Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neutrofile są krytycznymi komórkami efektorowymi wrodzonego układu odpornościowego. Są one szybko rekrutowane w miejscach ostrego stanu zapalnego i wywierają działanie ochronne lub patogenne w zależności od środowiska zapalnego. Niemniej jednak, pomimo nieodzownej roli neutrofili w odporności, nadal brakuje szczegółowego zrozumienia czynników molekularnych, które pośredniczą w efektorowym i immunopatogennym działaniu neutrofili w różnych chorobach zakaźnych i stanach zapalnych, częściowo z powodu ich krótkiego okresu półtrwania, trudności z obchodzeniem się z tymi komórkami oraz braku wiarygodnych protokołów eksperymentalnych w celu uzyskania wystarczającej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych i adopcyjnych eksperymenty transferowe. Dlatego proste, szybkie, ekonomiczne i niezawodne metody są wysoce pożądane w celu zebrania wystarczającej liczby neutrofili myszy do oceny funkcji takich jak fagocytoza, zabijanie, produkcja cytokin, degranulacja i transport. W tym celu przedstawiamy powtarzalny protokół wirowania w gradionym gradicynie gęstości, który można zaadaptować w dowolnym laboratorium do izolowania dużej liczby neutrofili ze szpiku kostnego myszy o wysokiej czystości i żywotności. Ponadto przedstawiamy prosty protokół, który wykorzystuje barwniki CellTracker do znakowania wyizolowanych neutrofili, które można następnie adoptywnie przenieść do myszy biorców i śledzić w kilku tkankach przez co najmniej 4 godziny po transferze za pomocą cytometrii przepływowej. Korzystając z tego podejścia, różnicowe znakowanie neutrofili od myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem genów za pomocą różnych barwników CellTracker może być z powodzeniem stosowane do przeprowadzania konkurencyjnych badań populacyjnych w celu oceny bezpośredniej roli określonych genów w transporcie neutrofili z krwi do tkanek docelowych in vivo.
Wprowadzenie
Neutrofile to najliczniejsze leukocyty u ludzi. Są głównym składnikiem komórkowym wrodzonego układu odpornościowego i działają jako pierwsza linia obrony przed inwazją mikroorganizmów. U pacjentów z nabytą neutropenią i pierwotnymi niedoborami odporności, które wpływają na liczbę i/lub funkcję neutrofili, rozwijają się zagrażające życiu inwazyjne infekcje bakteryjne i grzybicze, co podkreśla znaczenie tych komórek w obronie gospodarza 1. Immunologiczne rozpoznanie atakujących patogenów w miejscu infekcji przez ich pokrewne receptory rozpoznające wzorce powoduje indukcję zaaranżowanej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, która prowadzi do wydzielania chemoa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy
- Eutanazja myszy przy użyciu zatwierdzonego przez komisję ds. opieki nad zwierzętami protokołu i spryskanie powierzchni zwierzęcia 70% etanolem.
- Wykonaj nacięcie skóry w środkowej części brzucha i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą kończyny dolne.
- Odetnij mięśnie kończyn dolnych za pomocą nożyczek i ostrożnie zwichnij panewkę ze stawu biodrowego, unikając złamania głowy kości udowej.
- Usuń pozostałe mięśnie z kości udowej i piszczelowej za pomocą skalpela i nożyczek i oddziel kość udową od piszczelowej w stawie kolanowym, zachowując ostrożność, aby nie złamać ko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem pozyskiwania komórek szpiku kostnego myszy oraz późniejszej separacji neutrofili z tych komórek za pomocą wirowania w gradiencie gęstości przy użyciu dostępnych komercyjnie mediów do separacji komórek Histopaque. Neutrofile wyizolowane tą metodą mogą być wykorzystane w różnych funkcjonalnych badaniach ex vivo oraz w eksperymentach z transferem adoptywnym do myszy biorców.
Typowa wydajność pozyskiwania komórek szpiku kostnego z obu ko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym artykule przedstawiamy niezawodny, prosty, szybki i ekonomiczny protokół izolacji dużej liczby neutrofili ze szpiku kostnego myszy o wysokiej czystości i żywotności przy użyciu podejścia wirowania w gradiacji gęstości. Gdy ten protokół zostanie wykonany poprawnie, od niezakażonej myszy można odzyskać ~6-12 × 106 neutrofili, a po zakażeniu od myszy można wyizolować nawet ~30-40 ×106 neutrofili 6. Wyizolowane neutrofile są czyste w 80-95% i >95% żywotne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Wydział Badań Wewnętrznych Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH), USA.
Wszystkie myszy były utrzymywane w akredytowanym przez American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care obiekcie w Narodowym Instytucie Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) i trzymane zgodnie z procedurami opisanymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych pod auspicjami protokołu zatwierdzonego przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIAID.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| RPMI 1640 1X z L-glutaminą i 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Płodowa surowica bydlęca (inaktywowana termicznie) | GemCell | 100500 | |
| Penicylina/Streptomycyna (10 000 jednostek penicyliny / 10 000 mg/ml paciorkowca) | GIBCO | 15140 | |
| 0,5 m EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0,2% i 1,6% chlorek sodu | JT Baker | 3624 | Roztwory chlorku sodu przygotowane przy użyciu wody destylowanej i sterylnie przefiltrowane |
| Sterylne przefiltrowane Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 należy doprowadzić do 18-26 ° C przed użyciem |
| Sterylny filtrowany Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 należy doprowadzić do 18-26 ° C przed użyciem |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu | Cellgro | 210-40-CV | |
| Alkohol etylowy (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, dioctan 5-chlorometylofluoresceiny) | Invitrogen | C-7025 | Sporządzać roztwory podstawowe 10 mM w DMSO, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 & stopni; C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(i 6)-4-chlorometylobenzoiloaminoaminotetrametylorodamina) | Invitrogen | C-2927 | Przygotować roztwory podstawowe 10 mM w DMSO, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 ° C |
| Anty-mysz CD45 (klon 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anty-mysz Ly6G (klon 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anty-mysz Ly6G (Klon 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anty-mysz CD11b (klon M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anty-mysz CD16 / CD32 (mysz BD Fc Block) | BD Pharmingen 553141 | Stosować w rozcieńczeniu 1:100 | |
| ŻYWY/MARTWY Zestaw do naprawy niebieskich martwych komórek | Sondy molekularne | L-23105 | Stosować w rozcieńczeniu 1:1000 |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Tabela 1. Odczynniki do izolacji, znakowania i śledzenia neutrofili przenoszonych adoptująco. | |||
| Materiały | |||
| C57BL/6 myszy | Taconic | ||
| Probówki wirówkowe 15 ml | Corning | 430053 | |
| Probówki wirówkowe 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| Pipety serologiczne 25 ml | Celltreat | 229225B | |
| Pipety serologiczne 10 ml | Celltreat | 229210B | |
| Pipety serologiczne 5 ml | Celltreat | 229205B | |
| Pipety Pasteura (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| Strzykawki 12 ml | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 cala Igły (precyzyjne igły ślizgowe) | BD | 305122 | |
| Sitka do komórek 100 mm | BD Falcon | 352360 | |
| Bakteriobójcze szalki Petriego | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Narzędzia preparacyjne dla myszy (nożyczki, kleszcze, skalpel) | Instrumenty do badań biomedycznych | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Narzędzia sterylizowane przed użyciem |
| Equipment | |||
| Kaptur do hodowli tkankowych | The Baker Company | SG403 | |
| Wirówka z chłodzeniem | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 &stopnie; C Kąpiel wodna wstrząsająca | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Tabela 2. Lista materiałów i sprzętu użytych w tym protokole. |
Bibliografia
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
