Opisujemy przygotowanie trzech próbek testowych i jak można je wykorzystać do optymalizacji i oceny wydajności mikroskopów STORM. Na tych przykładach pokazujemy, jak pozyskiwać surowe dane, a następnie przetwarzać je w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w komórkach o rozdzielczości około 30-50 nm.
Artykuł metodologiczny
Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
STORM to niedawno opracowana technika mikroskopii superrozdzielczej o rozdzielczości do 10 razy lepszej niż standardowe techniki mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ jednak obraz jest pozyskiwany w zupełnie inny sposób niż normalnie, poprzez budowanie obrazu cząsteczka po cząsteczce, istnieją pewne poważne wyzwania dla użytkowników w próbie optymalizacji pozyskiwania obrazu. Aby wspomóc ten proces i uzyskać lepszy wgląd w działanie STORM, przedstawiamy przygotowanie 3 próbek testowych oraz metodykę pozyskiwania i przetwarzania obrazów STORM w superrozdzielczości o typowych rozdzielczościach w zakresie 30-50 nm. Łącząc próbki testowe z wykorzystaniem ogólnodostępnego oprogramowania do przetwarzania rainSTORM, możliwe jest uzyskanie wielu informacji na temat jakości i rozdzielczości obrazu. Korzystając z tych wskaźników, można zoptymalizować procedurę obrazowania, począwszy od optyki, poprzez przygotowanie próbki, wybór barwnika, warunki buforowania, aż po ustawienia akwizycji obrazu. Pokazujemy również przykłady niektórych typowych problemów, które skutkują niską jakością obrazu, takich jak dryf boczny, w którym próbka porusza się podczas akwizycji obrazu, oraz problemy związane z gęstością powodujące zjawisko "błędnej lokalizacji".
Wprowadzenie
Ostatnio rozwinięto szereg technik mikroskopii optycznej, zwykle określanych jako mikroskopia superrozdzielcza lub nanoskopia, które mogą ominąć limit dyfrakcji i generować obrazy o rozdzielczości 100 nm lub lepszej 1,2 . Od czasu ogłoszenia w 2008 r. mikroskopii superrozdzielczej jako metody roku w Nature Methods, nastąpił znaczny rozwój mikroskopów opartych na lokalizacji. Na przykład istnieją aplikacje wielokolorowe 3-6 , implementacje 3D 7-12, a nawet aplikacje na żywo komórkowe 5,13-17 . Co więcej, w związku z tym, że systemy te są komercjalizowane i obecnie wychodzą z laboratoriów optycznych w ręce biologów komórkowych, prawdopodobnie nastąpi dalszy wzrost ich wykorzystania i zastosowania w kwestiach biomedycznych.
Jedną z gałęzi tej rodziny są metody oparte na lokalizacji, które działają poprzez budowanie obrazu cząsteczka po cząsteczce. W tym celu większość cząsteczek fluorescencyjnych w próbce musi zostać wyłączona, tak aby w danym momencie aktywnych było tylko kilka przestrzennie oddzielonych cząsteczek. Cząsteczki te są następnie szybko włączane i wyłączane, a następnie wykonywanych jest wiele obrazów, dzięki czemu znaczna część populacji jest obrazowana w celu odzwierciedlenia podstawowej struktury z precyzją subdyfrakcyjną. Opublikowano szereg podejść, w tym GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 i RESOLFT 22. Algorytmy, które mierzą pozycję wykrywania pojedynczej cząsteczki, mogą być następnie wykorzystane do zlokalizowania rzeczywistej pozycji cząsteczki z precyzją lepszą niż 20 nm przy użyciu dopasowania Gaussa23, na przykład rapidSTORM 24,25, QuickPALM 26, palm3d 12 i rainSTORM27. Podczas obrazowania komórek lub innych próbek biologicznych, które mają dużą gęstość cząsteczek, konieczne jest zatem pobranie wielu tysięcy klatek tego, przestrzennie oddzielonego sygnału w celu zobrazowania znacznej części znakowanych cząsteczek.
Stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM) oraz wysoce powiązane metody dSTORM i GSDIM są metodami super-rozdzielczości opartymi na lokalizacji, które okazały się działać z dostępnymi na rynku barwnikami organicznymi 21. Od tego czasu wykazano, że mają one zastosowanie do wielu różnych barwników 28-30, co czyni tę metodologię szczególnie atrakcyjną ze względu na specyficzność i względną wygodę dobrze ugruntowanych podejść do znakowania immunologicznego w celu przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej. W związku z tym istnieje łatwy dostęp do szeregu koniugatów barwnik-przeciwciało i barwnik-biomolekuła, które mogą być potencjalnie wykorzystane w obrazowaniu superrozdzielczym opartym na lokalizacji. Podczas gdy ogólne zasady STORM i podobne podejścia są stosunkowo proste, a sprzęt i przygotowanie próbek na pierwszy rzut oka wydają się stosunkowo proste, istnieje wiele etapów w procesie, które mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości, wolnych od artefaktów obrazów w superrozdzielczości.
Podobnie jak w przypadku wszystkich technik mikroskopowych, proces ten można podzielić na 3 główne etapy: po pierwsze, przygotowanie próbki, po drugie, akwizycja obrazu, a po trzecie, przetwarzanie obrazu i/lub analiza i interpretacja obrazu. Dodatkowa zdolność rozdzielcza i metoda generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości przy użyciu podejścia opartego na lokalizacji wprowadza pewne nowe problemy i rozważania 31-33. Począwszy od przygotowania próbki, podczas wykonywania znakowania immunologicznego, w szczególności immunofluorescencji pośredniej, w której stosuje się kombinację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, należy zauważyć, że barwnik fluorescencyjny może znajdować się w odległości do 20 nm od cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku mikrotubul daje to średnice 35-50 nm w porównaniu z oczekiwaną średnicą mikrotubul 25 nm 28,30 . Ponadto gęstość etykietowania powinna spełniać kryteria Nyquista, aby uzyskać obraz wysokiej jakości 14. Na przykład, aby uzyskać przewidywaną rozdzielczość obrazu 20 nm wzdłuż struktury nitkowatej, cząsteczka barwnika powinna znajdować się co najmniej co 10 nm 27. Chociaż opublikowano wiele barwników, które działają w podejściach opartych na lokalizacji, ogólna wydajność barwnika jest mieszanką co najmniej czterech ważnych kryteriów, a mianowicie wykrytych fotonów na zdarzenie przełączające (jasność każdego mrugnięcia - im jaśniejsza jest lepsza), cykl pracy równowagi on-off (współczynnik kontrastu barwników w stanie wyłączonym i włączonym - więcej wyłączonego jest generalnie lepsze), frakcja przeżycia (niski wskaźnik bielenia jest lepszy) i liczba cykli przełączania (liczba mrugnięć na fluorofor - więcej jest lepsze dla wysokiej rozdzielczości, chociaż 1 mrugnięcie na fluorofor może być zaletą do celów liczenia cząsteczek). Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że właściwości te dla danego barwnika mogą się różnić w różnych warunkach buforowych i przy mocy lasera 28,29 . Ponadto, oprócz tych unikalnych rozważań STORM, jakość obrazu można poprawić, optymalizując przygotowanie próbki w taki sam sposób, jak w przypadku bardziej tradycyjnych technik mikroskopii fluorescencyjnej, na przykład minimalizując autofluorescencję poprzez modyfikację warunków utrwalania i stosowanie odczynników hartujących. Ważne jest również zminimalizowanie niespecyficznie związanych fluoroforów, co można osiągnąć poprzez dostosowanie stężeń etykiety, czasu inkubacji oraz etapów blokowania i mycia.
Drugi krok pozyskiwania obrazów jest również krytyczny. Optymalne ustawienia mikroskopu będą zależeć od barwnika, warunków buforowania, gęstości etykietowania i rodzaju próbki, np. monowarstwy na szkle, komórkach lub próbkach tkanek. Główne czynniki to czas naświetlania aparatu, liczba klatek, kąt oświetlenia (TIRF, HILO, Epi) i moc lasera. Celem jest jak najszybsze zebranie jak największej liczby jasnych, przestrzennie oddzielonych od siebie mrugnięć. Jeśli tło jest bardzo wysokie lub mrugnięcia nie są zbyt jasne, innymi słowy, stosunek sygnału do szumu jest słaby, algorytm rekonstrukcji nie będzie w stanie zlokalizować pozycji tak dokładnie. Oprócz maksymalizacji precyzji lokalizacji, tj. można zmierzyć dokładność pomiaru każdej cząsteczki, jakość obrazu zależy również od dużej liczby lokalizacji. Jeśli zobrazowana zostanie niewystarczająca liczba interesujących nas cząsteczek, czy to z powodu słabej skuteczności znakowania, nadmiernego fotowybielania, czy nieodpowiedniej liczby klatek, wówczas wynikowy obraz o wysokiej rozdzielczości będzie punktowy i nieciągły, ponieważ kryteria Nyquista nie zostaną spełnione 14,27.
I na koniec, trzeci krok, przetwarzanie obrazu, jest szczególnie ważny w porównaniu ze standardowymi technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Istnieje szereg swobodnie i komercyjnie dostępnych algorytmów, co jest zarówno zaletą, jeśli chodzi o wybór, jak i wadą, ponieważ ustalenie, który z nich jest najbardziej odpowiedni do użycia, może być mylące. Jeśli na przykład surowe dane mają dobrze rozmieszczone, przestrzennie odrębne mrugnięcia, algorytm dopasowania pojedynczej cząsteczki może być bardzo dokładny i wydajny, na przykład dzięki algorytmom rzadkiego dopasowania dostępnym w oprogramowaniu rainSTORM 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 i QuickPALM 26. Jeśli surowe dane zawierają wiele nakładających się na siebie sygnałów, algorytmy, które mogą być bardziej odpowiednie, obejmują DAOSTORM 34, 3B 35 i deconSTORM 36. Co więcej, algorytmy te zawierają progi dla różnych kryteriów, takich jak liczba sygnałów lub fotony na mignięcie, a także różne opcje wyświetlania obrazu, takie jak wizualizacja z wygładzonymi funkcjami Gaussa lub jako histogramy z siatkami pikseli, gdzie rozmiar piksela o superrozdzielczości może być wybrany przez użytkownika. Wszystkie te opcje zmieniają wygląd końcowego obrazu i mają wpływ na interpretację i analizę obrazu.
Dlatego prezentujemy 3 próbki testowe, które zapewnią nowemu użytkownikowi punkt wyjścia do eksperymentów z lokalizacją opartą na barwnikach, które dla jasności będziemy nazywać STORM, a bardziej doświadczonym użytkownikom możliwość dalszej optymalizacji swoich eksperymentów. Po pierwsze, możliwe jest pokrycie powierzchni szkła fluorescencyjną warstwą sprzężonego dekstranu i barwnika. Zapewnia to szybki i prosty sposób na ustalenie, czy mikroskop, barwnik i bufor działają w celu wygenerowania sygnału fluorescencyjnego. Metodę tę można następnie rozszerzyć, porównując średnią precyzję lokalizacji i wskaźniki liczbowe generowane przez rainSTORM w celu optymalizacji warunków buforowania, ustawień akwizycji obrazu i testowania różnych barwników. Po drugie, przedstawiamy prosty protokół przygotowania filamentów aktynowych na szkle, które można łatwo znakować za pomocą koniugatów falloidyna-barwnik. Zapewniają one idealne struktury do wykonywania pomiarów rozdzielczości 27 i zazwyczaj pełna szerokość połowy maksimum (FWHM) żarnika jest podawana jako empiryczne oszacowanie rozdzielczości 37. Należy zauważyć, że rozdzielczość różni się między próbkami i między obrazami w tej samej próbce, ponieważ rozdzielczość w mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji jest funkcją jasności fluoroforu, szumu tła i gęstości lokalizacji 27 i niekoniecznie są one stałe w całej próbce. Filamenty aktynowe są używane do demonstrowania potencjalnych artefaktów, takich jak błędne lokalizacje i dryf, oraz sposobu ich identyfikacji za pomocą funkcji oprogramowania w rainSTORM. Ponadto opisujemy zastosowanie fluorescencyjnych markerów odniesienia zarówno do pomiaru, jak i korygowania dryfu. Po trzecie, opisano barwienie komórek koniugatami naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)-barwnik. EGF stanowi użyteczny wskaźnik wydajności obrazu o wysokiej rozdzielczości, ponieważ część receptora na powierzchni komórki ulega endocytozie za pośrednictwem pęcherzyków, które są strukturami o rozmiarach subdyfrakcyjnych o średnicy około 50-150 nm 27,38,39 .
Protokół
Uwaga: W całym tym protokole, wskazówki i sugestie znajdują się po wykonaniu pewnych kroków. Notacja "*1" wskazuje, że uwaga 1 jest istotna dla tego konkretnego kroku i tak dalej.
1. Fluorescencyjna powłoka dekstranowa szkła
- Dodać 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka 8-komorowego szkła nakrywkowego i inkubować przez 10 minut. Usunąć pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał płyn.
- Rozpuść dextran-Alexa 647*1 zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml. Na tej podstawie rozcieńczyć 0,25 μl w 25 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór o stężeniu 20 μg/ml.
- Aby utworzyć powłokę o dużej gęstości z roztworu dextran-Alexa 647, rozcieńczyć 20 μl roztworu 20 μg/ml w sumie 200 μl wody dejonizowanej. W przypadku roztworu o średniej gęstości rozcieńczyć 2 μl w 200 μl wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1:10 000 od oryginalnego roztworu podstawowego). W przypadku roztworu o małej gęstości rozcieńczyć 0,2 μl w 200 μl wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1:100 000 od oryginalnego roztworu podstawowego).
- Dodać 200 μl rozcieńczonych roztworów dekstranu-Alexa 647 do każdego dołka i inkubować przez 10 minut. Można zastosować dłuższy czas inkubacji, co może skutkować gęstszą powłoką dekstranu. Wyjmij i umyj trzykrotnieH2O*2
Uwaga 1: Można używać innych koniugatów dektran-barwnik. Niesprzężony dekstran może być również sprzężony z barwnikami, jeśli pożądane kombinacje nie są dostępne na rynku.
Uwaga 2: Te same komory dekstranowe mogą być ponownie zobrazowane w ciągu kilku tygodni, chociaż jednorodność fluorescencji może się zmniejszyć. Zaleca się przechowywanie w temperaturze 4 °C przy braku bufora.
2. Fluorescencyjne filamenty aktynowe na szkle
- Dodać 200 μl 0,01% roztworu poli-L-lizyny do każdego dołka komory i inkubować przez 10 minut*3. Usuń pipetą, aby upewnić się, że nie pozostał żaden płyn.
- Do każdej komory dodać 90 μl ogólnego buforu aktynowego (rozpuszczonego zgodnie z instrukcjami producenta). Dodać 10 μl 10 μM wstępnie uformowanego roztworu filamentu aktynowego i 1 μl falloidyny-Alexa 647 (0,2 jednostki, po rozpuszczeniu w 1,5 ml metanolu zgodnie z instrukcjami producenta) i delikatnie pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Inkubować przez 30 minut*4.
Uwaga 3: Zwiększenie objętości roztworu filamentu w komorze powoduje zmniejszenie liczby włókien wiążących się ze szkłem pokrytym poli-L-lizyną.
Uwaga 4: Czas inkubacji do 48 godzin w temperaturze 4 °C został przetestowany z dobrymi wynikami. Jakość obrazu filamentu aktynowego pogarsza się, gdy komora została wystawiona na działanie bufora przełączającego, dlatego nie zaleca się używania tej samej próbki dłużej niż jeden dzień.
3. Mikrosferyczne koraliki fluorescencyjne jako znaczniki referencyjne
- Rozcieńczyć 1 μl kulek TetraSpeck w 200 μl PBS i wymieszać.
- Dodaj rozcieńczone kulki do komory obrazowania i odczekaj 15 minut*5. Usunąć roztwór i przemyć 3 razy PBS przed obrazowaniem.
Uwaga 5 - czas rozcieńczania i inkubacji można dostosować do różnych gęstości koralików. Protokół ten zwykle daje od 3 do 10 kulek na pole widzenia 20,5 μm x 20,5 μm.
4. Barwienie komórek naskórkowego czynnika wzrostu
- Hodowla komórek HeLa w komorach obrazowania do około 80% zbiegu w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny i streptomycyny.
- Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć PBS. Następnie dodać 500 μl 4% roztworu formaldehydu (4 ml 10% roztworu formaldehydu, 1 ml 10X PBS, 5 ml wody) przez 10 min. Usuń formaldehyd i przemyj 3 razy PBS. Nie pozwól, aby komórki pozostały suche i zawsze używaj roztworów buforowanych PBS, aby uniknąć stresu hipotonicznego.
UWAGA - formaldehyd jest niezwykle toksyczny. Upewnij się, że noszone są odpowiednie rękawice, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne. Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi usuwania formaldehydu.
- Rozpuść EGF-Alexa 647 zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 μg/ml. Dodać 2 μl tego roztworu podstawowego do 200 μl 0,1% roztworu BSA (w PBS). Usunąć PBS z komórek, dodać roztwór EGF i inkubować przez 30 minut.
- Usunąć roztwór i przemyć 3 razy PBS przed dodaniem roztworu blokującego 0,1% BSA (w PBS) przez 15 minut. Usunąć go i przemyć kolejne 3 razy PBS przed obrazowaniem.
5. Przygotowanie bufora przełączającego
- Przygotować roztwór podstawowy enzymu (A) z 10 μl katalazy (20 μg/ml), 20 μl 1 M chlorowodorku fosfiny Tris (2-karboksyeltylu) (4 mM), 2,5 ml gliceryny (50%), 125 μl 1 M KCl (25 mM), 100 μl 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg oksydazy glukozowej (1 mg / ml) i uzupełnić do 5 ml objętości diH20. Jest to wystarczające do wytworzenia 100 x 50 μl podwielokrotności, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i używane przez okres do 1 roku.
- ) Przygotować podstawowy roztwór glukozy (B) z 4 g glukozy (100 mg/ml), 4 ml gliceryny (10%) i 36 ml diH20. Jest to wystarczające do wytworzenia 100 x 400 μl podwielokrotności, które mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C i używane przez okres do 1 roku.
- Przygotować roztwór podstawowy środka redukującego (C) ze 113,6 mg MEA-HCl (1M) i 1 ml diH20. Użyć świeżych lub przygotować 10 porcji po 100 μl, które można przechowywać w temperaturze -20 °C i używać przez okres do 1 miesiąca (nie zamrażać ponownie porcji).
- Tuż przed obrazowaniem należy zmieszać roztwory podstawowe enzymu (A), glukozy (B) i środka redukującego (C) w proporcjach 50 μl, 400 μl, 100 μl i uzupełnić do 1 ml PBS*6. Ten bufor będzie teraz pochłaniał tlen i będzie miał środowisko redukujące (100 mM MEA-HCl)*7. Końcowe pH powinno mieścić się w zakresie 6,0 - 8,5 (regulacja zwykle nie jest konieczna)*8.
Uwaga 6 - ten bufor jest odpowiedni do stosowania z barwnikami na bazie karbocyjaniny, takimi jak Cy5 i Alexa 647.
Uwaga 7 - końcowe stężenia enzymów wynoszą 50 μg/ml (5 jednostek/ml) oksydazy glukozowej i 1 μg/ml (40-60 jednostek/ml) katalazy. Aktywność enzymatyczna (jednostki) jest podawana przez dostawców i może się różnić. Obliczenia dla katalazy zakładają, że 1 μg/ml stężenia końcowego po kroku 5.4 będzie zawierało 50 jednostek enzymu. Różne kompozycje, w tym podobne składniki pochłaniające tlen, można znaleźć 21,30,40. Podsumowanie kombinacji i barwników znajduje się w piśmiennictwie 28,29. Gliceryna i TCEP są wymagane do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C.
Uwaga 8 - jeśli obrazujesz filamenty aktynowe, dodaj 2 mM MgCl2 i 0,2 mM ATP, aby pomóc ustabilizować filamenty.
6. Akwizycja danych STORM pod mikroskopem (przy użyciu barwnika Alexa 647)
- Włączyć mikroskop STORM/PALM, najlepiej co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem, aby umożliwić osiągnięcie równowagi termicznej. Obrazowanie przed tym ma zwiększoną szansę na dryf.
- Włóż komorę obrazowania do uchwytu na próbkę stolika mikroskopu. Upewnij się, że próbka jest mocno osadzona w uchwycie i jest płaska.
- Wyjmij PBS z komory obrazowania, a następnie napełnij do góry buforem przełączającym. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze komory, upewniając się, że w ogóle nie ma pęcherzyków i że cała komora jest przykryta. Uzupełnij dodatkowym buforem lub PBS, jeśli widoczne są jakiekolwiek bąbelki, w przeciwnym razie wydajność bufora może się pogorszyć.
UWAGA - aby zminimalizować ryzyko poprzecznego i osiowego dryfu próbki w stosunku do soczewki obiektywu, zaleca się, aby próbka i bufor były pozostawione do zrównoważenia do temperatury pokojowej przez co najmniej 15 minut przed obrazowaniem.
- Zlokalizuj interesującą nas strukturę fluorescencyjną, która ma zostać zobrazowana. Wybierz żądany kąt oświetlenia, w tym przypadku zalecany jest TIRF lub kąt bardzo nachylony, ponieważ poprawia to stosunek sygnału do szumu poprzez zminimalizowanie nieostrego światła, co jest szczególnie korzystne w przypadku próbek komórek. Wykonaj referencyjny obraz struktury z ograniczoną dyfrakcją przed obrazowaniem STORM.
- Zwiększ laser wzbudzający (o odpowiedniej długości fali wzbudzenia około 640 nm) do dużej mocy, odpowiadającej około 2 kW/cm2 podczas obrazowania przy ustawieniach kamery 10 ms ekspozycji i czasie cyklu około 50 Hz (klatek na sekundę). Gdy fluorofory przejdą w rzadki wzór mrugania (prawdopodobnie w ciągu 10 sekund w przypadku większości próbek), zbierz 10 000 klatek*9.
Uwaga: 9 - 10 000 ramek jest odpowiednie dla opisywanych tutaj próbek, ale może być konieczne zwiększenie liczby ramek do 50 000 lub więcej dla innych próbek.
7. Rekonstrukcja obrazów o wysokiej rozdzielczości z surowych danych (przy użyciu rainSTORM)
- Otwórz plik rainSTORM.m z poziomu programu MATLAB i uruchom (Rysunek 1A).
- W oknie rainSTORM (Rysunek 1B) wybierz plik obrazu do analizy za pomocą przycisku przeglądania. Powinien to być plik .tif (ImageJ może być używany do konwersji innych typów plików na format tif). Zmień szerokość pikseli, aby dopasować ją do nieprzetworzonych danych systemu mikroskopowego użytego do uzyskania danych*10. Pozostaw inne wartości domyślne.
Uwaga 10 - Typowa kamera EMCCD ma rozmiar piksela 16 μm, więc w systemie z obiektywem 100X rozmiar piksela na obrazie będzie wynosił 160 nm. W systemach komercyjnych rozmiar piksela jest zwykle wyświetlany w oprogramowaniu. Rozmiary pikseli wahają się od 100 nm do 160 nm dla większości mikroskopów lokalizacyjnych.
- Naciśnij przycisk "Przetwarzaj obrazy" i poczekaj, aż pojawi się wstępny obraz. Czas trwania przetwarzania będzie zależał od rozmiaru pliku, specyfikacji komputera i liczby kandydujących mrugnięć w surowych danych*11.
Uwaga: 11 - 10 000 sekwencji klatek danych aktyny i EGF zajęło odpowiednio 23 sekundy i 25 sekund na komputerze z procesorem Intel Xeon E5420. Korzystając z tego samego komputera bez zestawu narzędzi do przetwarzania równoległego w programie MATLAB lub z komputerem bez przetwarzania wielordzeniowego, czasy wynosiły odpowiednio 66 s i 81 s.
- Aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości, naciśnij przycisk "Otwórz recenzenta", a pojawi się drugie okno (Rysunek 1C). Naciśnij przycisk "Dostosuj kontrast", aby zmienić sposób wyświetlania obrazu zgodnie z potrzebami (Rysunek 1D). W niektórych przypadkach, gdy obraz jest bardzo ciemny, wartość maksymalna powinna zostać zmniejszona.
- Użyj okna recenzenta (Rysunek 1C), aby wygenerować przydatne wskaźniki jakości obrazu i jeszcze bardziej udoskonalić obraz w super rozdzielczości. Ustaw pierwsze trzy parametry kontroli jakości na wartości odpowiednio 4 000, 0,1 i 0,8-2,0*12. Zaktualizuj liczbę na wartość fotonu, która powinna być oparta na pomiarze kalibracji fotonów lub przy użyciu wartości krzywej kalibracji krzywej fotonowej określonych przez producenta kamery dla określonego ustawienia wzmocnienia EM. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnej precyzji i rozdzielczości pomiarów*13.
Uwaga 12 - Signal Counts odrzuca mrugnięcia na podstawie kryteriów jasności. Im wyższa wartość, tym jaśniejsze musi być mrugnięcie, aby zostało zaakceptowane jako lokalizacja na końcowym obrazie. Może to wymagać zmiany w zależności od ilości fotonów wytwarzanych przez barwnik oraz czasu ekspozycji i czułości aparatu. Tolerancja odrzuca mrugnięcia, jeśli występuje znaczny błąd kwadratowy między sygnałem a dopasowanym gaussowskim, tj. podwójne szczyty. Zakres PSF Sigma odrzuca mrugnięcia, jeśli dopasowana szerokość PSF wykracza poza ten zakres, tj. węższy zakres może być używany do odrzucania sygnałów nieostrych i dużych zagregowanych plam o stałej fluorescencji. Użycie szerszego zakresu może spowodować pojawienie się artefaktów błędnej lokalizacji na końcowym obrazie. W praktyce zaleca się przeprowadzenie wstępnej kontroli jakości za pomocą parametru odcięcia precyzji lokalizacji.
Uwaga 13 - więcej informacji na temat wskaźników rozdzielczości znajduje się w odnośnikach 23,27. Krótko mówiąc, znając liczbę fotonów wytwarzanych przez każde mrugnięcie, można obliczyć precyzję lokalizacji każdej lokalizacji, a w konsekwencji uzyskać ogólne oszacowania średniej precyzji dla całego obrazu. Używając Andor iXON DU-897E z ustawieniem wzmocnienia 200, wartość zliczeń na foton wynosi 9,04.
- Zmień granicę precyzji lokalizacji (Rysunek 1C), aby dokonać kompromisu między optymalizacją średniej precyzji lokalizacji w stosunku do liczby lokalizacji na końcowym obrazie. Zalecane są wartości 30-50 nm w zależności od jakości danych i próbki. Zarówno histogramy, jak i pliki info.txt mogą być wykorzystane do podjęcia tej decyzji (rysunki 1F i 1G).
- Domyślny współczynnik skali rekonstrukcji (rysunek 1C) wynosi 5, co spowoduje wygenerowanie pikseli o wysokiej rozdzielczości 32 nm, przy założeniu, że szerokość pikseli na oryginalnych obrazach wynosi 160 nm. Jeśli obrazy RAW mają rozmiar piksela 100 nm, uzyska to obrazy o wysokiej rozdzielczości z pikselami 20 nm. Zwiększ współczynnik skali, aby uzyskać mniejsze piksele o wysokiej rozdzielczości na końcowym obrazie*14.
Uwaga 14- Rozdzielczość mikroskopii lokalizacyjnej zależy od wygładzenia wymaganego do wizualizacji (tj. rozmiaru piksela prostej rekonstrukcji histogramu), jak również od precyzji lokalizacji. W praktyce rozmiar piksela rekonstrukcji powinien być na ogół mniejszy niż precyzja lokalizacji (patrz metryka Szacowana średnia precyzja w pliku tekstowym informacji - kroki 6.11 i 6.12). W tym przypadku utrata rozdzielczości spowodowana rekonstrukcją rozmiaru piksela będzie niewielka 23,27. Na przykład średnia precyzja oszacowania w kierunku wiersza i kolumny na rysunku 4E wynoszą 16,1 nm i 16,2 nm. Do wizualizacji tych danych wykorzystano rozmiar piksela 16 nm (współczynnik skali rekonstrukcji 10 przy oryginalnej szerokości piksela 160 nm).
- Zmodyfikuj limit zakresu ramek (Rysunek 1C), aby ograniczyć rekonstrukcję do podzbiorów danych pierwotnych, na przykład [2001-inf] wykluczy początkowe 2000 klatek danych pierwotnych.
- Naciśnij przycisk "Uruchom przeglądarkę" (Rysunek 1C), aby wygenerować zaktualizowany obraz w super rozdzielczości (Rysunek 1E).
- Naciśnij przycisk "Wyświetl histogramy" (Rysunek 1C), aby wyświetlić wskaźniki jakości obrazu (Rysunek 1F)*15.
Uwaga 15 - Wykres w prawym górnym rogu przedstawiający liczbę akceptowanych lokalizacji w stosunku do numeru klatki kamery oraz histogram Precyzji Lokalizacji Thompsona w prawym dolnym rogu (Rysunek 1F) może być użyty do informacji o opcji przeglądu precyzji lokalizacji. Na przykład użycie odcięcia 50 nm wykluczyłoby wszystkie lokalizacje o gorszej precyzji z uwzględnienia w końcowym obrazie o wysokiej rozdzielczości.
- Naciśnij przycisk "Zapisz obraz" w recenzentze (Rysunek 1C), aby zapisać wszystkie te dane*16.
Uwaga 16 - Można zapisać od 3 do 5 plików w zależności od wybranych opcji (suma obrazów, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists), patrz Rysunek 1G. Obraz przetworzony przez STORM jest wyświetlany ze zmodyfikowanymi mapami kontrastu i kolorów. STORMdataImage to obraz w skali szarości, w którym poziom szarości każdego piksela jest równy liczbie lokalizacji, które zostały w nim zidentyfikowane.
- Po przeanalizowaniu danych (np. pliku Info.txt i histogramów) wróć do kroku 7.6 i w razie potrzeby powtórz kolejne kroki z innymi parametrami recenzenta. Naciśnięcie przycisku "Zapisz obraz" w kroku 7.11 spowoduje nadpisanie wcześniej zapisanych danych.
8. Śledzenie pudełek i korekta dryfu (przy użyciu rainSTORM)
- Wykonaj kroki 7.1 - 7.9, aby wygenerować obraz w normalny sposób.
- Naciśnij przycisk "Śledzenie pudełka" w recenzencie (Rysunek 1C), a następnie kliknij i przeciągnij pole na znacznik odniesienia lub strukturę będącą przedmiotem zainteresowania na recenzowanym obrazie.
- Poczekaj, aż pojawi się nowy obraz, na którym zostaną wyświetlone "Pozycje w ramce" (patrz rysunki 6B, 6C i 6F dla przykładów). Zapisz ten obraz, jeśli chcesz.
- Jeśli obiekt zainteresowania jest znacznikiem odniesienia, korektę dryfu można wykonać, klikając przycisk "Ustaw kotwicę", a następnie przycisk "Odejmij dryf". Na koniec ponownie kliknij "Uruchom recenzenta", aby wygenerować nowy obraz STORM, który będzie teraz miał wszystkie lokalizacje poprawione zgodnie z pozycjami znaczników odniesienia. Pozycje ściegów są usuwane z końcowego recenzowanego obrazu.
- Jeśli na końcowym obrazie z korekcją dryfu znajdują się inne znaczniki odniesienia, można je usunąć, naciskając "Śledzenie pola", "Usuń pudełkowe", a następnie "Uruchom recenzenta" tyle razy, ile chcesz.
Wyniki
Dekstran
Prawidłowe powlekanie dekstranem powinno skutkować powstaniem fluorescencyjnej monowarstwy. Przy wysokim stężeniu powinna ona wyglądać na stosunkowo jednorodną. Przy niższych stężeniach będzie wydawać się rzadsza (Rycina 2A). Wiele mikroskopów STORM/PALM umożliwia zmianę kąta oświetlenia z epifluorescencji na TIRF. Podczas korzystania z widoku pełnej klatki kamery, na przykład przy rozdzielczości 512 x 512 pikseli w typowej kamerze EMCCD, powinno być obserwowane równomierne oświetlenie. Występowanie jakichkolwiek pasów lub obszarów poza ogniskowaniem może wskazywać na konieczność ponownego umieszczenia próbki w uchwycie z nową warstwą oleju na soczewce obiektywu. Alternatywnie może to wskazywać na problem z mikroskopem.
Podczas pozyskiwania surowych danych o superrozdzielczości moc lasera obrazującego powinna zostać zwiększona do około 2 kW/cm2. Nastąpi początkowy rozbłysk fluorescencji, po którym wystąpi mruganie (blinking), gdy fluorofory zostaną wprowadzone w tymczasowe stany ciemne. Przy wysokich gęstościach dekstranu rozbłyski prawdopodobnie będą się nakładać, szczególnie na początku akwizycji obrazu (Video 1). Przy gęstościach średnich i niskich rozbłyski te powinny być rzadkie, i.e. oddzielone przestrzennie i w ostrości, bez wyraźnego tła (patrz klatki 2 000, 5 000 i 8 000, Figure 2A, Videos 2 and 3). Podczas tej fazy akwizycji obrazu, przy stałym oświetleniu laserowym, liczba rozbłysków będzie zmniejszać się w czasie (porównaj klatkę 2 000 z klatką 8 000 w próbce o wysokiej gęstości, Figure 2A). Główną różnicą między poszczególnymi obrazami o superrozdzielczości dla różnych stężeń dekstranu (wysokiego, średniego i niskiego) jest malejąca liczba lokalizacji (Figures 2A and 2B). Innymi słowy, stężenie cząsteczek fluorescencyjnych, liczba rozbłysków w surowych danych oraz liczba lokalizacji pozostają w relacji proporcjonalnej. Relacja ta nie jest jednak prostą funkcją liniową, ponieważ przy bardzo wysokich gęstościach cząsteczek oprogramowanie nie jest w stanie pomyślnie zlokalizować cząsteczek (porównaj linie czerwoną i niebieską, Figure 2C). Dzieje się tak dlatego, że przy wysokim stężeniu oprogramowanie przetwarzające nie jest w stanie dopasować pozycji przy użyciu algorytmu dopasowania Gaussa w miejscach, gdzie rozbłyski nie są rzadkie. W miarę jak liczba rozbłysków spada w fazie akwizycji z powodu fotoblaknięcia, oprogramowanie może dopasować coraz więcej z nich, gdy stają się one rzadkie (Figures 2A and 2C). Co więcej, poszczególne cząsteczki barwnika mogą mrugać, a w związku z tym zostać zlokalizowane więcej niż raz 28,41,42.
Powszechnym problemem podczas obrazowania dowolnej z tych próbek, a w szczególności próbki z dekstranem o wysokiej gęstości, może być obecność jasnej, lecz nieostrej fluorescencyjnej mgiełki, która wydaje się gwałtownie rozpraszać podczas fazy akwizycji obrazu STORM. Jest ona odróżnialna od wysokokontrastowych fluoroforów na powierzchni szkła, których mruganie jest widoczne na obrazach (Rysunek 3A, Wideo 5). Można zapobiec obecności tych oderwanych cząsteczek fluorescencyjnych lub je usunąć poprzez zwiększenie liczby etapów płukania PBS przed dodaniem buforu przełączającego lub poprzez dodanie świeżego buforu przełączającego do komory (Rysunek 3B, Wideo 6). Przetwarzanie i porównywanie danych z każdej sekwencji obrazów prowadzi do uzyskania bardzo różnych obrazów o wysokiej rozdzielczości, które charakteryzują się zmniejszeniem zarówno liczby lokalizacji, jak i precyzji, z jaką oprogramowanie do lokalizacji mrugnięć może je dopasować (Rysunki 3C, 3D, 3E i 3F).
Filamenty aktynowe
Wstępnie utworzone filamenty aktyny można zaobserwować przytwierdzone do powierzchni szkła za pomocą obrazowania z rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie (Ryc. 4A-4C). Jeśli liczba filamentów wydaje się bardzo niska, można zastosować dłuższy czas inkubacji lub zmniejszyć objętość roztworu filamentów aktyny. Wybór pojedynczych, stosunkowo jasnych filamentów (Ryc. 4D) zamiast obszarów splątanych pozwala uzyskać obrazy lepszej jakości. Podczas etapu akwizycji wzdłuż długości filamentu powinny być widoczne jasne, będące w ognisku błyski (Wideo 7). Podczas akwizycji powinno być obserwowane rzadkie migotanie, a następnie w przetworzonych danych powinien pojawić się cienki, ciągły filament (Ryc. 4E), natomiast liczba lokalizacji na klatkę powinna wykazywać stopniowy spadek (Ryc. 4F), w przeciwieństwie do Ryc. 3E.
Jeśli migotanie nie jest rzadkie lub jeśli oprogramowanie nie jest w stanie zlokalizować cząsteczek, może wystąpić bardziej subtelny artefakt, zwany błędną lokalizacją 32. Dzieje się tak, gdy oprogramowanie uśrednia pozycję dwóch nakładających się cząsteczek i lokalizacja znajduje się w połowie drogi między nimi. Wskaźnikiem świadczącym o braku znaczącej liczby nakładających się błysków, a w konsekwencji błędnych lokalizacji, jest fakt, że średnie szacunki precyzji powinny być takie same w kierunkach wierszy i kolumn, t.j. poziomo i pionowo; w przypadku wystąpienia błędnych lokalizacji działyby się one wzdłuż filamentu, tworząc większy niż zwykle błysk (t.j. rozproszony na większej liczbie pikseli), co w konsekwencji skutkowałoby mniejszą dokładnością lokalizacji w jednym z kierunków. Jest to najłatwiej zauważyć, gdy w obszarze obrazowania znajduje się pojedynczy filament aktyny ułożony poziomo lub pionowo. W tym przypadku mikroskop STORM osiągnął średnią precyzję 16 nm w obu kierunkach. Przekłada się to na limit precyzji, będący miarą efektywnej rozdzielczości obrazu, wynoszący około 34 nm. Metryki te są dostarczane przez rainSTORM 27, jednak ponieważ mamy do czynienia z strukturą filamentową o jednorodnej średnicy 7 nm z bardzo małym znacznikiem phalloidin-Alexa 647, możemy zmierzyć FWHM, aby oszacować rozdzielczość obrazu. Poprzez wyrysowanie linii prostej przez filament na obrazie super-rozdzielczym w programie ImageJ (Rysunek 4G), z wykorzystaniem funkcji profilu wykresu (Rysunek 4H) i następującym po tym dopasowaniem Gaussa (Rysunek 4I), FWHM obliczono jako 43,2 nm. Przy próbie wykonania tego pomiaru zalecamy, aby rozmiar piksela był zgodny lub nieco mniejszy niż średnia szacowana precyzja obrazu (patrz plik info.txt Rysunek 1G). W tym przypadku do rekonstrukcji obrazu użyto pikseli o rozmiarze 16 nm.
W metodzie STORM mogą wystąpić dwa powiązane problemy, gdy migoczące fluorofory przestają być rzadko rozmieszczone, tzn. pojedyncze cząsteczki w odległości około 250 nm migoczą w tym samym czasie, co prowadzi do nakładania się sygnałów. Pierwszym z nich jest sytuacja, w której w zależności od algorytmu i stosowanych kryteriów kontroli jakości, błyski mogą nie zostać w ogóle zlokalizowane. Skutkuje to obrazami o wysokiej rozdzielczości z niewielką liczbą lokalizacji lub ich całkowitym brakiem. Drugi problem, błędne lokalizacje, występuje, gdy dwa błyski pojawią się wystarczająco blisko siebie, aby sprawiać wrażenie pojedynczego błysku. W takim przypadku pozycja na obrazie końcowym stanowi średnią z dwóch tych punktów. Więcej szczegółów na ten temat znajduje się w referencji 32. W obu przypadkach zjawisko to może wystąpić przy próbkach o bardzo wysokiej gęstości, niewystarczającej mocy lasera lub problemach z buforem przełączającym. Problem ten jest widoczny w miejscach, gdzie liczne filamenty aktynowe rozgałęziają się i/lub krzyżują (Ryciny 5A-D, Wideo 9). Przetwarzając podzbiory klatek i porównując pierwsze oraz ostatnie 5 000 klatek, możemy zaobserwować różnice w otrzymanym obrazie. Na obrazie o wysokiej rozdzielczości z pierwszych 5 000 klatek (Rycina 5C) widać wiele lokalizacji w środkowej części obrazu; jednak przy użyciu ostatnich 5 000 klatek widocznych jest ich bardzo mało i pozostają jedynie filamenty, choć są one nieco nieciągłe ze względu na niską liczbę lokalizacji na obrazie (Rycina 5D). Jeśli podejrzewany jest zbyt wysoki stopień gęstości migotania, porównanie obrazów z danymi o liczbie lokalizacji na klatkę może silnie sugerować występowanie tego problemu; w pierwszym zestawie klatek średnia liczba lokalizacji na klatkę przekracza 10, podczas gdy w ostatnim zestawie wynosi ona około 4 (Rycina 5E). Aby zminimalizować prawdopodobieństwo wystąpienia błędnych lokalizacji, idealnym rozwiązaniem jest uzyskanie jak najmniejszej liczby lokalizacji na klatkę, jednak w przypadku konieczności obrazowania dużej liczby cząsteczek, tzn. dla próbki o wysokiej gęstości, wymaga to zarejestrowania bardzo dużej liczby klatek akwizycyjnych, co prowadzi do innego problemu w mikroskopii STORM, jakim jest dryft.
Dryft boczny – filamenty aktynowe i markery fiducjalne
Dryft występuje, gdy próbka przemieszcza się względem obiektywu w fazie akwizycji danych. Jest to trudne lub niemożliwe do zauważenia podczas etapu pozyskiwania obrazu, szczególnie jeśli przemieszczenie jest boczne, a nie osiowe, lub dopóki nie jest ono specjalnie mierzone, ponieważ w stosunkowo stabilnych systemach mikroskopowych zazwyczaj wynosi ono mniej niż 50 nm w ciągu kilku minut. Jednak w zrekonstruowanych obrazach znanych struktur, takich jak włókna aktynowe o dobrze określonej budowie, można go wykryć na obrazach superrozdzielczych. Pierwszym sygnałem świadczącym o możliwym wystąpieniu dryftu bocznego jest to, że struktura jest większa od oczekiwanej (Rysunek 6A, Wideo 8), na przykład przy stosunkowo dużej wartości FWHM w porównaniu z danymi o granicy precyzji z rainSTORM – w tym przypadku 90 nm w porównaniu z 67 nm. Lepszym sposobem wykrywania dryftu jest jednak porównanie lokalizacji w funkcji czasu, t.j. sprawdzenie, czy lokalizacje w późniejszych klatkach są przesunięte w stosunku do tych w klatkach wczesnych. Można to wyraźnie zaobserwować w przypadku włókien aktynowych, które są bardzo małe i mają jednolitą strukturę, gdy zostaną one wyświetlone z kodowaniem kolorystycznym przy użyciu funkcji śledzenia ramek (box tracking) w rainSTORM (Rysunki 6B i 6C).
Dryft jest powszechnie rozpoznanym problemem i istnieje szereg strategii, które można zastosować w celu jego zminimalizowania 19 lub skorygowania po akwizycji, wykorzystując markery fiducyjne 21,43 lub korelacje wzajemne 44. W celu pomiaru i korekcji dryftu można zastosować fluorescencyjne kulki o średnicy 100 nm jako markery fiducyjne (Rycyna 6D). Ze względu na to, że są one małe i jasne, ich pozycję można dokładnie zmierzyć za pomocą algorytmów dopasowania Gaussa, takich jak rainSTORM. W przykładzie, w którym występuje stosunkowo silny dryft wynoszący około 100 nm w czasie 3 min 10 s podczas fazy akwizycji (Rycina 6E), tę samą funkcję śledzenia w ramce można wykorzystać do kodowania kolorami i potwierdzenia wystąpienia dryftu (Rycina 6F). Ponieważ wszystkie cztery kulki w tym przykładzie wykazują niemal identyczny dryft, można wybrać jedną z nich, w tym przypadku kulkę 2, jako referencyjną i odjąć wartość dryftu od pozostałych kulek (Rycina 6G). Poprzez dodanie markerów fiducyjnych do badanego preparatu biologicznego możliwe staje się mierzenie i korygowanie dowolnego dryftu w przypadkach, gdy struktura podstawowa jest nieznana lub znacznie bardziej zmienna niż filament aktynowy czy fluorescencyjna kulka.
Epidermalny czynnik wzrostu
Na koniec, komórki HeLa barwione na EGF mogą służyć jako realistyczny przykład rozdzielczości obrazowania w komórkach (Rysunek 7A, Wideo 10). Komórki te są stosunkowo łatwe do obrazowania, ponieważ większość fluorescencji EGF powinna znajdować się w płaszczyźnie ogniskowania na powierzchni komórki, w bliskim sąsiedztwie szkiełka podstawowego. Mniej jasny obszar w centrum odpowiada położeniu jądra komórkowego. Oświetlenie TIRF może poprawić jakość obrazu poprzez wyeliminowanie fluorescencji poza ogniskiem, pochodzącej z części błony komórkowej, które nie znajdują się w bliskim sąsiedztwie szkła (penetracja do wnętrza komórek wynosi około 150 nm). Powiększone obszary zainteresowania na obrazie ograniczonym dyfrakcyjnie są zazwyczaj niewyraźne (Rysunki 7B i 7C), jednak na obrazach o superrozdzielczości powinna widnieć mieszanka klastrów oraz sporadycznych, odizolowanych pojedynczych pikseli (Rysunki 7D-7F). Będą one reprezentować albo odizolowane receptory EGF na powierzchni komórki, albo prawdopodobnie niewielką ilość wiązań niespecyficznych. Klastry będą miały średnicę około 100 nm i prawdopodobnie będą odpowiadać tworzącym się wnękom i pęcherzykom – ścieżce, poprzez którą EGF jest głównie regulowany w dół i endocytowany. Typowe szacunki średniej precyzji dla tego rodzaju próbki wynoszą około 20 nm, przy granicy precyzji wynoszącej około 45 nm. Należy zauważyć, że ta miara efektywnej rozdzielczości w postaci granicy precyzji nie uwzględnia rozmiaru znacznika ani żadnego dryfu, który można zmierzyć za pomocą markerów fiducjalnych, ale jest on nadal zauważalny jako „komety” na klastrach lub przy użyciu funkcji śledzenia ramki (box tracking), jak przedstawiono na Rysunku 6 i opisano w sekcji 8 protokołu.
| Komponent | Stężenie końcowe |
| Katalaza | 1 μg/ml (50 jednostek) |
| Glukoza | 40 mg/ml |
| Oksydaza glukozowa | 50 μg/ml |
| Gliceryna | 12.50% |
| KCl | 1,25 mM |
| MEA-HCl | 100 mM |
| TCEP | 200 μM |
| Tris | 1 mM |
Tabela 3. Bufor przełączający
| Typowe ustawienia akwizycji | Wartość |
| Wielkość piksela (nm) | 160 |
| Czas ekspozycji (ms) | 10 |
| Wzmocnienie | 200 |
| Rozmiar klatki (piksele) | 128 x 128 |
| Czas cyklu (kl./s) | 52.5 |
| Numer klatki | 10,000 |
| gęstość mocy lasera 640 nm (kW/cm²).2) | 2 |
Tabela 4. Ustawienia akwizycji
Rycina 1. Rekonstrukcja obrazu STORM przy użyciu rainstorm. (A) Uruchamianie rainSTORM z poziomu MATLAB. (B) Graficzny interfejs użytkownika (GUI) rainSTORM. (C) GUI Reviewer w rainSTORM. (D) Okno regulacji kontrastu. (E) Obraz STORM po weryfikacji i regulacji kontrastu. (F) Histogramy wskaźników jakości obrazu. (G) Pliki wygenerowane po naciśnięciu przycisku zapisu obrazu w GUI Reviewer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycina.
Rycina 2. (A) Obrazy ograniczone dyfrakcją (DL) przedstawiają różne stężenia dekstranu przed obrazowaniem STORM. Rekonstrukcje obrazów o superrozdzielczości (SR) mają rozmiar piksela 25 nm. Zebrano 10 000 obrazów o rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli; pokazano pojedyncze klatki z tej sekwencji (2 000, 5 000, 8 000). Obrazy pozyskano przy czasie ekspozycji 10 msec i szybkości 52,5 klatek na sekundę. Obrazy mają rozmiar piksela 160 nm. Dla przejrzystości obrazu zastosowano wzmocnienie kontrastu z nasyceniem pikseli 0,1% przy użyciu programu ImageJ. Średnie szacunki precyzji wynoszą 28 nm (wysoka), 24 nm (średnia) i 16 nm (niska) dla różnych obrazów dekstranu. Gęstości lokalizacji wynoszą 724 na μm2 (wysoka), 526 na μm2 (średnia) i 13 na um2 (niska). (B) Wykres przedstawiający średnią z trzech sekwencji po 10 000 klatek dla każdego stężenia dekstranu. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. (C) Wykres przedstawiający liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę z wykorzystaniem kroczącej średniej z 100 klatek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.
Rysunek 3. Dane dekstranu o niskiej jakości. (A) Klatka ograniczona dyfrakcją z sekwencji STORM składającej się z 15 000 klatek. Zauważalna jest rozproszona fluorescencyjna mgiełka na całym obrazie. Jest ona spowodowana dyfuzją fluoroforów w medium. Rozmiar klatki 128 x 128 pikseli, czas ekspozycji 10 msec, akwizycja przy 52,5 klatkach na sekundę. (B) Obraz analogiczny do (A) po wymianie buforu. Zauważalna jest poprawa kontrastu dzięki wypłukaniu niezwiązanych fluoroforów. (C) Rekonstrukcja obrazu w superrozdzielczości odpowiadająca danym zebranym w (A). Taki sam rozmiar obrazu, ale z pikselami o wielkości 25 nm. Średnia szacowana precyzja wynosi 35 nm. (D) Rekonstrukcja obrazu w superrozdzielczości odpowiadająca danym zebranym w (B). Taki sam rozmiar obrazu, ale z pikselami o wielkości 25 nm. Średnia szacowana precyzja wynosi 30 nm. (E) Wykres przedstawiający liczbę zaakceptowanych lokalizacji na klatkę, z zastosowaniem kroczącej średniej z 100 klatek. Linia czerwona odpowiada sekwencji STORM (A i C), w której występuje wysokie tło. Linia niebieska przedstawia dane odpowiadające (B i D), gdzie tło jest niskie. (F) Wykres przedstawiający liczbę zaakceptowanych lokalizacji dla obrazów odpowiadających danym z wysokim (C) i niskim (D) tłem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 4. Typowe dane dla aktyny. (A-C) Obrazy włókien aktynowych ograniczone dyfrakcją przed dodaniem buforu przełączającego i obrazowaniem STORM. Widoczne są włókna o różnych długościach. Bardzo jasne włókna to często kilka splątanych ze sobą włókien. Rozmiar piksela wynosi 160 nm. (D) Obraz pojedynczego włókna aktynowego ograniczony dyfrakcją. (E) Obraz STORM (zastosowano 0,1% wzmocnienia kontrastu w programie ImageJ). Wykonany z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i szybkości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela wynosi 16 nm. Średnia szacowana precyzja wynosi 16 nm. (F) Wykres liczby zaakceptowanych lokalizacji na klatkę, z wykorzystaniem średniej kroczącej z 100 klatek. (G) Powiększony fragment włókna aktynowego z (E) przed wzmocnieniem kontrastu, z naniesionym żółtym profilem linii. (H) Widok profilu wykresu dla żółtej linii narysowanej przez włókno aktynowe. Wygenerowany w programie ImageJ. (I) Dopasowanie Gaussa do profilu wykresu przy użyciu narzędzia dopasowania krzywej w ImageJ. Odchylenie standardowe, d, pomnożono przez 2,35, aby uzyskać pomiar FWHM wynoszący 43,2 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek.
Rycina 5. Błędnie zlokalizowane filamenty aktynowe. (A) Filament aktynowy w rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją. Piksele 160 nm. (B) Obraz STORM filamentu aktynowego przedstawionego na (A). Uzyskany z sekwencji 20 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i częstotliwości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 16 nm. Przetworzono wszystkie 20 000 klatek. Średnia szacowana precyzja wynosi 17 nm. (C) Analogicznie jak w (B), lecz przetworzono tylko pierwsze 5000 klatek z sekwencji 20 000 klatek. Średnia szacowana precyzja wynosi 18 nm. (D) Analogicznie jak w (B), lecz przetworzono tylko ostatnie 5 000 klatek z sekwencji 20 000 klatek. Średnia szacowana precyzja wynosi 17 nm. (E) Wykres danych dotyczących liczby lokalizacji na klatkę z pełnego widoku klatki o rozmiarze 128 x 128 pikseli.
Rycina 6. Dryf boczny. (A) Obraz STORM filamentu aktynowego zrekonstruowany z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze 64 x 64 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i częstotliwości 64,6 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 32 nm. Średnia szacowana precyzja wynosi 32 nm. (B) Obraz STORM wyświetlony przy użyciu funkcji „Box Tracking” w programie rainSTORM. Lokalizacje są wyświetlane w kolorze odpowiadającym numerowi klatki, w której zostały zarejestrowane; na przykład lokalizacje z początku sekwencji akwizycji są niebieskie, a z końca sekwencji są czerwone. Przesunięcie kolorów wskazuje na wystąpienie dryfu. (C) Powiększony obszar z obrazu (A) wyświetlony przy użyciu funkcji Box Tracking w programie rainSTORM. Przesunięcie kolorów wskazuje na wystąpienie dryfu. (D) Obraz ograniczony dyfrakcyjnie czterech 100 nm fluorescencyjnych kuleczek, które mogą służyć jako znaczniki fiducyjne. Rozmiar piksela 160 nm. Numery 1-4 przedstawiają pojedynczo wycięte i powiększone kuleczki. (E) Każda kuleczka fluorescencyjna odpowiadająca obrazowi (D) zrekonstruowana w programie rainSTORM z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i częstotliwości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 5 nm. Średnia szacowana precyzja wynosi 7 nm. (F) Kuleczki odpowiadające obrazom (D) i (E), wyświetlone przy użyciu funkcji „Box Tracking”. Przesunięcie kolorów wskazuje na wystąpienie dryfu. (G) Przy przyjęciu kuleczki numer 2 jako referencji, kuleczki 1, 3 i 4 są wyświetlane po zastosowaniu funkcji „Subtract Drift” w programie rainSTORM. Porównanie z (E) pokazuje, że dryf boczny został skorygowany. Rozmiar piksela STORM wynosi 5 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.
Rysunek 7. Typowe dane dla EGF. (A) Obraz ograniczony dyfrakcją fragmentu komórki HeLa, ogniskowany na podstawnej powierzchni komórki. Żółte ramki wskazują powiększone obszary zainteresowania przedstawione w (B) i (C). (B) Powiększony obraz ograniczony dyfrakcją z obszaru w pobliżu krawędzi komórki (ramka B). (C) Powiększony obraz ograniczony dyfrakcją z obszaru pod jądrem (ramka C). (D) Obraz STORM odpowiadający obrazowi (A). Uzyskany z sekwencji 10 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 msec i szybkości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Rozmiar piksela STORM wynosi 25 nm. Średnia szacowana precyzja wynosi 21 nm. (E) Obraz STORM odpowiadający ramce E (D). (F) Obraz STORM odpowiadający ramce F (D). (G) Dane dotyczące liczby lokalizacji na klatkę z obrazu (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Filmy 1-4. Filmy odpowiadają Rysunkowi 2A przy różnych stężeniach dekstranu: 1 = wysokie, 2 = średnie, 3 = niskie, 4 = brak). Sekwencje 10 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, zarejestrowane przy czasie ekspozycji 10 msec i prędkości 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 1, film 2, film 3, film 4
Filmy 5-6. Filmy odpowiadają Rysunkowi 3 A i B. Film 5 przedstawia etap przed płukaniem, a Film 6 etap po płukaniu, po usunięciu niezwiązanych fluoroforów. Sekwencje 15 000 klatek przy rozmiarze klatki 128 x 128 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i częstotliwości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film 5, film 6.
Wideo 7. Film pokazujący surową sekwencję klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na Rysunku 4E. Sekwencja 10 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 msec i szybkości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo 7.
Wideo 8. Film przedstawiający surową sekwencję klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na Ryc. 5B. Sekwencja 20 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i częstotliwości akwizycji 52.5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo 8.
Wideo 9. Film przedstawiający surową sekwencję klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM przedstawionego na Rysunku 6A. Sekwencja 10 000 klatek o rozmiarze 64 x 64 pikseli, czasie ekspozycji 10 msec i prędkości rejestracji 64,6 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo 9.
Wideo 10. Film przedstawiający surową sekwencję klatek, która została przetworzona w celu wygenerowania obrazu STORM na Rysunku 7D. Sekwencja 10 000 klatek o rozmiarze 128 x 128 pikseli, czasie naświetlania 10 msec i częstotliwości akwizycji 52,5 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo 10.
Dyskusja
Pokazujemy, że za pomocą kilku prostych próbek testowych i ogólnodostępnego oprogramowania do przetwarzania rainSTORM możliwa jest optymalizacja obrazowania w superrozdzielczości STORM. Te narzędzia i metody zapewnią użyteczne punkty wyjścia dla nowych użytkowników oraz sposoby dla doświadczonych użytkowników na zwiększenie zaufania do swoich mikroskopów i ich wykorzystania do badania struktur biologicznych i komórkowych z niespotykaną dotąd szczegółowością. Wykorzystując kombinację próbek o znanych lub dobrze poznanych strukturach oraz algorytm, który może wygenerować szereg użytecznych wskaźników jakości obrazu, takich jak oszacowania średniej precyzji, liczba lokalizacji i histogramy, można poprawić jakość obrazu i mieć większe zaufanie do procesu obrazowania STORM. Nie ma jednego uniwersalnego podejścia do pozyskiwania danych, ponieważ istnieje wiele różnych komercyjnych i samodzielnie zbudowanych konfiguracji mikroskopów, których można użyć. Co więcej, istnieje wiele etapów przygotowania próbki i akwizycji obrazu, które mogą mieć wpływ na ostateczny obraz, dlatego posiadanie narzędzi programowych i próbek testowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i optymalizacji jakości obrazu STORM.
Ponadto protokoły te mogą zapewnić przydatne i mniej niejednoznaczne sposoby rozwiązywania wszelkich problemów, które mogą się pojawić. Na przykład próbka dekstranu jest bardzo przydatnym sposobem określenia, czy występuje niewspółosiowość wiązki laserowej lub nierównomierne oświetlenie próbki. Jeśli istnieją obawy, że bufor przełączający może nie działać, pomocny będzie bardzo prosty test wizualny, aby sprawdzić, czy jest jakieś "mruganie". Filamenty aktynowe są użytecznym sposobem pomiaru rozdzielczości za pomocą porównań FWHM, a także podkreślania artefaktów dryfu i błędnej lokalizacji. Należy jednak zauważyć, że ponieważ metody superrozdzielczości oparte na lokalizacji mogą być wrażliwe na gęstość fluoroforu, niezależnie od innych czynników, takich jak czasy ekspozycji, liczba klatek na sekundę, moc lasera i sposób przetwarzania obrazu, niemożliwe jest przypisanie rozdzielczości do konkretnego mikroskopu i założenie, że wszystkie obrazy będą miały tę rozdzielczość. Możliwe jest jednak zmierzenie różnych aspektów rozdzielczości, takich jak średnia precyzja lokalizacji, liczba lokalizacji i dryf 27. Nawet jeśli markery odniesienia nie mogą być włączone do każdego eksperymentu, można je przynajmniej wykorzystać do scharakteryzowania systemu mikroskopowego, jego środowiska i lepszego zrozumienia kwestii operacyjnych, takich jak czas potrzebny do osiągnięcia równowagi termicznej po uruchomieniu. Oprócz korekcji dryfu bocznego, markery odniesienia mogą być używane do charakteryzowania i korygowania dryfu osiowego, chociaż wymaga to użycia soczewki astygmatycznej i mechanizmu sprzężenia zwrotnego w celu skorygowania pozycji próbki podczas pozyskiwania obrazów 43. Komercyjne systemy super-resolution zwykle zawierają jakiś rodzaj kontroli stabilności lub mechanizmu blokady ostrości, który może być bardziej praktycznym rozwiązaniem do korekcji dryfu ostrości.
Istnieją alternatywy dla niespecyficznego powlekania szkła dekstranem, takie jak bezpośrednie stosowanie barwników lub innych sprzężonych cząsteczek, takich jak przeciwciała drugorzędowe. Ograniczeniem tych podejść jest to, że liczba cząsteczek związanych ze szkłem nie jest znana. Alternatywne struktury nitkowate, które zostały użyte, obejmują mikrotubule 28 i DNA21. Jednak połączenie bardzo małych rozmiarów i wygodnych dostępnych na rynku odczynników sprawia, że aktyna jest atrakcyjną alternatywą, zwłaszcza że odległość separacji rozbieżnych lub rozgałęzionych włókien może być również użytecznym pomiarem wydajności systemu 27.
Jest miejsce na dalszy rozwój próbek testowych, pomimo ostatnich postępów w tej dziedzinie 28,29,46,47. W szczególności obrazowanie wielokolorowe wiąże się z szeregiem wyzwań we wszystkich 3 głównych aspektach obrazowania, etykietowaniu próbek, pozyskiwaniu obrazu (sprzęt) i oprogramowaniu (przetwarzanie i wyrównywanie obrazu). Powstało wiele publikacji poświęconych tym aspektom 4-6 i dlatego jasne jest, że odpowiednie próbki testowe i metodologie mają kluczowe znaczenie dla generowania i wiarygodnej interpretacji tego typu obrazów. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że dSTORM może być używany do wykonania dwóch kolorowych obrazów i rozdzielczości wysoce symetrycznej natury kompleksu porów jądrowych, a autorzy zasugerowali, że byłby to idealny sposób oceny wydajności korekcji aberracji chromatycznej 45. Innym interesującym podejściem jest wykorzystanie origami DNA do stworzenia nanolinijki, która stwarza możliwość pozycjonowania fluoroforów w określonych odległościach od siebie pod dyfrakcją 46. Zapewnia to sposób oceny rozdzielczości i wykonywania pomiarów odległości. Jednak ostatecznym celem jest zastosowanie tych technik superrozdzielczości do niewyidealizowanych próbek, takich jak komórki, które są złożonymi strukturami trójwymiarowymi. W takim przypadku połączenie dokładniejszego zrozumienia techniki w połączeniu z narzędziami programowymi, które pomagają użytkownikowi w pozyskiwaniu danych, przetwarzaniu ich w odpowiedni sposób i dostarczaniu metryk obrazu, prawdopodobnie będzie ostateczną odpowiedzią. 28,29,47,48
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Potwierdzamy finansowanie z programu Metrologii Chemicznej i Biologicznej brytyjskiego Narodowego Urzędu Miar. Dziękujemy Sebastianowi van de Linde, Miklosowi Erdelyi i Ericowi Reesowi za porady i sugestie techniczne. Dziękujemy Miklosowi Erdelyi, Ericowi Reesowi i Maxowi Ryadnovowi za pomocne komentarze i dyskusje na temat tego manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkło komorowe Labtek Imaging | Fisher | CBR-166-390E | Przygotowanie próbki |
| Mikroskop odwrócony | Olympus | IX71 | * Poniżej znajdują się alternatywy |
| Obiektyw 100 X TIRF | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * Poniżej znajdują się alternatywy |
| Kamera EMCCD | ior | iXon 897 | * Poniżej znajdują się alternatywy |
| Laser | 640 nmToptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - do obrazowania barwników Alexa 647 lub Cy5 |
| LabVIEW | National Instruments | *Oprogramowanie akwizycyjne (sprzęt sterujący) | |
| PC | Dell | Windows XP (64 bit), procesor Intel Xeon E5420, 16 GB RAM *Sterowanie instrumentem i przetwarzanie obrazu | |
| ImageJ | Analiza i przetwarzanie obrazu http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
| MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
| *Przykład samodzielnie zbudowanych mikroskopów | Zobacz także odnośnik 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
| *Komercyjne mikroskopy | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (lokalizacja Monet) Alternatywy dla samodzielnie zbudowanych mikroskopów | ||
| Tabela 1. Materiały i Sprzęt | |||
| [nagłówek] | |||
| PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
| Poli-L-Lizyna | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
| Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
| Ogólny bufor aktynowy | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
| Filamenty wstępnie uformowane aktyny | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
| Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
| Mikrosfery TetraSpeck (0,1 mikrona) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
| Komórki HeLa | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
| DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
| FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
| Pióro/Krok | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
| Naczynia plastikowe | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
| EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
| BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
| Formaldehyd - 10 % roztwór klasy EM | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
| Katalaza | Sigma | C100 | 5.1 |
| Oksydaza glukozowa | Sigma | G2133 | 5.1 |
| KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
| TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
| Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
| Glukoza | Sigma | C7528 | 5.2 |
| MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
| Gliceryna | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
| Odczynniki Tabela 2. |
Bibliografia
- Galbraith, C., Galbraith, J. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124, 1607-1611 (2011).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26, 285-314 (2010).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317, 1749-1753 (2007).
- Bates, M., Dempsey, G., Chen, K. H., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13, 99-107 (2012).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical journal. 99, 2686-2694 (2010).
- Baddeley, D., et al. 4D Super-Resolution Microscopy with Conventional Fluorophores and Single Wavelength Excitation in Optically Thick Cells and Tissues. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Jones, S., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5, 1047-1052 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Juette, M., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Meth. 5, 527-529 (2008).
- Vaziri, A., Tang, J., Shroff, H., Shank, C. Multilayer three-dimensional super resolution imaging of thick biological samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 20221-20226 (2008).
- York, A., Ghitani, A., Vaziri, A., Davidson, M., Shroff, H. Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM with genetically expressed probes. Nature Methods. 8, 327-333 (2011).
- Jones, S., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8, 499-505 (2011).
- Shroff, H., Galbraith, C., Galbraith, J., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5, 417-423 (2008).
- Hess, S., et al. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 17370-17375 (2007).
- Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
- Klein, T., et al. Live-cell dSTORM with SNAP-tag fusion proteins. Nature Methods. 8, 7-9 (2011).
- Folling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nature Methods. 5, 943-945 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hofmann, M., Eggeling, C., Jakobs, S., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17565-17569 (2005).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Wolter, S., et al. Real-time computation of subdiffraction-resolution fluorescence images. Journal of Microscopy. 237, 12-22 (2010).
- Wolter, S., et al. rapidSTORM: accurate, fast open-source software for localization microscopy. Nat. Methods. 9, 1040-1041 (2012).
- Henriques, R., et al. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7, 339-340 (2010).
- Rees, E., et al. Blind Assessment of Localisation Microscope Image Resolution. Journal of Optical Nanoscopy. 1, 12(2012).
- Dempsey, G., Vaughan, J., Chen, K., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Meth. 8, 1027-1036 (2011).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature. 6, 991-1009 (2011).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-Resolution Fluorescence Imaging with Conventional Fluorescent Probes. Angewandte Chemie International Edition. 47, 6172-6176 (2008).
- Owen, D. M., Sauer, M., Gaus, K. Fluorescence localization microscopy: The transition from concept to biological research tool. Commun Integr Biol. 5, 345-349 (2012).
- van de Linde, S., Wolter, S., Heilemann, M., Sauer, M. The effect of photoswitching kinetics and labeling densities on super-resolution fluorescence imaging. Journal of biotechnology. 149, 260-266 (2010).
- Veatch, S., et al. Correlation Functions Quantify Super-Resolution Images and Estimate Apparent Clustering Due to Over-Counting. PLoS ONE. 7, e31457(2012).
- Holden, S., Uphoff, S., Kapanidis, A. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nature. 8, 279-280 (2011).
- Cox, S., et al. Bayesian localization microscopy reveals nanoscale podosome dynamics. Nat Methods. 9, 195-200 (2012).
- Mukamel, E., Babcock, H., Zhuang, X. Statistical deconvolution for superresolution fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 102, 2391-2400 (2012).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13978-13983 (2012).
- Parkar, N. S., et al. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1301-1312 (2009).
- Clague, M. J., Urbe, S. The interface of receptor trafficking and signalling. J Cell Sci. 114, 3075-3081 (2001).
- van de Linde, S., Sauer, M., Heilemann, M. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of proteins in the mitochondrial inner membrane with photoswitchable fluorophores. Journal of Structural Biology. 164, 250-254 (2008).
- Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M., Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society. 127, 3801-3806 (2005).
- Heilemann, M., Mukherjee van S,, A,, Sauer, M. Super-Resolution Imaging with Small Organic Fluorophores. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6903-6908 (2009).
- Lee, S. H., et al. Using fixed fiduciary markers for stage drift correction. Opt Express. 20, 12177-12183 (2012).
- Mlodzianoski, M., et al. Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy. Optics express. 19, 15009-15019 (2011).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, 570-575 (2012).
- Steinhauer, C., Jungmann, R., Sobey, T. L., Simmel, F. C., Tinnefeld, P. DNA origami as a nanoscopic ruler for super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 8870-8873 (2009).
- Laevsky, G. S., O'Connell, C. B. Comparative and practical aspects of localization-based super-resolution imaging. Current protocols in cytometry. Chapter 2, Unit2 20(2013).
- Gould, T., Verkhusha, V., Hess, S. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nature. 4, 291-308 (2009).
Przedruki i uprawnienia
