Artykuł metodologiczny

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

DOI:

10.3791/50585

⸱

26 września 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W 2001 roku naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles opisali izolację nowej populacji dorosłych komórek macierzystych z liposukcyjnej tkanki tłuszczowej, którą początkowo nazwali Przetworzonymi Komórkami Lipoaspiratu lub komórkami PLA. Od tego czasu te komórki macierzyste zostały przemianowane na komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC i stały się jedną z najpopularniejszych populacji dorosłych komórek macierzystych w dziedzinie badań nad komórkami macierzystymi i medycyny regeneracyjnej. Tysiące artykułów opisuje zastosowanie ASC w różnych regeneracyjnych modelach zwierzęcych, w tym w regeneracji kości, naprawie nerwów obwodowych i inżynierii sercowo-naczyniowej. Ostatnie artykuły zaczęły opisywać niezliczone zastosowania ASC w klinice. Protokół przedstawiony w tym artykule przedstawia podstawową procedurę ręcznego i enzymatycznego izolowania ASC z dużych ilości lipoaspiratów uzyskanych z zabiegów kosmetycznych. Protokół ten można łatwo skalować w górę lub w dół, aby dostosować się do objętości lipoaspiratu i można go dostosować do izolacji ASC z tkanki tłuszczowej uzyskanej w wyniku plastyki brzucha i innych podobnych procedur.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W 2001 roku, przypuszczalna populacja multipotencjalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej została opisana w czasopiśmie Tissue Engineering 1. Komórkom tym nadano nazwę Przetworzone komórki lipoaspiratu lub komórki PLA ze względu na ich pochodzenie z przetworzonej tkanki lipoaspiratu uzyskanej za pomocą chirurgii plastycznej. Opisana w artykule metoda izolacji została oparta na istniejących strategiach enzymatycznych izolacji frakcji zrębowej naczyniowej (SVF) z tkanki tłuszczowej 2. SVF został zdefiniowany jako minimalnie przetworzona populacja czerwonych krwinek, fibroblastów, komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich, perycytów i preadipocytów, które nie przylgnęły jeszcze do substratu do hodowli tkankowej 2, 3. Proponuje się hodowlę tego SVF w czasie w celu wyeliminowania wielu z tych zanieczyszczających populacji komórek i uzyskania przylegającej populacji fibroblastów. Te fibroblasty zostały zidentyfikowane w literaturze w ciągu ostatnich 40 lat jako preadipocyty. Jednak nasza grupa badawcza wykazała, że komórki te posiadały mezodermalną multipotencję i przemianowała przylegającą populację SVF na komórki PLA. Późniejsze badania przeprowadzone przez wiele innych grup badawczych zwiększyły ten potencjał, sugerując zarówno potencjał endodermalny, jak i ektodermalny (przegląd patrz 4). Od tego czasu w literaturze pojawiło się wiele dodatkowych określeń na te komórki. Aby zapewnić pewien rodzaj konsensusu, termin komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ang. Tłuszczowe Komórki Macierzyste) został przyjęty nadrugiej dorocznej konferencji IFATS. W związku z tym termin ASC będzie używany w tym artykule.

Protokół opisany w tym artykule jest stosunkowo prostą procedurą, która wymaga standardowego sprzętu laboratoryjnego i wykorzystuje proste odczynniki, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosfo, standardowe odczynniki do hodowli tkankowych i kolagenaza. Może wytwarzać dużą liczbę ASC w zależności od ilości wyjściowej objętości tkanki tłuszczowej i późniejszego czasu hodowli. Jednak przetwarzanie tak dużej ilości tkanki tłuszczowej może stwarzać pewne problemy fizyczne, które można w pewnym stopniu złagodzić za pomocą tego protokołu. Ponadto protokół ten wymaga sterylnych urządzeń do hodowli tkankowych i zatwierdzonych kapturów bezpieczeństwa biologicznego, co wymaga korzystania z zatwierdzonego zakładu hodowli tkankowej. Wymóg ten może również zmniejszyć użyteczność populacji ASC w zastosowaniach klinicznych, chyba że są one izolowane w obiektach zatwierdzonych przez Dobrą Praktykę Wytwarzania (GMP) przeznaczonych do izolacji i rozszerzania materiałów do użytku klinicznego. Alternatywnie, zautomatyzowane systemy, które mogą izolować ASC w systemie zamkniętym na sali operacyjnej, pozwoliłyby uniknąć tego kluczowego problemu i pozwoliłyby na natychmiastowe użycie ASC bez konieczności późniejszej ekspansji in vitro. Do tej pory na rynku dostępnych jest sześć zautomatyzowanych systemów do izolacji komórek z tkanek ludzkich. Systemy te mogą umożliwić wyizolowanie znacznej liczby ASCs z dużych ilości tkanki tłuszczowej bezpośrednio po jej pobraniu. Te ASC mogą być następnie ponownie wprowadzone do pacjenta w różnych celach regeneracyjnych bez konieczności opuszczania przez pacjenta sali operacyjnej. Oprócz tego protokołu opisującego ręczną izolację ASC, w artykule towarzyszącym podano również protokół automatycznej izolacji ASC za pomocą Systemu Celution.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje ręczną izolację ASC od lipoaspiratów uzyskanych za pomocą zabiegów kosmetycznych z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i wirowania różnicowego. Protokół ten został po raz pierwszy opublikowany w czasopiśmie Tissue Engineering w 2001 roku1, gdzie powstałe komórki nazwano przetworzonymi komórkami lipoaspiratowymi lub komórkami PLA ze względu na ich izolację od lipoaaspiratów. Jednak termin komórka PLA został obecnie zastąpiony terminem komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC, aby nadać tej dziedzinie pewnego rodzaju zgodność pod względem nomenklatury. Wiele osób wykazało, że komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu posiadają potencjał mezodermalny zarówno in vitro, jak i in vivo (przegląd patrz 4). Ponadto zbadano również potencjał ektodermalny i endodermalny ASC 4. Technika izolacji jest prosta i nieskomplikowana, a jej wykonanie zajmuje około godziny. Powstałe komórki są hodowane w standardowych warunkach hodowli tkankowej. Wraz z czasem hodowli populacja ASC staje się bardziej jednorodna, składa się z komórek fibroblastycznych, które łatwo się rozwijają i wykazują dobrą żywotność w długim okresie w hodowli.

nuta: Następujące elementy wyposażenia, które są wymagane, są wymienione na końcu tego artykułu. Wszystkie naczynia szklane, media i odczynniki powinny być sterylizowane w autoklawie lub filtrowane przez filtry 0,22 μm. Przez cały czas należy przestrzegać technik aseptycznych hodowli tkankowych. Aby to zapewnić, wszystkie materiały umieszczone w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy wysterylizować poprzez spryskanie 70% roztworem etanolu i przetarcie czystymi ręcznikami papierowymi.

1. Przed zbiorami przygotuj następujące elementy:

  1. Sterylny 1X sól fizjologiczna buforowana fosfo (PBS) do płukania lipoaaspiratów. Przygotować około 1 l 1x PBS na każde 100 ml lipoaaspiratu. Przed użyciem należy sterylizować PBS w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Opcjonalnie antybiotyk/antybiotyk można dodać do końcowego stężenia: 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2,50 μg/ml amfoterycyny B po ostygnięciu PBS.
  2. Sterylna 0,075-0,1% kolagenaza typu IA (z Clostridium histolyticum) do enzymatycznego trawienia lipoazytu. Stężenie będzie zależało od jakości i źródła kolagenazy - tj. surowej vs. oczyszczonej. Można stosować inne rodzaje kolagenazy (np. kolagenazę typu II lub IV) w podobnych stężeniach. Przygotować w 1x PBS i sterylnym filtrze, używając systemu filtracji o pojemności 1 000 ml z filtrem 0,22 μm (rysunek 1A). Można jednak również używać sterylnych szklanych butelek wyposażonych w filtr górny od butelki. Przygotuj i użyj w temperaturze pokojowej. Roztwory kolagenazy mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 °C, dopóki nie będą potrzebne. Nie należy zamrażać roztworu kolagenazy, ponieważ może to zmniejszyć jego aktywność.
  3. Sterylna pożywka kontrolna (CM) do inaktywacji kolagenazy i hodowli populacji ASC. Na 500 ml CM połącz następujące elementy: 500 ml DMEM (4,5 g/L glukozy z L-glutaminą), 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (inaktywowanej termicznie), 5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 j.m. penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny). Opcjonalnie można również dodać 5 ml amfoterycyny B (250 μg/ml amfoterycyny B). Sterylna filtracja tego podłoża jest wymagana, jeśli używane są odczynniki niesterylne. Umieść CM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut przed użyciem, aby podgrzać podłoże.
  4. Sterylne naczynia szklane i plastikowe do izolacji. Przed użyciem należy złożyć w autoklawie szklaną zlewkę o pojemności 1 000 ml i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Ponadto należy przygotować następujące naczynia z tworzywa sztucznego: aseptyczne pipety serologiczne (5 ml, 10 ml i 25 ml), probówki wirówkowe o pojemności 50 ml oraz szalki hodowlane poddane działaniu kultur tkankowych.

2. Izolacja ASC od lipoaspiratów

Większość lipoaspiratów jest zbierana w pojemniku aspiracyjnym (patrz rysunek 1B) i może składać się z trzech odrębnych warstw: 1) górnej warstwy oleju w wyniku lizy dojrzałych adipocytów, 2) środkowej warstwy tkanki tłuszczowej i 3) dolnej, płynnej infranatantu zawierającej sól fizjologiczną i zanieczyszczające typy komórek, takie jak czerwone krwinki (RBC). Wierzchnia warstwa oleju może nie być obecna w znacznych ilościach. Jeśli jest obecny, należy go zassać, ponieważ zanieczyszczenie olejem powstałej kultury ASC może wpłynąć na żywotność hodowli. Dolny infranatant powinien zostać usunięty przed przetwarzaniem, aby zminimalizować zanieczyszczenie kultur ASC erytrocytami. Pozostawi to środkową warstwę tkanki tłuszczowej, która następnie zostanie przemyta i enzymatycznie strawiona, aby uwolnić jej komórkową, zrębową frakcję naczyniową (SVF).

  1. Mycie lipoaspiratu: Otwórz pojemnik na lipoaspirat w kapturze do hodowli tkankowych i ostrożnie zdekantuj lipoaspirat do sterylnej szklanej zlewki o pojemności 1 l. Pozwól, aby warstwy lipoaspiratu rozdzieliły się, aż warstwa tkanki tłuszczowej zostanie dobrze oddzielona (ryc. 1B).
    1. Odessać warstwę oleju (jeśli występuje) za pomocą sterylnej, szklanej pipety, a dolną warstwę soli fizjologicznej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Spowoduje to usunięcie większości zanieczyszczających czerwonych krwinek i soli fizjologicznej.
    2. Oceń objętość powstałej warstwy tkanki tłuszczowej i dodaj sterylny 1x PBS w równej objętości. Wymieszać aspirat za pomocą pipety używanej do aspiracji, aby wymieszać lipoaspirat z PBS. Pozwól dwóm warstwom osiąść. Jak wspomniano powyżej, 1x PBS może być uzupełniony antybiotykami/antybiotykami.
    3. Odessać infranatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
    4. Kontynuuj mycie frakcji tkanki tłuszczowej zgodnie z opisem w krokach 2.1.2 i 2.1.3, aż warstwa tłuszczowa uzyska żółto-złoty kolor. Odessać infranatant po raz ostatni, pozostawiając frakcję tkanki tłuszczowej w szklanej zlewce. Aby zapewnić odpowiednie usunięcie podnatantu, należy pozostawić warstwy lipoaspiratu na 5 minut po ostatnim myciu i przed ostatecznym zasysaniem.
  2. Trawienie enzymatyczne lipoaspiratu: Przygotować sterylny roztwór kolagenazy 1A, jak opisano powyżej, w jednostce filtrującej. Przygotować objętość równą objętości frakcji tłuszczowej i sterylny filtr.
    1. Po przefiltrowaniu roztworu kolagenazy należy wyrzucić górną jednostkę filtrującą, ostrożnie wlać umytą frakcję tłuszczową do roztworu kolagenazy i szczelnie zamknąć butelkę.
    2. Umieść mieszaninę kolagenazy i tłuszczu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i trawić w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Delikatnie mieszaj mieszaninę kolagenazy i tłuszczu co 5-10 minut i umieść z powrotem w łaźni wodnej. Warstwa tkanki tłuszczowej powinna nabierać "gładszego" wyglądu (ryc. 1B) w miarę postępu trawienia. Dodatkowy czas trawienia (tj. do 2 godzin) można zastosować, jeśli warstwa tkanki tłuszczowej nadal wydaje się zawierać stałe kawałki tłuszczu.
  3. Izolacja ASC: Umieść strawioną mieszaninę kolagenazy i tłuszczu z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pamiętaj, aby wysterylizować jednostkę filtrującą 70% etanolem przed ponownym umieszczeniem w szafce.
    1. Odpipetować 25 ml podwielokrotności podnarodzin zawierających SVF do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    2. Dodać 25 ml CM do każdej probówki. Pozwól CM dezaktywować kolagenazę poprzez inkubację w temperaturze pokojowej w komorze przez 5 minut.
    3. Wirować przez 10 minut przy 1 200 x g, aby zebrać SVF w postaci granulek.
    4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego odessać supernatant z każdej probówki. Upewnij się, że górna warstwa oleju i wszelkie pływające adipocyty są zasysane tym supernatantem (Figura 1B).
    5. Połącz granulki SVF w jedną probówkę wirówkową za pomocą 30 ml CM i podziel równo na dwie nowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml. Odwirować jak w kroku 2.3.3. i odessać supernatanty z dwóch granulek SVF (nie pokazanych na rysunku).
      fakultatywny: Jeśli pożądana jest liza RBC, ponownie zawiesić każdą osadkę SVF w 10 ml buforu do lizy RBC (160 mM NH4Cl) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować jak w kroku 2.3.3. i odessać supernatanty, aby uzyskać granulki SVF (nie pokazane na rysunku).
    6. Połącz dwa granulki SVF w jedną nową probówkę wirówkową za pomocą 5-10 ml CM (ryc. 1B).
    7. Aby odfiltrować większe cząstki tkanki, należy pipetować zawieszone granulki SVF na filtr siatkowy o wielkości 100 μm umieszczony na nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i pozostawić do przefiltrowania przez przepływ grawitacyjny.
    8. Odpipetować porcje zawieszonego (i przefiltrowanego) osadu SVF zawierającego ASC na szalkach hodowlanych poddanych działaniu kultur tkankowych. Uzupełnij każde danie odpowiednią objętością CM.
    9. Hodować komórki w CM przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 bez zmiany pożywki.

Po tym początkowym okresie hodowli, pożywka hodowlana może być odessana, a wszelkie zanieczyszczające czerwone krwinki delikatnie usunięte przez mycie sterylnym 1XPBS. Zamień na CM i kontynuuj hodowlę ASC w razie potrzeby. Rodzaj użytej płytki do hodowli tkankowej i sposób podziału zawieszonych osadów SVF między tymi szalkami będzie zależał od liczby komórek pożądanych po konwencjonalnej hodowli tkankowej.

3. Charakterystyka populacji ASC: cytometria przepływowa i różnicowanie wieloliniowe

Po wyizolowaniu należy przeprowadzić charakterystykę populacji ASC. Konwencjonalne podejścia do tego celu obejmują cytometrię przepływową w celu scharakteryzowania profilu antygenu CD komórek na powierzchni komórki oraz różnicowanie in vitro w celu potwierdzenia ich zdolności do różnicowania wieloliniowego. Podczas gdy wiele linii można ocenić w ASC, protokół ten przedstawia różnicowanie ASC w komórki linii adipogennych, osteogennych i chondrogennych jako sposób na potwierdzenie wieloliniowych potencjałów mezodermalnych 5.

Wieloliniowość in vitro Różnicowanie ASC

  1. Różnicowanie osteogenne ASC: Przed indukcją należy przygotować podłoże osteogenne (OM) w następujący sposób: Do jednej butelki o pojemności 500 ml DMEM (4,5 g/ml glukozy) dodać 25,0 ml FBS (5,0% stężenia końcowego) i 5,0 ml penicyliny/streptomycyny (odpowiednio 10 000 j.m./ml i 10 000 mg/ml stężenia końcowe). Do tego dodać następujące osteogenne środki indukcyjne, aby uzyskać wskazane stężenia końcowe: deksametazon (0,1 μM końcowy), 2-fosforan kwasu L-askorbinowego (50,0 μM końcowy) i β-glicerofosforan (10,0 mM końcowy).
    1. Przed indukcją należy zebrać i umieścić wyhodowane ASC w żądanym naczyniu do hodowli tkankowej, tak aby osiągnąć zlewność około 50%. Dla każdej eksperymentalnej potrawy platerowanej, należy podać dodatkowe naczynie do nieindukowanej kontroli. Hodowla przez noc w CM.
      Uwaga: Zalecana jest 50% konfluencja, aby umożliwić ciągłą proliferację, która może wystąpić w trakcie indukcji
    2. W dniu indukcji usunąć pożywkę i dodać: OM do pożądanych studzienek doświadczalnych osteogenicznych i CM do studzienek kontrolnych. Objętość użytej pożywki będzie zależeć od wielkości naczynia do hodowli tkankowej. W przypadku naczyń 12-dołkowych wystarczy 1,0 ml pożywki na studzienkę. W przypadku naczyń z 6 dołkami wystarczy 2,0 ml pożywki na studzienkę. W przypadku szalek o średnicy 100 mm należy użyć 10,0 ml podłoża na naczynie.
    3. Hodować komórki przez minimum 14 dni ze zmianą odpowiedniej pożywki co 3-4 dni. Wysoce osteogenne populacje ASC mogą wykazywać oznaki zewnątrzkomórkowego odkładania się minerałów już po 7 dniach indukcji.
    4. Różnicowanie osteogenne (tj. zewnątrzkomórkowe odkładanie się minerałów) można potwierdzić za pomocą barwienia histologicznego von Kossy dla fosforanu wapnia. Plama ta wytworzy czarno-brązowy osad identyfikujący obecność zewnątrzkomórkowego fosforanu wapnia (patrz rysunek 2).
      Aby zabarwić odczynnikiem von Kossa:
      1. Usunąć OM z komór doświadczalnych i CM z komór kontrolnych
      2. Utrwal komórki na 60 minut w 4,0% paraformaldehydzie przygotowanym w 1x PBS.
      3. Umyj komórki dwa razy za pomocą 1x PBS.
      4. Inkubować komórki z 2,0% azotanem srebra (przygotowanym w wodzie) w ciemności przez 30 minut.
      5. Usuń azotan srebra, umyj dwa razy wodą destylowaną i wysusz komórki na powietrzu.
      6. Wystaw komórki na działanie światła UV przez 60 minut, aby wytrącić się osad fosforanu wapnia.
      7. Umyj ogniwa kilka razy za pomocą 1XPBS.
      8. W razie potrzeby przeciwbarwić komórkę hematoksyliną.
  1. Adipogenne różnicowanie ASC: Przed indukcją należy przygotować podłoże adipogenne (AM) w następujący sposób: Do jednej butelki o pojemności 500 ml DMEM (4,5 g/ml glukozy) dodać 50,0 ml FBS (10,0% stężenia końcowego) i 5,0 ml penicyliny/streptomycyny (odpowiednio 10 000 I.U/ml i 10 000 μg/ml stężenia końcowe). Do tego dodać następujące adipogenne środki indukujące, aby uzyskać wskazane stężenia końcowe: deksametazon (1,0 μM końcowy), 3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX - 0,5 mM końcowy), indometacyna (0,2 mM końcowy) i insulina (10,0 μM końcowy).
    1. Przed indukcją należy zebrać i umieścić wyhodowane ASC w żądanym naczyniu do hodowli tkankowej, tak aby osiągnąć zlewność około 80%. Dla każdej eksperymentalnej potrawy platerowanej, należy podać dodatkowe naczynie do nieindukowanej kontroli. Hodowla przez noc w CM. Uwaga: Adipogenne różnicowanie ASC wydaje się być bardziej efektywne przy zwiększonej konfluencji.
    2. W dniu indukcji usunąć pożywkę i dodać: AM do pożądanych osteogenicznych dołków doświadczalnych i CM do studzienek kontrolnych. Objętość użytej pożywki będzie zależeć od wielkości naczynia do hodowli tkankowej. W przypadku naczyń z 12 dołkami wystarczy 1.0.ml pożywki na studzienkę. W przypadku naczyń z 6 dołkami wystarczy 2,0 ml pożywki na studzienkę. W przypadku szalek o średnicy 100 mm należy użyć 10,0 ml podłoża na naczynie.
    3. Hodować komórki przez minimum 14 dni ze zmianą odpowiedniej pożywki co 3-4 dni. Wysoce adipogenne populacje ASC mogą wykazywać oznaki tworzenia się wakuoli lipidowej już po 7 dniach indukcji.
    4. ASC ulegające różnicowaniu adipogennemu rozwiną wiele wakuoli lipidowych, które można łatwo uwidocznić pod mikroskopem świetlnym. Ponadto różnicowanie adipogenne można potwierdzić za pomocą barwienia histologicznego Oil Red O, które gromadzi się w tych wakuolach (patrz ryc. 2).
      Aby zabarwić olejem czerwonym O:
      1. Usunąć pożywkę z komórek doświadczalnych i kontrolnych i utrwalić je na 60 minut za pomocą 10% formalnego utrwalacza wapniowego. Aby przygotować ten utrwalacz, połącz następujące elementy: 1,0 g CaCl2, 25,0 ml 16% paraformaldehydu (4,0% końcowego) i 75,0 ml wody destylowanej.
      2. Umyj komórki dwa razy 1x PBS.
      3. Umyj komórki krótko 70% etanolem.
      4. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut z roztworem czerwieni olejowej O. Aby przygotować roztwór czerwieni olejowej O, rozpuść 2,0 g proszku czerwieni olejowej O w 50,0 ml 70% etanolu i 50,0 ml acetonu.
      5. Umyj komórki 70% etanolem, a następnie wodą z kranu.
      6. Wizualizuj komórki wkrótce po barwieniu z powodu blaknięcia plamy z czasem.
  1. Chondrogenne różnicowanie ASC: Różnicowanie chondrogenne uzyskuje się za pomocą techniki hodowli o dużej gęstości, zwanej "kulturą mikromasową". Przed hodowlą należy przygotować pożywkę chondropochodną (ChM) w następujący sposób: Do jednej butelki o pojemności 500 ml DMEM (4,5 g/ml glukozy) dodać 5,0 ml FBS (1% stężenie końcowe) i 5,0 ml penicyliny/streptomycyny (odpowiednio 10 000 I.U/ml i 10 000 μg/ml stężenia końcowe). Do tego dodać następujące chondrogenne środki indukujące, aby uzyskać wskazane stężenia końcowe: L-askorbin-2-fosforan (50,0 μg/ml końcowy), insulina (6,25 μg/ml końcowy), transferyna (6,25 μg/ml końcowy) i TGFβ1 (10,0 ng/ml).
    1. Zebrać ASC i odwirować przez 5 minut przy 1 200 x g, aby granulować komórki. Policz komórki, aby określić gęstość zawiesiny komórek.
    2. Aby przygotować granulki mikromasy, należy przygotować dwie zawiesiny komórek: jedną zawiesinę doświadczalną przygotowaną w ChM o gęstości 1 x10,7 komórek/ml i jedną zawiesinę kontrolną przygotowaną w CM o gęstości 1 x 10,7 komórek/ml.
      1. Umieść 10,0 μl "kropelki" zawiesiny komórkowej w indywidualnych studzienkach naczynia wielodołkowego. Pozostawić na 2-3 godziny w temperaturze 37 °C.
      2. Delikatnie nałóż platerowane kropelki na ChM lub CM, uważając, aby nie rozdzielić komórek.
      3. Hoduj komórki do 14 dni w ChM lub CM ze zmianami pożywki co 3-4 dni. Komórki hodowane w ChM będą w tym czasie kondensować, tworząc osad mikromasy o dużej gęstości z niewielką ilością komórek lub ich brakiem w otaczającej monowarstwie. Hodowane komórki kontrolne nie ulegną tej kondensacji, a wiele z nich znajdzie się jako monowarstwa.
      4. Aby potwierdzić chondrogenezę, utrwal granulki przez 15 minut w 4,0% paraformaldehydzie (przygotowanym w 1x PBS) w temperaturze pokojowej. Barwienie na obecność zasiarczonych proteoglikanów za pomocą barwienia histologicznego Alcian Blue.
        Aby zabarwić za pomocą Alcian Blue:
        1. Umyj granulki utrwalone paraformaldehydem raz w 1x PBS.
        2. Inkubować granulki w 0,1 N HCl (pH 1,0) przez 5 minut, aby obniżyć ich pH.
        3. Usunąć HCl i dodać 1% odczynnik Alcian blue (przygotowany w 0,1 N HCl, pH 1,0). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
        4. Usuń odczynnik Alcian blue i przemyj granulki 0,1 N HCl (pH 1,0) w celu usunięcia nadmiaru plam.
        5. Można zastosować dodatkowe mycie wodą z kranu w celu zmniejszenia plam tła.
        6. Alternatywnie, granulki mikromasy mogą być zbierane, utrwalane przez noc w 10% formalinie, zatopione w parafinie i skrawki barwione na Alcian Blue.

4. Charakterystyka cytometryczna przepływu ASC

Charakterystyka profilu antygenu CD na powierzchni komórki może być dokonana za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej.

  1. Przygotowanie ASC do cytometrii przepływowej: Przed analizą należy przygotować bufor do cytometrii przepływowej (FCB) składający się z następujących składników: 1,0% BSA, 2,0% FBS i 0,025% saponiny przygotowanych w 1x PBS.
    1. Zebrać ASC i odwirować komórki przez 5 minut przy 1 200 x g, aby uzyskać osad.
    2. Ponownie zawiesić komórki w sterylnym 1XPBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Określić gęstość komórek zawiesiny.
    3. Podzielić zawiesinę na podwielokrotności o łącznych wymiarach 5 x 105 komórek i odwirować do osadu.
    4. Usunąć supernatant PBS i utrwalić komórki na 60 minut w temperaturze -20 °C z nadmiarem lodowatego 70% etanolu. W razie potrzeby komórki te mogą być przechowywane w tym 70% etanolu w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
    5. Po utrwaleniu ostrożnie zassać etanol i delikatnie przemyć granulat dwa razy nadmiarem FCB. Do prania:
      1. Dodać nadmiar FCB i delikatnie zawiesić granulkę.
      2. Wirować przez 5 minut przy 1 200 x g, aby zebrać komórki w postaci granulek.
      3. Ostrożnie odessać supernatant FCB.
      4. Powtórzyć.
    6. Usunąć końcowy supernatant z przemywania FCB z każdej podwielokrotności i ponownie zawiesić w 100 μl FCB. Dodać żądane przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone z fluorochromem, stosując rozcieńczenie sugerowane przez producenta. Inkubować komórki na lodzie z przeciwciałem przez 30 min.
      nuta: Jeśli przeciwciała pierwszorzędowe sprzężone z fluorochromem nie są dostępne, można zastosować niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe.
    7. Dla każdego użytego fluorochromu (np. FITC, PE) inkubować podwielokrotność komórek ze 100 ml FCB zawierającymi IgG dopasowane izotypowo jako kontrolę ujemną.
    8. Inkubować jedną podwielokrotność w 100 ml FCB niezawierającą przeciwciał jako dodatkową kontrolę.
    9. Umyj każdą podwielokrotność komórki dwa razy FCB, jak opisano w kroku 4.1.5. Po ostatnim przepłukaniu ponownie zawiesić podwielokrotności w 100 ml FCB i przystąpić do analizy przepływu.
      nuta: W przypadku użycia niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych: Po tym etapie przemywania inkubować podwielokrotności na lodzie przez 20 minut z FCB uzupełnionym odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem, stosując sugerowane przez producenta rozcieńczenie. Umyj dwa razy, jak opisano w kroku 4.1.5.
  2. Analiza przepływu ASC: W przypadku analizy przepływu należy zliczyć co najmniej 10 000 zdarzeń. Niebarwione i dopasowane izotypowo kontrole powinny być używane do ustawiania bramek według rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). W tym celu należy zastosować kontrolę bez przeciwciał (tj. niebarwionych) z kroku 4.1.8 w celu wyeliminowania zanieczyszczeń i martwych ASC. Kontrole IgG dopasowane izotypowo z kroku 4.1.7. powinny być używane do wyznaczania obszarów fluorescencji dodatniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy zarys protokołu opisuje ręczną, enzymatyczną metodę izolacji SVF z próbki lipoaspiratu o dużej objętości. W obrębie tego SVF znajdują się liczne populacje komórek, w tym ASC. Liczne badania sugerują, że hodowla tego SVF w standardowych warunkach hodowli tkankowej pozwoli na wyłonienie przylegającej populacji fibroblastów, która może składać się głównie z typu ASC. Zgodnie z tym, wykazaliśmy, używając cytometrii przepływowej i immunofluorescencji, że hodowane granulki SVF stają się zasadniczo wolne od głównych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa do izolacji ASC może występować w wielu formach: od stałych kawałków tkanki uzyskanych w wyniku resekcji lub lipoplastyki do mniejszych fragmentów uzyskanych w wyniku ekstrakcji strzykawką lub lipoplastyki wspomaganej ssaniem (tj. liposukcji ). To, czy można uzyskać więcej komórek SVF (a tym samym ASC) z wyciętych lub odessanych próbek tłuszczu, jest niejasne, ponieważ przedstawiono sprzeczne badania 16, 17. Możliwe, że każda forma tkanki tłuszczowej jest więcej niż odpowiednia do iz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy tego manuskryptu są współwynalazcami patentu należącego do Regentów Uniwersytetu Kalifornijskiego i licencjonowanego przez Cytori Therapeutics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować dodatkowemu personelowi badawczemu, który przyczynił się do opracowania opisanego protokołu i jego izolacji ASC, w tym: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD, Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, MD, Dr Zeni Alfonso i dr John Fraser Zaprezentowane wyniki zostały częściowo sfinansowane z grantów badawczych z National Institutes of Health, w tym z instytutów NIAMS i NIDCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik
DMEM (Dulbecco’ s Modyfikacja Eagle’ s Medium)Mediatech Cellgro10-013-CVz 4,5 g/ml glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu
Penicylina/StreptomycynaMediatech Cellgro30-002-CI10 000 j.m./ml penicyliny/10 000 μ g/ml streptomycyny
Amfoterycyna BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ g/ml amfoterycyny B
10X PBS (sól fizjologiczna buforowana fosfoMediatech Cellgro25-053-CIbez wapnia, bez magnezu
Trypsyna/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25 % trypsyna/2,21 mM EDTA
Kolagenaza typu IA (z Clostridium histolyticum)SigmaC2674preparat surowy; < 125 jednostek trawienia kolagenu/mg stałe
FBS (płodowa surowica bydlęca) inaktywowane termicznieGemini Bioproducts100106źródło USDA, inaktywowane termicznie
10 ml pipety serologiczneGenesee Scientific12-104
Pipety serologiczne 25 mlGenesee Scientific12-106
50 ml polipropylenowe probówkiGenesee Scientific21-106
Szalki do hodowli tkankowych 100 mmGenesee Scientific25-202
Szalki do hodowli tkankowych 150 mmGenesee Scientific25-203
500 ml Jednostki filtrujące StericupMembrana MilliporeSCGPU05REPES, 0,22 i #956; m pore
Sitka komórkoweFisherBrand22-363-549100 μ m siatka nylonowa
deksametazon - rozpuszczalna w wodzieSigmaD-2915
L-askorbinowy kwas 2 fosforanSigmaA-8960
β-glicerofosforan sól disodowa SigmaG-9422znana również jako glicerofosforan
insulinySigmaI-6634wytwarzana z trzustki bydlęcej
indometacynaSigmaI-7378
apo-transferynaSigmaT-4382
TGFβ 1R& D Systems240-B-002rekombinowany olej ludzki
Red OSigmaO-0625
Alcian BlueSigmaA-5268
Azotan srebraSigmaS-0319
Kwas solnyFisher ScientificA144
ParaformaldehydFisher Scientific30525-89-4dostarczany jako zapas
[nagłówek]
Potrzebny sprzęt
Kaptur bezpieczeństwa biologicznego klasy II A/BThermo Scientificzapewnia, że okap posiada przewody próżniowe do aspiracji
Wirówka stołowaHermle LabnetZ383Wymagany odchylany rotor do probówek 50 ml, zdolny do kąpieli wodnej 1200xg
Fisher Scientific IsotempS52602Qpojemności 5-10L, o pojemności 37C
Automatyczne pomoce do pipetDrummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2 InkubatorThermo ScientificForma 310z bezpośrednim ciepłem lub płaszczem wodnym
) wirówkowe 16%

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537(2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

frakcja naczyniowa zr butrawienie kolagenazprzemywanie aspiratu t uszczowegoizolacja kom rekprotok wirowaniahodowla tkankowatesty r nicowanialinie adipogennaosteogenna i chondrogenna

Powiązane artykuły