Artykuł metodologiczny

Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

DOI:

10.3791/50586

⸱

10 lipca 2013

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są krytycznymi komórkami efektorowymi wrodzonego układu odpornościowego. Są one szybko rekrutowane w miejscach ostrego stanu zapalnego i wywierają działanie ochronne lub patogenne w zależności od środowiska zapalnego. Niemniej jednak, pomimo nieodzownej roli neutrofili w odporności, nadal brakuje szczegółowego zrozumienia czynników molekularnych, które pośredniczą w efektorowym i immunopatogennym działaniu neutrofili w różnych chorobach zakaźnych i stanach zapalnych, częściowo z powodu ich krótkiego okresu półtrwania, trudności z obchodzeniem się z tymi komórkami oraz braku wiarygodnych protokołów eksperymentalnych w celu uzyskania wystarczającej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych i adopcyjnych eksperymenty transferowe. Dlatego proste, szybkie, ekonomiczne i niezawodne metody są wysoce pożądane w celu zebrania wystarczającej liczby neutrofili myszy do oceny funkcji takich jak fagocytoza, zabijanie, produkcja cytokin, degranulacja i transport. W tym celu przedstawiamy powtarzalny protokół wirowania w gradionym gradicynie gęstości, który można zaadaptować w dowolnym laboratorium do izolowania dużej liczby neutrofili ze szpiku kostnego myszy o wysokiej czystości i żywotności. Ponadto przedstawiamy prosty protokół, który wykorzystuje barwniki CellTracker do znakowania wyizolowanych neutrofili, które można następnie adoptywnie przenieść do myszy biorców i śledzić w kilku tkankach przez co najmniej 4 godziny po transferze za pomocą cytometrii przepływowej. Korzystając z tego podejścia, różnicowe znakowanie neutrofili od myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem genów za pomocą różnych barwników CellTracker może być z powodzeniem stosowane do przeprowadzania konkurencyjnych badań populacyjnych w celu oceny bezpośredniej roli określonych genów w transporcie neutrofili z krwi do tkanek docelowych in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile to najliczniejsze leukocyty u ludzi. Są głównym składnikiem komórkowym wrodzonego układu odpornościowego i działają jako pierwsza linia obrony przed inwazją mikroorganizmów. U pacjentów z nabytą neutropenią i pierwotnymi niedoborami odporności, które wpływają na liczbę i/lub funkcję neutrofili, rozwijają się zagrażające życiu inwazyjne infekcje bakteryjne i grzybicze, co podkreśla znaczenie tych komórek w obronie gospodarza 1. Immunologiczne rozpoznanie atakujących patogenów w miejscu infekcji przez ich pokrewne receptory rozpoznające wzorce powoduje indukcję zaaranżowanej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, która prowadzi do wydzielania chemoatraktantów, które generują gradient chemotaktyczny zdolny do rekrutacji neutrofili z krwiobiegu do tkanki objętej stanem zapalnym 2. Po tym, jak neutrofile dostaną się do miejsca infekcji, ulegają aktywacji, co prowadzi do produkcji cytokin i chemokin, wychwytu patogenu i zabijania za pomocą mechanizmów oksydacyjnych i nieoksydacyjnych 3. Oprócz dobrze rozpoznanej roli w odporności wrodzonej, ostatnio wykazano również, że neutrofile odgrywają ważną rolę jako inicjatorzy skutecznych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych 4. Z drugiej strony, oprócz ich ochronnych ról w odporności, neutrofile mogą również pośredniczyć w uszkodzeniu tkanek i immunopatologii z powodu nadmiernej akumulacji i/lub aktywacji w miejscach zapalenia, jak wykazano w różnych chorobach zakaźnych i autoimmunologicznych 5-7.

Pomimo nieodzownej roli neutrofili w budowaniu skutecznych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych i ich plejotropowych funkcji efektorowych w wielu chorobach zakaźnych i stanach zapalnych, trudności techniczne z obsługą tych komórek i brak wiarygodnych protokołów eksperymentalnych utrudniały badania nad neutrofilami przez ostatnie dziesięciolecia. W związku z tym zastosowanie powtarzalnych testów do izolacji neutrofili powinno ułatwić dalsze badania nad funkcjami immunologicznymi za pośrednictwem neutrofili ex vivo i in vivo. Do tej pory opisano kilka metod izolacji neutrofili, takich jak wirowanie w gradionym spadku gęstości krwi ludzkiej i krwi myszy lub szpiku kostnego 8,9, dodatnie lub ujemne immunomagnetyczne wzbogacanie neutrofili z krwi myszy lub szpiku kostnego 10,11 oraz pobieranie neutrofili z jamy otrzewnowej myszy po dootrzewnowym wstrzyknięciu tioglikolanu lub innych czynników zapalnych 12. Chociaż neutrofile można łatwo wyizolować w dużych ilościach z ludzkiej krwi, metoda ta jest nieoptymalna u myszy ze względu na ograniczoną objętość krwi myszy, która wyklucza izolację wystarczającej ilości neutrofili do badań funkcjonalnych lub eksperymentów z transferem adoptywnym 13. Ponadto, chociaż wydajność komórek wywołanych tioglikolanem z jamy otrzewnej jest większa w porównaniu z krwią myszy, czystość neutrofili w zapalnym płukaniu otrzewnowej waha się w granicach 60-90%, a izolowane neutrofile wykazują aktywowany fenotyp. Tak więc komórki pobrane tą metodą mogą być wykorzystane tylko do przeprowadzenia badań funkcjonalnych aktywowanych, ale nie niestymulowanych neutrofili, ponieważ jama otrzewnej myszy ma niewiele neutrofili w stanie stacjonarnym 12. Zamiast tego szpik kostny jest wygodnym rezerwuarem do zbierania dużej liczby niestymulowanych lub aktywowanych neutrofili 11,14, które można następnie wykorzystać do dalszych badań funkcjonalnych, takich jak fagocytoza, zabijanie i degranulacja, lub do adoptywnego transferu do myszy biorcy.

Tutaj opisujemy prosty i szybki (~ 2 godziny) protokół, który zapewnia wysoką wydajność (~6-12 × 10>6 neutrofili/niezakażona mysz, czyli do 30-40 × 106 neutrofili/zakażona mysz) czystych (80-95%) neutrofili o >95% żywotności ze szpiku kostnego. Metoda ta wykorzystuje dostępne na rynku Histopaque, które są pożywkami do separacji komórek w gradiencie gęstości składającymi się z Ficollu i ditrizoinianu sodu, do oddzielania neutrofili od szpiku kostnego myszy. Ta metoda daje znacznie większą liczbę neutrofili na mysz w porównaniu z krwią lub jamą otrzewną, może być stosowana do zbierania neutrofili od myszy zarówno w stanie stacjonarnym, jak i po infekcji, i jest łatwiejsza do nakładania warstw w porównaniu z metodą wirowania w gradionym gradifikacji gęstości, która wykorzystuje nieciągłe gradienty Percoll składające się z 55%/65%/75% Percollu w PBS 9. Ponadto czas i zasoby wymagane do zebrania czystych neutrofili są znacznie zmniejszone w porównaniu z izolacją neutrofili przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Ponadto, ponieważ metoda ta nie obejmuje etapu wzbogacania immunomagnetycznego, jest bardziej opłacalna i pozwala uniknąć narażenia komórek na kolumnę magnetyczną i przeciwciała, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo aktywacji neutrofili

.

Oprócz przeprowadzania badań funkcjonalnych izolowanych neutrofili ex vivo i adoptywnego transferu komórek do myszy biorców, protokół ten opisuje również metodę znakowania wyizolowanych neutrofili przy użyciu różnych barwników CellTracker. Różnicowe znakowanie neutrofili od myszy o różnym pochodzeniu genetycznym można zaadaptować w konkurencyjnych badaniach populacyjnych do śledzenia przenoszonych neutrofili w tkankach myszy biorców za pomocą cytometrii przepływowej, co może dostarczyć mechanistycznego wglądu w bezpośrednią rolę określonych genów w transporcie neutrofili z krwi do docelowych narządów objętych stanem zapalnym 6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy

  1. Eutanazja myszy przy użyciu zatwierdzonego przez komisję ds. opieki nad zwierzętami protokołu i spryskanie powierzchni zwierzęcia 70% etanolem.
  2. Wykonaj nacięcie skóry w środkowej części brzucha i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą kończyny dolne.
  3. Odetnij mięśnie kończyn dolnych za pomocą nożyczek i ostrożnie zwichnij panewkę ze stawu biodrowego, unikając złamania głowy kości udowej.
  4. Usuń pozostałe mięśnie z kości udowej i piszczelowej za pomocą skalpela i nożyczek i oddziel kość udową od piszczelowej w stawie kolanowym, zachowując ostrożność, aby nie złamać końców kości. Umieść kości na szalce Petriego zawierającej lodowaty RPMI 1640 1X uzupełniony 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
  5. Przejdź do kolejnych kroków pod kapturem do hodowli tkankowej. Podejmij dodatkowe środki ostrożności, aby utrzymać ścisłe techniki sterylne, aby uniknąć aktywacji neutrofili
    6. .
  6. Opłucz każdą kość 70% etanolem (na szalce Petriego), a następnie wykonaj trzy kolejne płukania w lodowato zimnym sterylnym PBS (na szalkach Petriego), aby spłukać etanol z powierzchni kości.
  7. Wewnątrz czystej, sterylnej szalki Petriego odetnij nasady kości i odłóż je na bok.
  8. Użyj igły o rozmiarze 25 i strzykawki o pojemności 12 cm3 wypełnionej RPMI uzupełnionym 10% FBS i 2 mM EDTA, a następnie przepłucz komórki szpiku kostnego z obu końców trzonów kostnych do zakręcanej rurki Falcon o pojemności 50 ml wyposażonej w filtr 100 μm. Aby skutecznie usunąć wszystkie komórki, zeskrob wewnętrzną powierzchnię kości za pomocą igły o rozmiarze 25.

UWAGA: Blanszowanie kości wskazuje, że komórki zostały wystarczająco zeskrobane.

UWAGA: Użyj około 10 ml pożywki do przepłukania pary kość udowa/piszczelowa. Dodanie EDTA do pożywki jest niezbędne, aby zapobiec zlepianiu się komórek.

  1. Nasady kostne należy przeciąć skalpelem na małe 0,5-1 mm3 kawałki i przebić je przez filtr 100 μm za pomocą tylnej końcówki pipety Eppendorf Combitip Plus Biopur o pojemności 2,5 ml.
  2. Wirować z prędkością 1 400 obr./min przez 7 min w temperaturze 4 °C.
  3. Poddać lizie czerwone krwinki, ponownie zawieszając osad komórkowy w 20 ml 0,2% NaCl na około 20 sekund, a następnie dodać 20 ml 1,6% NaCl. (Krytyczne: Nie przekraczaj 20-30 sekund hipotonicznej lizy, aby uniknąć śmierci komórek szpiku kostnego. Zaleca się stosowanie hipotonicznego NaCl do lizy zamiast buforu lizującego ACK, ponieważ ten ostatni ma potencjał do aktywacji neutrofili).
  4. Wirować przez 7 minut przy 1 400 obr./min w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek.
  5. Umyj komórki za pomocą RPMI 1640 1X uzupełnionego 10% FBS i 2 mM EDTA i odwiruj jak w kroku 1.12.
  6. Wydajność komórek szpiku kostnego przy użyciu tej metody wynosi około 60-80 milionów na niezakażoną 8-12 tygodniową mysz C57BL/6.

2. Rozdzielanie neutrofili przez wirowanie w gradimencie gęstości

  1. Policz komórki szpiku kostnego i ponownie zawieś w 1 ml lodowatego sterylnego PBS.
  2. Dodać 3 ml Histopaque 1119 (gęstość, 1,119 g/ml) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Nałożyć 3 ml Histopaque 1077 (gęstość, 1,077 g/ml) na 3 ml Histopaque 1119.

UWAGA: Histopaque 1119 i Histopaque 1077 powinny być podgrzane do 18-26 °C przed użyciem.

Krytyczny krok: Przygotuj gradienty bezpośrednio przed użyciem, ponieważ wcześniejsze przygotowanie gradientu spowoduje dyfuzję między dwiema warstwami oraz nieoptymalną czystość i odzysk neutrofili.

Krytyczny krok: Nakładanie Histopaque 1077 na 1119 musi być wykonywane powoli, aby uniknąć mieszania dwóch gęstości, co uniemożliwi separację komórek podczas wirowania.

  1. Nałóż zawiesinę komórek szpiku kostnego na wierzch Histopaque 1077.

Krytyczny krok: Nakładanie zawiesiny komórek szpiku kostnego na Histopaque 1077 musi być wykonywane powoli, aby uniknąć zakłócenia interfejsu między komórkami a Histopaque 1077.

UWAGA: Ponowne zawieszenie komórek szpiku kostnego niezakażonej myszy w 1 ml PBS daje czystość neutrofili na poziomie >90%. Jednak łączenie wielu próbek szpiku kostnego pogarsza czystość neutrofili; na przykład ponowne zawieszenie 300 x 10>6 komórek w 3 ml PBS zmniejsza czystość neutrofili z >90% do ~80%. Dlatego badacze powinni przeprowadzać eksperymenty pilotażowe, aby zidentyfikować idealne warunki liczby/objętości komórek dla swoich konkretnych eksperymentów

  1. Wirować przez 30 minut przy 2 000 obr./min w temperaturze 25 °C bez hamulca.

UWAGA: Wirowanie gradientu w temperaturze pokojowej jest krytyczne i niezbędne do skutecznego oddzielania neutrofili.

  1. Zbierz neutrofile na granicy warstw Histopaque 1119 i Histopaque 1077.
  2. Zebrane neutrofile przemyć dwukrotnie za pomocą RPMI 1640 1X uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i odwirować z prędkością 1 400 obr./min przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Policz neutrofile i określ ich żywotność.

UWAGA: Neutrofile są zazwyczaj >95% żywotne i >90% czyste, jak określono za pomocą analizy FACS. Typowa wydajność neutrofili ze szpiku kostnego (>tj. 2 kości udowej i 2 kości piszczelowej) niezakażonej 8-12 tygodniowej myszy C57BL/6 wynosi ~6-12 milionów komórek. Liczba ta jest znacznie większa, gdy neutrofile są pobierane ze szpiku kostnego zakażonych zwierząt. W związku z tym odzyskano ~ 30-40 milionów neutrofili / myszy, gdy myszy zakażone Candida zostały użyte do pobrania komórek 6.

3. Znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker

  1. Zawiesić neutrofile w stężeniach 5 x 106 komórek/ml w PBS podgrzanym w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać barwnik CellTracker o końcowym stężeniu 5 μM.

UWAGA: CellTracker Green (CMFDA (5-Chloromethylfluoresceina Diacetate) i CellTracker Orange (CMTMR (5-(and-6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) został użyty w tym protokole do zróżnicowanego oznaczania neutrofili od myszy typu dzikiego i z niedoborem genu.

UWAGA: Przygotuj roztwór podstawowy 10 mM CellTracker Green i CellTracker Orange, podwielokrotność, i przechowuj w temperaturze -80 °C do dnia eksperymentu.

  1. Inkubować neutrofile z 5 μM odpowiedniego barwnika CellTracker przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z wytrząsaniem w ciemności.
  2. Umyj komórki dwukrotnie lodowatym RPMI 1640 1X uzupełnionym o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.

UWAGA: Skuteczne mycie komórek po etapie etykietowania za pomocą barwnika CellTracker jest niezbędne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego barwnikiem przed mieszaniem różnie znakowanych populacji neutrofili do dalszych konkurencyjnych badań populacyjnych.

4. Adoptywny transfer neutrofili u myszy i analiza przeniesionych neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zawiesić neutrofile w lodowatym PBS o stężeniu 25 x 106 komórek/ml i wstrzyknąć 200 μl zawiesiny do żyły ogonowej bocznej, tak aby na mysz przeniesiono 5 x 106 neutrofili. W przypadku konkurencyjnych badań nad ponownym populacją neutrofili, należy zmieszać neutrofile typu dzikiego i neutrofile z niedoborem genu w stosunku 1:1 i wstrzyknąć łącznie 5 x 106 neutrofili na mysz, jak powyżej.

UWAGA: Co najmniej do 10 x10 6 neutrofili może być adoptywnie przeniesionych na mysz bez oczywistej natychmiastowej toksyczności dla zwierząt.

  1. W różnych momentach po przeniesieniu adopcyjnym (np. 1, 2, 3 lub 4 godziny po przeniesieniu) należy poddać myszy eutanazji i pobrać krew i/lub szpik kostny i/lub inne narządy docelowe będące przedmiotem zainteresowania.
  2. Przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z tych tkanek do analizy ilościowej i jakościowej adoptywnie przeniesionych znakowanych neutrofili przy użyciu opublikowanych protokołów 6,15.
  3. Po barwieniu żywotności żywej/martwej i blokadzie Fc, oznacz komórki CD45 (klon 30-F11), Ly6G (klon 1A8) i CD11b (klon M1 / 70) i bramkę na żywych neutrofilach CD45 + Ly6G + CD11b +. Neutrofile w tej bramce obejmują natywne neutrofile myszy biorcy, a także adoptywnie przeniesione znakowane neutrofile, które są FITC+ (jeśli są oznaczone CellTracker Green) lub PE+ (jeśli są oznaczone Cell Tracker Orange).

UWAGA: Neutrofile mogą być śledzone we krwi, szpiku kostnym i nerkach myszy zakażonych Candida przez co najmniej 4 godziny po transferze.

UWAGA: Utrwalenie 2% paraformaldehydu w PBS nie wpływa negatywnie na średnią intensywność fluorescencji neutrofili oznaczonych CellTracker Green lub CellTracker Orange przez co najmniej 48 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem pozyskiwania komórek szpiku kostnego myszy oraz późniejszej separacji neutrofili z tych komórek za pomocą wirowania w gradiencie gęstości przy użyciu dostępnych komercyjnie mediów do separacji komórek Histopaque. Neutrofile wyizolowane tą metodą mogą być wykorzystane w różnych funkcjonalnych badaniach ex vivo oraz w eksperymentach z transferem adoptywnym do myszy biorców.

Typowa wydajność pozyskiwania komórek szpiku kostnego z obu ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule przedstawiamy niezawodny, prosty, szybki i ekonomiczny protokół izolacji dużej liczby neutrofili ze szpiku kostnego myszy o wysokiej czystości i żywotności przy użyciu podejścia wirowania w gradiacji gęstości. Gdy ten protokół zostanie wykonany poprawnie, od niezakażonej myszy można odzyskać ~6-12 × 106 neutrofili, a po zakażeniu od myszy można wyizolować nawet ~30-40 ×106 neutrofili 6. Wyizolowane neutrofile są czyste w 80-95% i >95% żywotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Wydział Badań Wewnętrznych Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH), USA.

Wszystkie myszy były utrzymywane w akredytowanym przez American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care obiekcie w Narodowym Instytucie Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) i trzymane zgodnie z procedurami opisanymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych pod auspicjami protokołu zatwierdzonego przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania NIAID.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 Reodczynniki
RPMI 1640 1X z L-glutaminą i 25 mM HEPESCellgro10-041-CV 
Płodowa surowica bydlęca (inaktywowana termicznie)GemCell100500 
Penicylina/Streptomycyna (10 000 jednostek penicyliny / 10 000 mg/ml paciorkowca)GIBCO15140 
0,5 m EDTAQuality Biological Inc351-027-101 
0,2% i 1,6% chlorek soduJT Baker3624Roztwory chlorku sodu przygotowane przy użyciu wody destylowanej i sterylnie przefiltrowane
Sterylne przefiltrowane Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077 należy doprowadzić do 18-26 ° C przed użyciem
Sterylny filtrowany Histopaque 1119Sigma11191Histopaque 1119 należy doprowadzić do 18-26 ° C przed użyciem
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezuCellgro210-40-CV 
Alkohol etylowy (200 proof)The Warner Graham Company64-17-5 
CellTracker Green (CMFDA, dioctan 5-chlorometylofluoresceiny)InvitrogenC-7025Sporządzać roztwory podstawowe 10 mM w DMSO, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 & stopni; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(i 6)-4-chlorometylobenzoiloaminoaminotetrametylorodamina)InvitrogenC-2927Przygotować roztwory podstawowe 10 mM w DMSO, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 ° C
Anty-mysz CD45 (klon 30-F11)eBioscience170451-82 
Anty-mysz Ly6G (klon 1A8)BD Pharmingen551461 
Anty-mysz Ly6G (Klon 1A8)BD Pharmingen560599 
Anty-mysz CD11b (klon M1/70)eBioscience47-0112-82 
Anty-mysz CD16 / CD32 (mysz BD Fc Block)BD Pharmingen 553141Stosować w rozcieńczeniu 1:100
ŻYWY/MARTWY Zestaw do naprawy niebieskich martwych komórekSondy molekularneL-23105Stosować w rozcieńczeniu 1:1000
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma67-68-5 
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBSUSB Corporation19943 
 Tabela 1. Odczynniki do izolacji, znakowania i śledzenia neutrofili przenoszonych adoptująco.
 Materiały
C57BL/6 myszyTaconic 
Probówki wirówkowe 15 mlCorning430053 
Probówki wirówkowe 50 mlBD Falcon352070 
Pipety serologiczne 25 mlCelltreat229225B 
Pipety serologiczne 10 mlCelltreat229210B 
Pipety serologiczne 5 mlCelltreat229205B 
Pipety Pasteura (3 ml)BD Falcon357575 
Strzykawki 12 mlKendall monoject512878 
25 G x 5/8 cala Igły (precyzyjne igły ślizgowe)BD305122 
Sitka do komórek 100 mmBD Falcon352360 
Bakteriobójcze szalki PetriegoBD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
Narzędzia preparacyjne dla myszy (nożyczki, kleszcze, skalpel)Instrumenty do badań biomedycznych10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000Narzędzia sterylizowane przed użyciem
 Equipment
Kaptur do hodowli tkankowychThe Baker CompanySG403 
Wirówka z chłodzeniemThermo Fischer Scientific75004521 
37 &stopnie; C Kąpiel wodna wstrząsającaThermo Fischer Scientific3166721 
 Tabela 2. Lista materiałów i sprzętu użytych w tym protokole.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
  4. Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
  5. Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  6. Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  7. Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
  8. Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  9. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  10. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  11. Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  12. Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
  13. Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
  14. Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
  15. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
  16. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  18. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  19. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658(2012).
  20. Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
  21. Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
  22. Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
  23. Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Centryfugacja w gradiencie g sto ciznakowanie Cell Trackeremanaliza cytometrycznalizja erytrocyt wgradient Histopaquebadania konkurencyjnej repopulacjiizolacja szpiku kostnego myszybadania funkcjonalne neutrofili

Powiązane artykuły