat jakości i rozdzielczości obrazu. Korzystając z tych wskaźników, można zoptymalizować procedurę obrazowania, począwszy od optyki, poprzez przygotowanie próbki, wybór barwnika, warunki buforowania, aż po ustawienia akwizycji obrazu. Pokazujemy również przykłady niektórych typowych problemów, które skutkują niską jakością obrazu, takich jak dryf boczny, w którym próbka porusza się podczas akwizycji obrazu, oraz problemy związane z gęstością powodujące zjawisko "błędnej lokalizacji".

Introduction

Ostatnio rozwinięto szereg technik mikroskopii optycznej, zwykle określanych jako mikroskopia superrozdzielcza lub nanoskopia, które mogą ominąć limit dyfrakcji i generować obrazy o rozdzielczości 100 nm lub lepszej ^1,2 . Od czasu ogłoszenia w 2008 r. mikroskopii superrozdzielczej jako metody roku w Nature Methods, nastąpił znaczny rozwój mikroskopów opartych na lokalizacji. Na przykład istnieją aplikacje wielokolorowe ^3-6 , implementacje 3D ^7-12, a nawet aplikacje na żywo komórkowe ^5,13-17 . Co więcej, w związku z tym, że systemy te są komercjalizowane i obecnie wychodzą z laboratoriów optycznych w ręce biologów komórkowych, prawdopodobnie nastąpi dalszy wzrost ich wykorzystania i zastosowania w kwestiach biomedycznych.

Jedną z gałęzi tej rodziny są metody oparte na lokalizacji, które działają poprzez budowanie obrazu cząsteczka po cząsteczce. W tym celu większość cząsteczek fluorescencyjnych w próbce musi zostać wyłączona, tak aby w danym momencie aktywnych było tylko kilka przestrzennie oddzielonych cząsteczek. Cząsteczki te są następnie szybko włączane i wyłączane, a następnie wykonywanych jest wiele obrazów, dzięki czemu znaczna część populacji jest obrazowana w celu odzwierciedlenia podstawowej struktury z precyzją subdyfrakcyjną. Opublikowano szereg podejść, w tym GSDIM ¹⁸, PALM ¹⁹, fPALM ²⁰, STORM ²¹ i RESOLFT ²². Algorytmy, które mierzą pozycję wykrywania pojedynczej cząsteczki, mogą być następnie wykorzystane do zlokalizowania rzeczywistej pozycji cząsteczki z precyzją lepszą niż 20 nm przy użyciu dopasowania Gaussa²³, na przykład rapidSTORM ^24,25, QuickPALM ²⁶, palm3d ¹² i rainSTORM²⁷. Podczas obrazowania komórek lub innych próbek biologicznych, które mają dużą gęstość cząsteczek, konieczne jest zatem pobranie wielu tysięcy klatek tego, przestrzennie oddzielonego sygnału w celu zobrazowania znacznej części znakowanych cząsteczek.

Stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM) oraz wysoce powiązane metody dSTORM i GSDIM są metodami super-rozdzielczości opartymi na lokalizacji, które okazały się działać z dostępnymi na rynku barwnikami organicznymi ²¹. Od tego czasu wykazano, że mają one zastosowanie do wielu różnych barwników ^28-30, co czyni tę metodologię szczególnie atrakcyjną ze względu na specyficzność i względną wygodę dobrze ugruntowanych podejść do znakowania immunologicznego w celu przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej. W związku z tym istnieje łatwy dostęp do szeregu koniugatów barwnik-przeciwciało i barwnik-biomolekuła, które mogą być potencjalnie wykorzystane w obrazowaniu superrozdzielczym opartym na lokalizacji. Podczas gdy ogólne zasady STORM i podobne podejścia są stosunkowo proste, a sprzęt i przygotowanie próbek na pierwszy rzut oka wydają się stosunkowo proste, istnieje wiele etapów w procesie, które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości, wolnych od artefaktów obrazów w superrozdzielczości.

Podobnie jak w przypadku wszystkich technik mikroskopowych, proces ten można podzielić na 3 główne etapy: po pierwsze, przygotowanie próbki, po drugie, akwizycja obrazu, a po trzecie, przetwarzanie obrazu i/lub analiza i interpretacja obrazu. Dodatkowa zdolność rozdzielcza i metoda generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości przy użyciu podejścia opartego na lokalizacji wprowadza pewne nowe problemy i rozważania ^31-33. Począwszy od przygotowania próbki, podczas wykonywania znakowania immunologicznego, w szczególności immunofluorescencji pośredniej, w której stosuje się kombinację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, należy zauważyć, że barwnik fluorescencyjny może znajdować się w odległości do 20 nm od cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku mikrotubul daje to średnice 35-50 nm w porównaniu z oczekiwaną średnicą mikrotubul 25 nm ^28,30 . Ponadto gęstość etykietowania powinna spełniać kryteria Nyquista, aby uzyskać obraz wysokiej jakości ¹⁴. Na przykład, aby uzyskać przewidywaną rozdzielczość obrazu 20 nm wzdłuż struktury nitkowatej, cząsteczka barwnika powinna znajdować się co najmniej co 10 nm ²⁷. Chociaż opublikowano wiele barwników, które działają w podejściach opartych na lokalizacji, ogólna wydajność barwnika jest mieszanką co najmniej czterech ważnych kryteriów, a mianowicie wykrytych fotonów na zdarzenie przełączające (jasność każdego mrugnięcia - im jaśniejsza jest lepsza), cykl pracy równowagi on-off (współczynnik kontrastu barwników w stanie wyłączonym i włączonym - więcej wyłączonego jest generalnie lepsze), frakcja przeżycia (niski wskaźnik bielenia jest lepszy) i liczba cykli przełączania (liczba mrugnięć na fluorofor - więcej jest lepsze dla wysokiej rozdzielczości, chociaż 1 mrugnięcie na fluorofor może być zaletą do celów liczenia cząsteczek). Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że właściwości te dla danego barwnika mogą się różnić w różnych warunkach buforowych i przy mocy lasera ^28,29 . Ponadto, oprócz tych unikalnych rozważań STORM, jakość obrazu można poprawić, optymalizując przygotowanie próbki w taki sam sposób, jak w przypadku bardziej tradycyjnych technik mikroskopii fluorescencyjnej, na przykład minimalizując autofluorescencję poprzez modyfikację warunków utrwalania i stosowanie odczynników hartujących. Ważne jest również zminimalizowanie niespecyficznie związanych fluoroforów, co można osiągnąć poprzez dostosowanie stężeń etykiety, czasu inkubacji oraz etapów blokowania i mycia.

Drugi krok pozyskiwania obrazów jest również krytyczny. Optymalne ustawienia mikroskopu będą zależeć od barwnika, warunków buforowania, gęstości etykietowania i rodzaju próbki, np. monowarstwy na szkle, komórkach lub próbkach tkanek. Główne czynniki to czas naświetlania aparatu, liczba klatek, kąt oświetlenia (TIRF, HILO, Epi) i moc lasera. Celem jest jak najszybsze zebranie jak największej liczby jasnych, przestrzennie oddzielonych od siebie mrugnięć. Jeśli tło jest bardzo wysokie lub mrugnięcia nie są zbyt jasne, innymi słowy, stosunek sygnału do szumu jest słaby, algorytm rekonstrukcji nie będzie w stanie zlokalizować pozycji tak dokładnie. Oprócz maksymalizacji precyzji lokalizacji, tj. można zmierzyć dokładność pomiaru każdej cząsteczki, jakość obrazu zależy również od dużej liczby lokalizacji. Jeśli zobrazowana zostanie niewystarczająca liczba interesujących nas cząsteczek, czy to z powodu słabej skuteczności znakowania, nadmiernego fotowybielania, czy nieodpowiedniej liczby klatek, wówczas wynikowy obraz o wysokiej rozdzielczości będzie punktowy i nieciągły, ponieważ kryteria Nyquista nie zostaną spełnione ^14,27.

I na koniec, trzeci krok, przetwarzanie obrazu, jest szczególnie ważny w porównaniu ze standardowymi technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Istnieje szereg swobodnie i komercyjnie dostępnych algorytmów, co jest zarówno zaletą, jeśli chodzi o wybór, jak i wadą, ponieważ ustalenie, który z nich jest najbardziej odpowiedni do użycia, może być mylące. Jeśli na przykład surowe dane mają dobrze rozmieszczone, przestrzennie odrębne mrugnięcia, algorytm dopasowania pojedynczej cząsteczki może być bardzo dokładny i wydajny, na przykład dzięki algorytmom rzadkiego dopasowania dostępnym w oprogramowaniu rainSTORM ²⁷, rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² i QuickPALM ²⁶. Jeśli surowe dane zawierają wiele nakładających się na siebie sygnałów, algorytmy, które mogą być bardziej odpowiednie, obejmują DAOSTORM ³⁴, 3B ³⁵ i deconSTORM ³⁶. Co więcej, algorytmy te zawierają progi dla różnych kryteriów, takich jak liczba sygnałów lub fotony na mignięcie, a także różne opcje wyświetlania obrazu, takie jak wizualizacja z wygładzonymi funkcjami Gaussa lub jako histogramy z siatkami pikseli, gdzie rozmiar piksela o superrozdzielczości może być wybrany przez użytkownika. Wszystkie te opcje zmieniają wygląd końcowego obrazu i mają wpływ na interpretację i analizę obrazu.

Dlatego prezentujemy 3 próbki testowe, które zapewnią nowemu użytkownikowi punkt wyjścia do eksperymentów z lokalizacją opartą na barwnikach, które dla jasności będziemy nazywać STORM, a bardziej doświadczonym użytkownikom możliwość dalszej optymalizacji swoich eksperymentów. Po pierwsze, możliwe jest pokrycie powierzchni szkła fluorescencyjną warstwą sprzężonego dekstranu i barwnika. Zapewnia to szybki i prosty sposób na ustalenie, czy mikroskop, barwnik i bufor działają w celu wygenerowania sygnału fluorescencyjnego. Metodę tę można następnie rozszerzyć, porównując średnią precyzję lokalizacji i wskaźniki liczbowe generowane przez rainSTORM w celu optymalizacji warunków buforowania, ustawień akwizycji obrazu i testowania różnych barwników. Po drugie, przedstawiamy prosty protokół przygotowania filamentów aktynowych na szkle, które można łatwo znakować za pomocą koniugatów falloidyna-barwnik. Zapewniają one idealne struktury do wykonywania pomiarów rozdzielczości ²⁷ i zazwyczaj pełna szerokość połowy maksimum (FWHM) żarnika jest podawana jako empiryczne oszacowanie rozdzielczości ³⁷. Należy zauważyć, że rozdzielczość różni się między próbkami i między obrazami w tej samej próbce, ponieważ rozdzielczość w mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji jest funkcją jasności fluoroforu, szumu tła i gęstości lokalizacji ²⁷ i niekoniecznie są one stałe w całej próbce. Filamenty aktynowe są używane do demonstrowania potencjalnych artefaktów, takich jak błędne lokalizacje i dryf, oraz sposobu ich identyfikacji za pomocą funkcji oprogramowania w rainSTORM. Ponadto opisujemy zastosowanie fluorescencyjnych markerów odniesienia zarówno do pomiaru, jak i korygowania dryfu. Po trzecie, opisano barwienie komórek koniugatami naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)-barwnik. EGF stanowi użyteczny wskaźnik wydajności obrazu o wysokiej rozdzielczości, ponieważ część receptora na powierzchni komórki ulega endocytozie za pośrednictwem pęcherzyków, które są strukturami o rozmiarach subdyfrakcyjnych o średnicy około 50-150 nm ^27,38,39 .

Protocol

Uwaga: W całym tym protokole, wskazówki i sugestie znajdują się po wykonaniu pewnych kroków. Notacja "*1" wskazuje, że uwaga 1 jest istotna dla tego konkretnego kroku i tak dalej.

1. Fluorescencyjna powłoka dekstranowa szkła

1. Dodać 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka 8-komorowego szkła nakrywkowego i inkubować przez 10 minut. Usunąć pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał płyn.
2. Rozpuść dextran-Alexa 647^*1 zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml. Na tej podstawie rozcieńczyć 0,25 μl w 25 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 μg/ml.
3. Aby utworzyć powłokę o dużej gęstości z roztworu dextran-Alexa 647, rozcieńczyć 20 μl roztworu 20 μg/ml w sumie 200 μl wody dejonizowanej. W przypadku roztworu o średniej gęstości rozcieńczyć 2 μl w 200 μl wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1:10 000 od oryginalnego roztworu podstawowego). W przypadku roztworu o małej gęstości rozcieńczyć 0,2 μl w 200 μl wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1:100 000 od oryginalnego roztworu podstawowego).
4. Dodać 200 μl rozcieńczonych roztworów dekstranu-Alexa 647 do każdego dołka i inkubować przez 10 minut. Można zastosować dłuższy czas inkubacji, co może skutkować gęstszą powłoką dekstranu. Wyjmij i umyj trzykrotnie_H2O^*2

Uwaga 1: Można używać innych koniugatów dektran-barwnik. Niesprzężony dekstran może być również sprzężony z barwnikami, jeśli pożądane kombinacje nie są dostępne na rynku.

Uwaga 2: Te same komory dekstranowe mogą być ponownie zobrazowane w ciągu kilku tygodni, chociaż jednorodność fluorescencji może się zmniejszyć. Zaleca się przechowywanie w temperaturze 4 °C przy braku bufora.

2. Fluorescencyjne filamenty aktynowe na szkle

1. Dodać 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka komory i inkubować przez 10 minut^*3. Usuń pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał żaden płyn.
2. Do każdej komory dodać 90 μl ogólnego buforu aktynowego (rozpuszczonego zgodnie z instrukcjami producenta). Dodać 10 μl 10 μM wstępnie uformowanego roztworu filamentu aktynowego i 1 μl falloidyny-Alexa 647 (0,2 jednostki, po rozpuszczeniu w 1,5 ml metanolu zgodnie z instrukcjami producenta) i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować przez 30 minut^*4.

Uwaga 3: Zwiększenie objętości roztworu filamentu w komorze powoduje zmniejszenie liczby włókien wiążących się ze szkłem pokrytym poli-L-lizyną.

Uwaga 4: Czas inkubacji do 48 godzin w temperaturze 4 °C został przetestowany z dobrymi wynikami. Jakość obrazu filamentu aktynowego pogarsza się, gdy komora została wystawiona na działanie bufora przełączającego, dlatego nie zaleca się używania tej samej próbki dłużej niż jeden dzień.

3. Mikrosferyczne koraliki fluorescencyjne jako znaczniki referencyjne

1. Rozcieńczyć 1 μl kulek TetraSpeck w 200 μl PBS i wymieszać.
2. Dodaj rozcieńczone kulki do komory obrazowania i odczekaj 15 minut^*5. Usunąć roztwór i przemyć 3 razy PBS przed obrazowaniem.

Uwaga 5 - czas rozcieńczania i inkubacji można dostosować do różnych gęstości koralików. Protokół ten zwykle daje od 3 do 10 kulek na pole widzenia 20,5 μm x 20,5 μm.

4. Barwienie komórek naskórkowego czynnika wzrostu

1. Hodowla komórek HeLa w komorach obrazowania do około 80% zbiegu w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny i streptomycyny.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Następnie dodać 500 μl 4% roztworu formaldehydu (4 ml 10% roztworu formaldehydu, 1 ml 10X PBS, 5 ml wody) przez 10 min. Usuń formaldehyd i przemyj 3 razy PBS. Nie pozwól, aby komórki pozostały suche i zawsze używaj roztworów buforowanych PBS, aby uniknąć stresu hipotonicznego.

UWAGA - formaldehyd jest niezwykle toksyczny. Upewnij się, że noszone są odpowiednie rękawice, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi usuwania formaldehydu.

3. Rozpuść EGF-Alexa 647 zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 μg/ml. Dodać 2 μl tego roztworu podstawowego do 200 μl 0,1% roztworu BSA (w PBS). Usunąć PBS z komórek, dodać roztwór EGF i inkubować przez 30 minut.
4. Usunąć roztwór i przemyć 3 razy PBS przed dodaniem roztworu blokującego 0,1% BSA (w PBS) przez 15 minut. Usunąć go i przemyć kolejne 3 razy PBS przed obrazowaniem.

5. Przygotowanie bufora przełączającego

1. Przygotować roztwór podstawowy enzymu (A) z 10 μl katalazy (20 μg/ml), 20 μl 1 M chlorowodorku fosfiny Tris (2-karboksyeltylu) (4 mM), 2,5 ml gliceryny (50%), 125 μl 1 M KCl (25 mM), 100 μl 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg oksydazy glukozowej (1 mg / ml) i uzupełnić do 5 ml objętości diH20. Jest to wystarczające do wytworzenia 100 x 50 μl podwielokrotności, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i używane przez okres do 1 roku.
2. ) Przygotować podstawowy roztwór glukozy (B) z 4 g glukozy (100 mg/ml), 4 ml gliceryny (10%) i 36 ml diH20. Jest to wystarczające do wytworzenia 100 x 400 μl podwielokrotności, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i używane przez okres do 1 roku.
3. Przygotować roztwór podstawowy środka redukującego (C) ze 113,6 mg MEA-HCl (1M) i 1 ml diH₂0. Użyć świeżych lub przygotować 10 porcji po 100 μl, które można przechowywać w temperaturze -20 °C i używać przez okres do 1 miesiąca (nie zamrażać ponownie porcji).
4. Tuż przed obrazowaniem należy zmieszać roztwory podstawowe enzymu (A), glukozy (B) i środka redukującego (C) w proporcjach 50 μl, 400 μl, 100 μl i uzupełnić do 1 ml PBS^*6. Ten bufor będzie teraz pochłaniał tlen i będzie miał środowisko redukujące (100 mM MEA-HCl)^*7. Końcowe pH powinno mieścić się w zakresie 6,0 - 8,5 (regulacja zwykle nie jest konieczna)^*8.

Uwaga 6 - ten bufor jest odpowiedni do stosowania z barwnikami na bazie karbocyjaniny, takimi jak Cy5 i Alexa 647.

Uwaga 7 - końcowe stężenia enzymów wynoszą 50 μg/ml (5 jednostek/ml) oksydazy glukozowej i 1 μg/ml (40-60 jednostek/ml) katalazy. Aktywność enzymatyczna (jednostki) jest podawana przez dostawców i może się różnić. Obliczenia dla katalazy zakładają, że 1 μg/ml stężenia końcowego po kroku 5.4 będzie zawierało 50 jednostek enzymu. Różne kompozycje, w tym podobne składniki pochłaniające tlen, można znaleźć ^21,30,40. Podsumowanie kombinacji i barwników znajduje się w piśmiennictwie ^28,29. Gliceryna i TCEP są wymagane do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C.

Uwaga 8 - jeśli obrazujesz filamenty aktynowe, dodaj 2 mM MgCl₂ i 0,2 mM ATP, aby pomóc ustabilizować filamenty.

6. Akwizycja danych STORM pod mikroskopem (przy użyciu barwnika Alexa 647)

1. Włączyć mikroskop STORM/PALM, najlepiej co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem, aby umożliwić osiągnięcie równowagi termicznej. Obrazowanie przed tym ma zwiększoną szansę na dryf.
2. Włóż komorę obrazowania do uchwytu na próbkę stolika mikroskopu. Upewnij się, że próbka jest mocno osadzona w uchwycie i jest płaska.
3. Wyjmij PBS z komory obrazowania, a następnie napełnij do góry buforem przełączającym. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze komory, upewniając się, że w ogóle nie ma pęcherzyków i że cała komora jest przykryta. Uzupełnij dodatkowym buforem lub PBS, jeśli widoczne są jakiekolwiek bąbelki, w przeciwnym razie wydajność bufora może się pogorszyć.

UWAGA - aby zminimalizować ryzyko poprzecznego i osiowego dryfu próbki w stosunku do soczewki obiektywu, zaleca się, aby próbka i bufor były pozostawione do zrównoważenia do temperatury pokojowej przez co najmniej 15 minut przed obrazowaniem.

4. Zlokalizuj interesującą nas strukturę fluorescencyjną, która ma zostać zobrazowana. Wybierz żądany kąt oświetlenia, w tym przypadku zalecany jest TIRF lub kąt bardzo nachylony, ponieważ poprawia to stosunek sygnału do szumu poprzez zminimalizowanie nieostrego światła, co jest szczególnie korzystne w przypadku próbek komórek. Wykonaj referencyjny obraz struktury z ograniczoną dyfrakcją przed obrazowaniem STORM.
5. Zwiększ laser wzbudzający (o odpowiedniej długości fali wzbudzenia około 640 nm) do dużej mocy, odpowiadającej około 2 kW/^cm2 podczas obrazowania przy ustawieniach kamery 10 ms ekspozycji i czasie cyklu około 50 Hz (klatek na sekundę). Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania (prawdopodobnie w ciągu 10 sekund w przypadku większości próbek), zbierz 10 000 klatek^*9.

Uwaga: 9 - 10 000 ramek jest odpowiednie dla opisywanych tutaj próbek, ale może być konieczne zwiększenie liczby ramek do 50 000 lub więcej dla innych próbek.

7. Rekonstrukcja obrazów o wysokiej rozdzielczości z surowych danych (przy użyciu rainSTORM)

1. Otwórz plik rainSTORM.m z poziomu programu MATLAB i uruchom (Rysunek 1A).
2. W oknie rainSTORM (Rysunek 1B) wybierz plik obrazu do analizy za pomocą przycisku przeglądania. Powinien to być plik .tif (ImageJ może być używany do konwersji innych typów plików na format tif). Zmień szerokość pikseli, aby dopasować ją do nieprzetworzonych danych systemu mikroskopowego użytego do uzyskania danych^*10. Pozostaw inne wartości domyślne.

Uwaga 10 - Typowa kamera EMCCD ma rozmiar piksela 16 μm, więc w systemie z obiektywem 100X rozmiar piksela na obrazie będzie wynosił 160 nm. W systemach komercyjnych rozmiar piksela jest zwykle wyświetlany w oprogramowaniu. Rozmiary pikseli wahają się od 100 nm do 160 nm dla większości mikroskopów lokalizacyjnych.

3. Naciśnij przycisk "Przetwarzaj obrazy" i poczekaj, aż pojawi się wstępny obraz. Czas trwania przetwarzania będzie zależał od rozmiaru pliku, specyfikacji komputera i liczby kandydujących mrugnięć w surowych danych^*11.

Uwaga: 11 - 10 000 sekwencji klatek danych aktyny i EGF zajęło odpowiednio 23 sekundy i 25 sekund na komputerze z procesorem Intel Xeon E5420. Korzystając z tego samego komputera bez zestawu narzędzi do przetwarzania równoległego w programie MATLAB lub z komputerem bez przetwarzania wielordzeniowego, czasy wynosiły odpowiednio 66 s i 81 s.

4. Aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości, naciśnij przycisk "Otwórz recenzenta", a pojawi się drugie okno (Rysunek 1C). Naciśnij przycisk "Dostosuj kontrast", aby zmienić sposób wyświetlania obrazu zgodnie z potrzebami (Rysunek 1D). W niektórych przypadkach, gdy obraz jest bardzo ciemny, wartość maksymalna powinna zostać zmniejszona.
5. Użyj okna recenzenta (Rysunek 1C), aby wygenerować przydatne wskaźniki jakości obrazu i jeszcze bardziej udoskonalić obraz w super rozdzielczości. Ustaw pierwsze trzy parametry kontroli jakości na wartości odpowiednio 4 000, 0,1 i 0,8-2,0^*12. Zaktualizuj liczbę na wartość fotonu, która powinna być oparta na pomiarze kalibracji fotonów lub przy użyciu wartości krzywej kalibracji krzywej fotonowej określonych przez producenta kamery dla określonego ustawienia wzmocnienia EM. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnej precyzji i rozdzielczości pomiarów^*13.

Uwaga 12 - Signal Counts odrzuca mrugnięcia na podstawie kryteriów jasności. Im wyższa wartość, tym jaśniejsze musi być mrugnięcie, aby zostało zaakceptowane jako lokalizacja na końcowym obrazie. Może to wymagać zmiany w zależności od ilości fotonów wytwarzanych przez barwnik oraz czasu ekspozycji i czułości aparatu. Tolerancja odrzuca mrugnięcia, jeśli występuje znaczny błąd kwadratowy między sygnałem a dopasowanym gaussowskim, tj. podwójne szczyty. Zakres PSF Sigma odrzuca mrugnięcia, jeśli dopasowana szerokość PSF wykracza poza ten zakres, tj. węższy zakres może być używany do odrzucania sygnałów nieostrych i dużych zagregowanych plam o stałej fluorescencji. Użycie szerszego zakresu może spowodować pojawienie się artefaktów błędnej lokalizacji na końcowym obrazie. W praktyce zaleca się przeprowadzenie wstępnej kontroli jakości za pomocą parametru odcięcia precyzji lokalizacji.

Uwaga 13 - więcej informacji na temat wskaźników rozdzielczości znajduje się w odnośnikach ^23,27. Krótko mówiąc, znając liczbę fotonów wytwarzanych przez każde mrugnięcie, można obliczyć precyzję lokalizacji każdej lokalizacji, a w konsekwencji uzyskać ogólne oszacowania średniej precyzji dla całego obrazu. Używając Andor iXON DU-897E z ustawieniem wzmocnienia 200, wartość zliczeń na foton wynosi 9,04.

6. Zmień granicę precyzji lokalizacji (Rysunek 1C), aby dokonać kompromisu między optymalizacją średniej precyzji lokalizacji w stosunku do liczby lokalizacji na końcowym obrazie. Zalecane są wartości 30-50 nm w zależności od jakości danych i próbki. Zarówno histogramy, jak i pliki info.txt mogą być wykorzystane do podjęcia tej decyzji (rysunki 1F i 1G).
7. Domyślny współczynnik skali rekonstrukcji (rysunek 1C) wynosi 5, co spowoduje wygenerowanie pikseli o wysokiej rozdzielczości 32 nm, przy założeniu, że szerokość pikseli na oryginalnych obrazach wynosi 160 nm. Jeśli obrazy RAW mają rozmiar piksela 100 nm, uzyska to obrazy o wysokiej rozdzielczości z pikselami 20 nm. Zwiększ współczynnik skali, aby uzyskać mniejsze piksele o wysokiej rozdzielczości na końcowym obrazie^*14.

Uwaga 14- Rozdzielczość mikroskopii lokalizacyjnej zależy od wygładzenia wymaganego do wizualizacji (tj. rozmiaru piksela prostej rekonstrukcji histogramu), jak również od precyzji lokalizacji. W praktyce rozmiar piksela rekonstrukcji powinien być na ogół mniejszy niż precyzja lokalizacji (patrz metryka Szacowana średnia precyzja w pliku tekstowym informacji - kroki 6.11 i 6.12). W tym przypadku utrata rozdzielczości spowodowana rekonstrukcją rozmiaru piksela będzie niewielka ^23,27. Na przykład średnia precyzja oszacowania w kierunku wiersza i kolumny na rysunku 4E wynoszą 16,1 nm i 16,2 nm. Do wizualizacji tych danych wykorzystano rozmiar piksela 16 nm (współczynnik skali rekonstrukcji 10 przy oryginalnej szerokości piksela 160 nm).

8. Zmodyfikuj limit zakresu ramek (Rysunek 1C), aby ograniczyć rekonstrukcję do podzbiorów danych pierwotnych, na przykład [2001-inf] wykluczy początkowe 2000 klatek danych pierwotnych.
9. Naciśnij przycisk "Uruchom przeglądarkę" (Rysunek 1C), aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości (Rysunek 1E).
10. Naciśnij przycisk "Wyświetl histogramy" (Rysunek 1C), aby wyświetlić wskaźniki jakości obrazu (Rysunek 1F)^*15.

Uwaga 15 - Wykres w prawym górnym rogu przedstawiający liczbę akceptowanych lokalizacji w stosunku do numeru klatki kamery oraz histogram Precyzji Lokalizacji Thompsona w prawym dolnym rogu (Rysunek 1F) może być użyty do informacji o opcji przeglądu precyzji lokalizacji. Na przykład użycie odcięcia 50 nm wykluczyłoby wszystkie lokalizacje o gorszej precyzji z uwzględnienia w końcowym obrazie o wysokiej rozdzielczości.

11. Naciśnij przycisk "Zapisz obraz" w recenzentze (Rysunek 1C), aby zapisać wszystkie te dane^*16.

Uwaga 16 - Można zapisać od 3 do 5 plików w zależności od wybranych opcji (suma obrazów, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists), patrz Rysunek 1G. Obraz przetworzony przez STORM jest wyświetlany ze zmodyfikowanymi mapami kontrastu i kolorów. STORMdataImage to obraz w skali szarości, w którym poziom szarości każdego piksela jest równy liczbie lokalizacji, które zostały w nim zidentyfikowane.

12. Po przeanalizowaniu danych (np. pliku Info.txt i histogramów) wróć do kroku 7.6 i w razie potrzeby powtórz kolejne kroki z innymi parametrami recenzenta. Naciśnięcie przycisku "Zapisz obraz" w kroku 7.11 spowoduje nadpisanie wcześniej zapisanych danych.

8. Śledzenie pudełek i korekta dryfu (przy użyciu rainSTORM)

1. Wykonaj kroki 7.1 - 7.9, aby wygenerować obraz w normalny sposób.
2. Naciśnij przycisk "Śledzenie pudełka" w recenzencie (Rysunek 1C), a następnie kliknij i przeciągnij pole na znacznik odniesienia lub strukturę będącą przedmiotem zainteresowania na recenzowanym obrazie.
3. Poczekaj, aż pojawi się nowy obraz, na którym zostaną wyświetlone "Pozycje w ramce" (patrz rysunki 6B, 6C i 6F dla przykładów). Zapisz ten obraz, jeśli chcesz.
4. Jeśli obiekt zainteresowania jest znacznikiem odniesienia, korektę dryfu można wykonać, klikając przycisk "Ustaw kotwicę", a następnie przycisk "Odejmij dryf". Na koniec ponownie kliknij "Uruchom recenzenta", aby wygenerować nowy obraz STORM, który będzie teraz miał wszystkie lokalizacje poprawione zgodnie z pozycjami znaczników odniesienia. Pozycje ściegów są usuwane z końcowego recenzowanego obrazu.
5. Jeśli na końcowym obrazie z korekcją dryfu znajdują się inne znaczniki odniesienia, można je usunąć, naciskając "Śledzenie pola", "Usuń pudełkowe", a następnie "Uruchom recenzenta" tyle razy, ile chcesz.

Results

Dekstran

Udane nałożenie dekstranu powinno wytworzyć monowarstwę fluorescencyjną. Przy wysokim stężeniu powinno to wydawać się stosunkowo jednolite. W niższych stężeniach będzie wydawał się rzadszy (ryc. 2A). Wiele mikroskopów STORM/PALM ma możliwość zmiany kąta oświetlenia z epifluorescencji na TIRF. W przypadku korzystania z widoku kamery pełnoklatkowej, na przykład w rozdzielczości 512 x 512 pikseli w typowej kamerze EMCCD, należy obserwować równomierne oświetlenie. Jeśli są jakieś paski lub nieostre obszary, może to oznaczać, że próbka powinna zostać ponownie włożona do uchwytu próbki ze świeżym olejem na soczewce obiektywu. Alternatywnie może to wskazywać na problem z mikroskopem.

Podczas pozyskiwania surowych danych o super rozdzielczości, moc lasera obrazującego powinna być zwiększona do około 2 kW/^cm2. Nastąpi początkowy wybuch fluorescencji, po którym nastąpi mruganie, gdy fluorofory zostaną wprowadzone w tymczasowe ciemne stany. Przy dużych gęstościach dekstranu mrugnięcia prawdopodobnie będą się na siebie nakładać, szczególnie na początku akwizycji obrazu (Wideo 1). Przy średniej i niskiej gęstości mrugnięcia te powinny być rzadkie, tj. przestrzennie oddzielone i ostre, bez widocznego tła (patrz klatki 2 000, 5 000 i 8 000, Rysunek 2A, Filmy 2 i 3). Podczas tej fazy akwizycji obrazu, przy stałym oświetleniu laserowym, liczba mrugnięć będzie się zmniejszać z czasem (porównaj klatkę 2 000 z klatką 8 000 w próbie o dużej gęstości, rysunek 2A). Główną różnicą między różnymi obrazami o wysokiej rozdzielczości różnych stężeń dekstranu (wysokich, średnich i niskich) jest zmniejszająca się liczba lokalizacji (ryc. 2A i 2B). Innymi słowy, stężenie cząsteczek fluorescencyjnych, liczba mrugnięć w surowych danych i liczba lokalizacji mają proporcjonalną zależność. Zależność ta nie jest jednak prosta liniowo, ponieważ przy bardzo dużych gęstościach cząsteczek oprogramowanie nie jest w stanie skutecznie zlokalizować cząsteczek (porównaj czerwoną i niebieską linię, rysunek 2C). Powodem tego jest to, że przy wysokim stężeniu nie jest możliwe, aby oprogramowanie przetwarzające dopasowało pozycje za pomocą algorytmu dopasowania Gaussa, w którym mrugnięcia nie są rzadkie. W miarę zmniejszania się mrugnięć w fazie akwizycji z powodu fotowybielania, oprogramowanie może dopasować coraz więcej mrugnięć, gdy stają się one rzadkie (rysunki 2A i 2C). Co więcej, poszczególne cząsteczki barwnika mogą mrugać, a zatem być zlokalizowane więcej niż raz ^28,41,42 .

Częstym problemem podczas obrazowania którejkolwiek z tych próbek, a szczególnie próbki dekstranu o wysokiej gęstości, może być obecność jasnej, ale nieostrej fluorescencyjnej mgły, która wydaje się szybko dyfundować podczas fazy akwizycji obrazu STORM. Różni się to od fluoroforów o wysokim kontraście na powierzchni szkła, które można zobaczyć mrugające (Rysunek 3A, Wideo 5). Tym oderwanym cząsteczkom fluorescencyjnym można zapobiec lub usunąć je poprzez zwiększenie liczby etapów płukania za pomocą PBS przed dodaniem bufora przełączającego lub poprzez dodanie nowego bufora przełączającego do komory (Rysunek 3B, Wideo 6). Przetwarzanie i porównywanie danych z każdej sekwencji obrazów skutkuje bardzo różnymi obrazami o wysokiej rozdzielczości, które mają tendencję spadkową zarówno pod względem liczby lokalizacji, jak i precyzji, z jaką można je dopasować w oprogramowaniu do lokalizacji mrugnięć (rysunki 3C, 3D, 3E i 3F).

Filamenty aktynowe

Wstępnie uformowane włókna aktyny można zobaczyć przyklejone do powierzchni szkła za pomocą obrazowania ograniczonego dyfrakcją (Rysunek 4A-4C). Jeśli liczba filamentów wydaje się bardzo niska, można zastosować dłuższy czas inkubacji lub pomóc również zmniejszenie objętości roztworu filamentu aktynowego. Wybór pojedynczych, stosunkowo jasnych włókien (rysunek 4D), a nie splątanych obszarów, skutkuje lepszą jakością obrazów. Podczas fazy akwizycji na całej długości żarnika powinny być widoczne jasne, ostre mrugnięcia (Wideo 7). Rzadkie mruganie powinno być widoczne w fazie akwizycji, a następnie w przetwarzanych danych powinno znajdować się cienkie ciągłe włókno (rysunek 4E), a lokalizacje na klatkę powinny stopniowo spadać (rysunek 4F), w przeciwieństwie do rysunku 3E.

Jeśli mruganie nie jest rzadkie, lub jeśli oprogramowanie nie jest w stanie zlokalizować molekuł, może powstać bardziej subtelny artefakt, zwany błędną lokalizacją ³². Dzieje się tak, gdy oprogramowanie uśrednia pozycję dwóch nakładających się na siebie cząsteczek, a lokalizacja to pozycja w połowie drogi między nimi. Wskazaniem, że nie wystąpiła znaczna liczba nakładających się mrugnięć, a w konsekwencji błędnych lokalizacji, jest to, że oszacowania średniej precyzji powinny być takie same w kierunkach wierszy i kolumn, tj. w poziomie i w pionie; Tam, gdzie występują błędne lokalizacje, wystąpiłyby one na całej długości włókna, powodując większe niż normalnie mrugnięcie (tj. rozłożone na więcej pikseli), które w konsekwencji zostałoby zlokalizowane z mniejszą dokładnością w jednym z kierunków. Jest to najłatwiej widoczne, gdy w obszarze obrazowania znajduje się pojedynczy filament aktyny i leży on poziomo lub pionowo. W tym przypadku mikroskop STORM osiągnął średnią precyzję 16 nm w obu kierunkach. Daje to granicę precyzji, czyli miarę efektywnej rozdzielczości obrazu wynoszącej około 34 nm. Metryki te są dostarczane przez rainSTORM ²⁷, jednak ponieważ mamy nitkowatą strukturę o jednolitej średnicy, 7 nm z bardzo małą etykietą phalloidyny-Alexa 647, możemy zmierzyć FWHM, aby oszacować rozdzielczość obrazu. Rysując linię prostą przez żarnik obrazu o wysokiej rozdzielczości na obrazie ImageJ (rysunek 4G), korzystając z funkcji profilu wykresu (rysunek 4H), a następnie wykonując dopasowanie gaussowskie (rysunek 4I), FWHM oblicza się jako 43,2 nm. Podczas próby wykonania tego pomiaru zalecamy, aby rozmiar piksela był równy lub nieco mniejszy niż średnia oszacowana precyzja obrazu (patrz plik info.txt Rysunek 1G). W tym przypadku do rekonstrukcji obrazu użyto pikseli 16 nm.

Dwa powiązane problemy mogą wystąpić w przypadku STORM, gdzie fluorofory stają się nierzadkie, tzn. pojedyncze cząsteczki w promieniu około 250 nm w tym samym czasie, a zatem sygnały nakładają się na siebie. Po pierwsze, w zależności od algorytmu i stosowanych przez niego kryteriów kontroli jakości, mrugnięcia mogą w ogóle nie być zlokalizowane. Skutkuje to obrazami o wysokiej rozdzielczości z niewielką liczbą lokalizacji lub bez nich. Drugi problem z błędnymi lokalizacjami występuje, gdy dwa mrugnięcia wystąpiły wystarczająco blisko siebie, aby wyglądać jak jedno mrugnięcie. W tym przypadku pozycja na końcowym obrazie reprezentuje średnią z tych dwóch. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w odnośniku ³². W obu przypadkach może się to zdarzyć w przypadku próbek o bardzo dużej gęstości, niewystarczającej mocy lasera lub problemów z przełączaniem bufora. Problem ten jest widoczny tam, gdzie wiele filamentów aktynowych rozgałęzia się i/lub krzyżuje ze sobą (ryc. 5A-D, film 9). Przetwarzając podzbiory klatek i porównując pierwszą i ostatnie 5 000 klatek, możemy zobaczyć inny wynikowy obraz. Na obrazie o wysokiej rozdzielczości z użyciem pierwszych 5000 klatek (Rysunek 5C) widzimy, że w środku obrazu znajduje się wiele lokalizacji, jednak przy użyciu ostatnich 5000 klatek bardzo niewiele z nich jest widocznych i pozostają nam tylko włókna, choć nieco nieciągłe ze względu na małą liczbę lokalizacji na obrazie (Rysunek 5D). Jeśli podejrzewa się zbyt dużą gęstość mrugania, porównanie obrazów z lokalizacją na klatkę, dane mogą zdecydowanie sugerować, że ten problem występuje; w pierwszym zestawie klatek średnia liczba lokalizacji na klatkę wynosi ponad 10 w porównaniu z ostatnim zestawem klatek, w którym wynosi ona około 4 (ilustracja 5E). W celu zminimalizowania prawdopodobieństwa wystąpienia błędnych lokalizacji idealnie jest mieć jak najmniej lokalizacji na klatkę, chociaż jeśli do zobrazowania ma być duża liczba cząsteczek, np. w przypadku próbki o dużej gęstości, wymaga to pobrania dużej liczby ramek akwizycji, co prowadzi do innego problemu w mikroskopii STORM, jakim jest dryf.

Dryf boczny - Filamenty aktynowe i znaczniki odniesienia

Dryf występuje, gdy próbka porusza się w stosunku do soczewki obiektywu przez fazę akwizycji danych. Jest to trudne lub niemożliwe do zauważenia w fazie akwizycji obrazu, zwłaszcza jeśli jest on boczny, a nie osiowy, lub jeśli nie jest mierzony konkretnie, ponieważ zwykle jest to mniej niż 50 nm w ciągu kilku minut dla stosunkowo stabilnych systemów mikroskopowych. Jednak na zrekonstruowanych obrazach znanych struktur, takich jak filamenty aktynowe o dobrze zdefiniowanej strukturze, można to wykryć na obrazach o wysokiej rozdzielczości. Pierwszą oznaką, że mogło dojść do dryfu bocznego, jest to, że struktura jest większa niż oczekiwano (Rysunek 6A, Wideo 8), na przykład ze stosunkowo dużym FWHM w porównaniu z precyzyjnymi danymi granicznymi z rainSTORM, w tym przypadku 90 nm w porównaniu z 67 nm. Jednak lepszym sposobem wykrywania dryfu jest porównanie lokalizacji w funkcji czasu, tj. sprawdzenie, czy lokalizacje w późniejszych klatkach są przesunięte w porównaniu z tymi we wczesnych klatkach. Można to wyraźnie zauważyć w przypadku filamentów aktynowych, które są bardzo małe i mają jednolitą strukturę, gdy są wyświetlane z kodem kolorystycznym za pomocą funkcji śledzenia pudełka w rainSTORM (rysunki 6B i 6C).

Dryf jest dobrze rozpoznanym problemem i istnieje wiele strategii, które można zastosować, aby go zminimalizować ¹⁹ lub skorygować po przejęciu, używając markerów fiducial ^21,43 lub korelacji krzyżowych ⁴⁴ . W celu zmierzenia dryfu i jego skorygowania, kulki fluorescencyjne o średnicy 100 nm mogą być używane jako znaczniki odniesienia (rysunek 6D). Ponieważ są małe i jasne, ich położenie można dokładnie zmierzyć za pomocą algorytmów dopasowania Gaussa, takich jak rainSTORM. W przykładzie, w którym występuje stosunkowo poważny dryft około 100 nm w ciągu 3 min 10 sekund, podczas fazy akwizycji (rysunek 6E) ta sama funkcja śledzenia pudełka może być użyta do oznaczenia kolorami i potwierdzenia, że wystąpił dryft (rysunek 6F). Ponieważ wszystkie cztery koraliki w tym przykładzie wykazują prawie identyczny dryft, możliwe jest wybranie jednego z nich, w tym przypadku koralika 2, aby użyć go jako odniesienia i odjąć dryft od pozostałych koralików (Rysunek 6G). Dodając markery referencyjne do próbki biologicznej będącej przedmiotem zainteresowania, możliwe staje się zmierzenie i skorygowanie dowolnego dryfu, w którym podstawowa struktura jest nieznana lub znacznie bardziej zmienna niż włókno aktynowe lub kulka fluorescencyjna.

Czynnik wzrostu naskórka

Na koniec, komórki HeLa barwione EGF mogą być użyte do przedstawienia realistycznego przykładu rozdzielczości obrazu w komórkach (Rysunek 7A, Wideo 10). Komórki te są stosunkowo łatwe do zobrazowania, ponieważ powinny mieć większość fluorescencji EGF w płaszczyźnie ostrości na powierzchni komórki w bliskiej odległości od szkła nakrywkowego. Im mniej jasny obszar, tym bardziej pośrodku znajduje się środek, czemu odpowiada położeniu jądra. Oświetlenie TIRF może poprawić jakość obrazu, eliminując nieostrą fluorescencję pochodzącą z części błony komórkowej, które nie znajdują się w bliskiej odległości od szkła (około 150 nm penetracja komórek). Powiększone obszary zainteresowania na obrazie o ograniczonej dyfrakcji są zazwyczaj niewyraźne (ryc. 7B i 7C), jednak na obrazach o wysokiej rozdzielczości powinna występować mieszanina klastrów i sporadycznie izolowanych pojedynczych pikseli (ryc. 7D-7F). Będą one reprezentować albo izolowane receptory EGF na powierzchni komórki, albo być może niewielką ilość niespecyficznego wiązania. Klastry będą miały średnicę około 100 nm i prawdopodobnie będą odpowiadać formowaniu się wgłębień i pęcherzyków, szlaku, za pomocą którego EGF jest głównie regulowany w dół i endocytozywany. Typowe oszacowania średniej precyzji wynoszą około 20 nm dla tego typu próbki z granicą precyzji około 45 nm. Należy zauważyć, że ta precyzyjna miara graniczna efektywnej rozdzielczości nie bierze pod uwagę rozmiaru etykiety ani jakiegokolwiek dryfu, który może być zmierzony za pomocą znaczników odniesienia, ale nadal jest zauważalny przez "warkocze komety" na gromadach lub przy użyciu funkcji śledzenia pudełek, jak opisano na rysunku 6 i opisano w sekcji 8 protokołu.

składnik Stężenie końcowe Katalazy 1 μg/ml (50 jednostek) glukoza 40 mg/ml Oksydaza glukozowa 50 μg/ml gliceryna 12,50% Kcl 1,25 mM MEA-HCl 100 mM Protokół TCEP 200 μM Tris 1 mM

Tabela 3. Bufor przełączający

Typowe ustawienia akwizycji wartość Rozmiar piksela (nm) 160 szt. Czas naświetlania (ms) 10 korzyść 200 szt. Rozmiar klatki (piksele) Wymiary: 128 x 128 Czas cyklu (kl./s) 52,5 pkt. Numer klatki 10 000 szt. Gęstość mocy lasera 640 nm (kW/cm²) cyfra arabska

Tabela 4. Ustawienia pozyskiwania

Rysunek 1. Rekonstrukcja obrazu STORM za pomocą burzy. (A) Otwieranie rainSTORM z poziomu MATLAB. (B) graficzny interfejs użytkownika (GUI) rainSTORM. (C) Graficzny interfejs użytkownika recenzenta rainSTORM. (D) Dostosuj okno kontrastu. (E) Obraz STORM po przejrzeniu i regulacji kontrastu. (F) Histogramy wskaźników jakości obrazu. (G) Pliki wygenerowane po naciśnięciu przycisku zapisz obraz w graficznym interfejsie użytkownika recenzenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. (A) Obrazy z ograniczoną dyfrakcją (DL) pokazują różne stężenia dekstranu przed obrazowaniem STORM. Rekonstrukcje obrazu o wysokiej rozdzielczości (SR) mają rozmiar piksela 25 nm. Zebrano 10 000 obrazów o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli i pokazano poszczególne klatki z tej sekwencji (2 000, 5 000, 8 000). Zarejestrowane z czasem naświetlania 10 ms przy 52,5 klatkach na sekundę. Obrazy mają rozmiar piksela 160 nm. Aby zapewnić przejrzystość obrazu, zastosowano poprawę kontrastu nasycenia pikseli o 0,1% za pomocą ImageJ. Średnia precyzja oszacowania wynoszą 28 nm (wysoka), 24 nm (średnia) i 16 nm (niska) dla różnych obrazów dekstranu. Gęstości lokalizacji wynoszą 724 /^μm2 (wysoka), 526/^μm2 (średnia) i 13/^μm2 (niska). (B) Wykres przedstawiający średnio trzy sekwencje klatek po 10 000 dla każdego stężenia dekstranu. Słupki błędów pokazują odchylenie standardowe. (C) Wykres przedstawiający liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę przy użyciu średniej kroczącej ze 100 klatek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Niska jakość danych dotyczących dekstranu. (A) Klatka ograniczona dyfrakcją z sekwencji STORM zawierającej 15 000 klatek. Zwróć uwagę na rozproszoną fluorescencyjną mgłę na obrazie. Jest to spowodowane dyfuzją fluoroforów przez pożywkę. Rozmiar klatki 128 x 128 pikseli, czas naświetlania 10 ms i szybkość 52,5 klatek na sekundę. (B) Taki sam jak (A) po zmianie bufora. Zwróć uwagę na poprawę kontrastu, ponieważ niezwiązane fluorofory zostały wypłukane. (C) Rekonstrukcja obrazu w superrozdzielczości odpowiadająca danym zebranym w lit. A). Identyczny rozmiar obrazu, ale z pikselami 25 nm. Średnia oszacowana precyzja wynosi 35 nm. (D) Rekonstrukcja obrazu w superrozdzielczości odpowiadająca danym zebranym w (B). Identyczny rozmiar obrazu, ale z pikselami 25 nm. Średnia oszacowana precyzja wynosi 30 nm. (E) Wykres przedstawiający liczbę akceptowanych lokalizacji na klatkę przy użyciu średniej kroczącej ze 100 klatek. Czerwona linia odpowiada sekwencji STORM (A i C), w której występuje wysokie tło. Niebieska linia pokazuje dane odpowiadające (B i D), gdzie tło jest niskie. (F) Wykres przedstawiający akceptowany numer lokalizacji dla obrazów odpowiadających wysokim (C) i niskim (D) danym tła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Typowe dane aktynowe. (AC) Obrazy włókien aktynowych z ograniczoną dyfrakcją przed dodaniem bufora przełączającego i obrazowania STORM. Widoczne są różne długości włókien. Bardzo jasne włókna to często kilka splątanych ze sobą włókien. Rozmiar piksela to 160 nm. (D) Ograniczony dyfrakcją obraz pojedynczego włókna aktynowego. (E) Obraz STORM (poprawa kontrastu o 0,1% zastosowana w ImageJ). Z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagraniach z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela wynosi 16 nm. Średnia oszacowana precyzja wynosi 16 nm. (F) Wykres przedstawiający liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę, przy użyciu średniej kroczącej ze 100 klatek. (G) Powiększony obszar filamentu aktynowego z (E) przed wzmocnieniem kontrastu z narysowanym w poprzek profilem żółtej linii. (H) Widok profilu wykresu z żółtej linii narysowanej w poprzek włókna aktynowego. Wygenerowane w ImageJ. (I) Pasowanie gaussowskie profilu wykresu za pomocą narzędzia do dopasowywania krzywych w ImageJ. Odchylenie standardowe, d, pomnożono przez 2,35, aby uzyskać pomiar FWHM 43,2 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Błędnie zlokalizowane filamenty aktynowe. (A) Filament aktynowy o ograniczonej dyfrakcji. Piksele 160 nm. (B) Obraz STORM filamentu aktynowego pokazany w (A). Z sekwencji 20 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagraniach z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 16 nm. Wszystkie 20 000 klatek zostało przetworzonych. Średnia oszacowana precyzja wynosi 17 nm. (C) Jak (B), ale z przetworzonymi tylko pierwszymi 5000 klatek z 20 000 klatek. Średnia oszacowana precyzja wynosi 18 nm. (D) Jak (B), ale z przetworzonymi tylko ostatnimi 5 000 klatek z 20 000 klatek. Średnia oszacowana precyzja wynosi 17 nm. (E) Wykres lokalizacji dla poszczególnych danych klatki z pełnego widoku klatki 128 x 128 pikseli.

Rysunek 6. Dryf boczny. (A) Obraz STORM filamentu aktynowego zrekonstruowany z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze klatki 64 x 64 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i wykonany z prędkością 64,6 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 32 nm. Średnia oszacowana precyzja wynosi 32 nm. (B) Obraz burzy wyświetlany za pomocą funkcji "Śledzenie pudełek" w rainSTORM. Lokalizacje są wyświetlane z kolorem odpowiadającym numerowi klatki, w której zostały pozyskane, na przykład lokalizacje z początku sekwencji akwizycji są niebieskie; Lokalizacje z późnej sekwencji akwizycji są oznaczone kolorem czerwonym. Przemieszczone kolory wskazują, że nastąpiło przemieszczenie. (C) Powiększony obszar (A) wyświetlany za pomocą funkcji śledzenia pudełek w rainSTORM. Przemieszczone kolory wskazują, że wystąpił dryf. (D) Ograniczony dyfrakcyjnie obraz czterech koralików fluorescencyjnych o długości fali 100 nm, które mogą być używane jako znaczniki odniesienia. Rozmiar piksela 160 nm. Numery 1-4 pokazują przycięte i powiększone koraliki pojedynczo. (E) Każdy koralik fluorescencyjny odpowiadający (D) zrekonstruowany w rainSTORM z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i uzyskanych z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 5 nm. Średnia oszacowana precyzja wynosi 7 nm. (F) Koraliki odpowiadające (D) i (E), wyświetlane za pomocą funkcji "Śledzenie pudełek". Przemieszczone kolory wskazują, że wystąpił dryf. (G) Używając koralika o numerze 2 jako odniesienia, koraliki 1, 3 i 4 są wyświetlane po użyciu funkcji "Odejmij dryf" w rainSTORM. Porównanie z (E) pokazuje, że dryft poprzeczny został skorygowany. Rozmiar piksela STORM wynosi 5 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 7. Typowe dane EFG. (A) Ograniczony dyfrakcją obraz części komórki HeLa skupiony na powierzchni komórki podstawnej. Żółte pola wskazują powiększone obszary zainteresowania pokazane w (B) i (C). (B) Powiększony obraz ograniczony dyfrakcją od obszaru w pobliżu krawędzi komórki (ramka B). (C) Powiększony obraz ograniczony dyfrakcją z obszaru pod jądrem (ramka C). (D) Obraz STORM odpowiadający (A). Z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagraniach z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 25 nm. Średnia oszacowanie dokładności wynosi 21 nm. (E) Obraz STORM odpowiadający ramce E (D). (F) Obraz STORM odpowiadający ramce F (D). (G) Lokalizacje dla każdej klatki z (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Filmy 1-4. Filmy odpowiadają rysunkowi 2A z różnymi stężeniami dekstranu: 1 = wysokie, 2 = średnie, 3 = niskie, 4 = brak). 10 000 sekwencji klatek o rozmiarach 128 x 128 pikseli, uzyskanych z czasem naświetlania 10 ms przy 52,5 klatkach na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 1, video 2, video 3, video 4

Filmy 5-6. Filmy odpowiadają Rys. 3 A i B. Film 5 to pranie wstępne, a Film 6 to pranie po praniu po usunięciu niezwiązanych fluoroforów. 15 000 sekwencji klatek przy rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 5, video 6.

Wideo 7. Film przedstawiający sekwencję nieprzetworzonych klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na rysunku 4E. Sekwencja 10 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagraniach z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 7.

Wideo 8. Film przedstawiający sekwencję nieprzetworzonych klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na rysunku 5B. Sekwencja 20 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagrana z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 8.

Wideo 9. Film przedstawiający sekwencję nieprzetworzonych klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na rysunku 6A. Sekwencja 10 000 klatek o rozmiarze klatki 64 x 64 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagrana z prędkością 64,6 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 9.

Wideo 10. Film przedstawiający sekwencję nieprzetworzonych klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na rysunku 7D. Sekwencja 10 000 klatek o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 ms i nagraniach z prędkością 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film 10.

Discussion

Pokazujemy, że za pomocą kilku prostych próbek testowych i ogólnodostępnego oprogramowania do przetwarzania rainSTORM możliwa jest optymalizacja obrazowania w superrozdzielczości STORM. Te narzędzia i metody zapewnią użyteczne punkty wyjścia dla nowych użytkowników oraz sposoby dla doświadczonych użytkowników na zwiększenie zaufania do swoich mikroskopów i ich wykorzystania do badania struktur biologicznych i komórkowych z niespotykaną dotąd szczegółowością. Wykorzystując kombinację próbek o znanych lub dobrze poznanych strukturach oraz algorytm, który może wygenerować szereg użytecznych wskaźników jakości obrazu, takich jak oszacowania średniej precyzji, liczba lokalizacji i histogramy, można poprawić jakość obrazu i mieć większe zaufanie do procesu obrazowania STORM. Nie ma jednego uniwersalnego podejścia do pozyskiwania danych, ponieważ istnieje wiele różnych komercyjnych i samodzielnie zbudowanych konfiguracji mikroskopów, których można użyć. Co więcej, istnieje wiele etapów przygotowania próbki i akwizycji obrazu, które mogą mieć wpływ na ostateczny obraz, dlatego posiadanie narzędzi programowych i próbek testowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i optymalizacji jakości obrazu STORM.

Ponadto protokoły te mogą zapewnić przydatne i mniej niejednoznaczne sposoby rozwiązywania wszelkich problemów, które mogą się pojawić. Na przykład próbka dekstranu jest bardzo przydatnym sposobem określenia, czy występuje niewspółosiowość wiązki laserowej lub nierównomierne oświetlenie próbki. Jeśli istnieją obawy, że bufor przełączający może nie działać, pomocny będzie bardzo prosty test wizualny, aby sprawdzić, czy jest jakieś "mruganie". Filamenty aktynowe są użytecznym sposobem pomiaru rozdzielczości za pomocą porównań FWHM, a także podkreślania artefaktów dryfu i błędnej lokalizacji. Należy jednak zauważyć, że ponieważ metody superrozdzielczości oparte na lokalizacji mogą być wrażliwe na gęstość fluoroforu, niezależnie od innych czynników, takich jak czasy ekspozycji, liczba klatek na sekundę, moc lasera i sposób przetwarzania obrazu, niemożliwe jest przypisanie rozdzielczości do konkretnego mikroskopu i założenie, że wszystkie obrazy będą miały tę rozdzielczość. Możliwe jest jednak zmierzenie różnych aspektów rozdzielczości, takich jak średnia precyzja lokalizacji, liczba lokalizacji i dryf ²⁷. Nawet jeśli markery odniesienia nie mogą być włączone do każdego eksperymentu, można je przynajmniej wykorzystać do scharakteryzowania systemu mikroskopowego, jego środowiska i lepszego zrozumienia kwestii operacyjnych, takich jak czas potrzebny do osiągnięcia równowagi termicznej po uruchomieniu. Oprócz korekcji dryfu bocznego, markery odniesienia mogą być używane do charakteryzowania i korygowania dryfu osiowego, chociaż wymaga to użycia soczewki astygmatycznej i mechanizmu sprzężenia zwrotnego w celu skorygowania pozycji próbki podczas pozyskiwania obrazów ⁴³. Komercyjne systemy super-resolution zwykle zawierają jakiś rodzaj kontroli stabilności lub mechanizmu blokady ostrości, który może być bardziej praktycznym rozwiązaniem do korekcji dryfu ostrości.

Istnieją alternatywy dla niespecyficznego powlekania szkła dekstranem, takie jak bezpośrednie stosowanie barwników lub innych sprzężonych cząsteczek, takich jak przeciwciała drugorzędowe. Ograniczeniem tych podejść jest to, że liczba cząsteczek związanych ze szkłem nie jest znana. Alternatywne struktury nitkowate, które zostały użyte, obejmują mikrotubule ²⁸ i DNA²¹. Jednak połączenie bardzo małych rozmiarów i wygodnych dostępnych na rynku odczynników sprawia, że aktyna jest atrakcyjną alternatywą, zwłaszcza że odległość separacji rozbieżnych lub rozgałęzionych włókien może być również użytecznym pomiarem wydajności systemu ²⁷.

Jest miejsce na dalszy rozwój próbek testowych, pomimo ostatnich postępów w tej dziedzinie ^28,29,46,47. W szczególności obrazowanie wielokolorowe wiąże się z szeregiem wyzwań we wszystkich 3 głównych aspektach obrazowania, etykietowaniu próbek, pozyskiwaniu obrazu (sprzęt) i oprogramowaniu (przetwarzanie i wyrównywanie obrazu). Powstało wiele publikacji poświęconych tym aspektom ^4-6 i dlatego jasne jest, że odpowiednie próbki testowe i metodologie mają kluczowe znaczenie dla generowania i wiarygodnej interpretacji tego typu obrazów. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że dSTORM może być używany do wykonania dwóch kolorowych obrazów i rozdzielczości wysoce symetrycznej natury kompleksu porów jądrowych, a autorzy zasugerowali, że byłby to idealny sposób oceny wydajności korekcji aberracji chromatycznej ⁴⁵. Innym interesującym podejściem jest wykorzystanie origami DNA do stworzenia nanolinijki, która stwarza możliwość pozycjonowania fluoroforów w określonych odległościach od siebie pod dyfrakcją ⁴⁶. Zapewnia to sposób oceny rozdzielczości i wykonywania pomiarów odległości. Jednak ostatecznym celem jest zastosowanie tych technik superrozdzielczości do niewyidealizowanych próbek, takich jak komórki, które są złożonymi strukturami trójwymiarowymi. W takim przypadku połączenie dokładniejszego zrozumienia techniki w połączeniu z narzędziami programowymi, które pomagają użytkownikowi w pozyskiwaniu danych, przetwarzaniu ich w odpowiedni sposób i dostarczaniu metryk obrazu, prawdopodobnie będzie ostateczną odpowiedzią. ^28,29,47,48

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkło komorowe Labtek Imaging	Fisher	CBR-166-390E	Przygotowanie próbki
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX71	* Poniżej znajdują się alternatywy
Obiektyw 100 X TIRF	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* Poniżej znajdują się alternatywy
Kamera EMCCD	ior	iXon 897	* Poniżej znajdują się alternatywy
Laser	640 nmToptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - do obrazowania barwników Alexa 647 lub Cy5
LabVIEW	National Instruments		*Oprogramowanie akwizycyjne (sprzęt sterujący)
PC	Dell		Windows XP (64 bit), procesor Intel Xeon E5420, 16 GB RAM *Sterowanie instrumentem i przetwarzanie obrazu
ImageJ			Analiza i przetwarzanie obrazu http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	Laser Analytics Group (Cambridge) software		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Przykład samodzielnie zbudowanych mikroskopów			Zobacz także odnośnik 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Komercyjne mikroskopy			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (lokalizacja Monet) Alternatywy dla samodzielnie zbudowanych mikroskopów
Tabela 1. Materiały i Sprzęt
[nagłówek]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poli-L-Lizyna	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
Ogólny bufor aktynowy	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Filamenty wstępnie uformowane aktyny	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
Mikrosfery TetraSpeck (0,1 mikrona)	Invitrogen	T-7279	3.1
Komórki HeLa	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pióro/Krok	Invitrogen	15070063	4.1
Naczynia plastikowe	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldehyd - 10 % roztwór klasy EM	Polysciences	04018-1	4.2
Katalaza	Sigma	C100	5.1
Oksydaza glukozowa	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glukoza	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Gliceryna	Sigma	G2289	5.1; 5.2
Odczynniki Tabela 2.