Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby ułatwić strukturalne i dynamiczne badania kompleksów sygnalizacyjnych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), potrzebne są nowe podejścia do wprowadzania do receptorów informacyjnych sond lub etykiet, które nie zaburzają funkcji receptora. Użyliśmy technologii supresji kodonów bursztynowych do genetycznego kodowania nienaturalnego aminokwasu, p-azydo-L-fenyloalaniny (azF) w różnych docelowych pozycjach w GPCR heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków. Wszechstronność grupy azydologicznej jest zilustrowana tutaj w różnych zastosowaniach do badania GPCR w ich naturalnym środowisku komórkowym lub w warunkach rozpuszczalnych w detergentach. Po pierwsze, demonstrujemy opartą na komórkach technologię celowanego fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR, w której małocząsteczkowy ligand znakowany trytem jest sieciowany z genetycznie kodowanym aminokwasem azydo. Następnie demonstrujemy specyficzną dla miejsca modyfikację GPCR przez bioortogonalną reakcję ligacji Staudingera-Bertozziego, która jest ukierunkowana na grupę azydonową przy użyciu pochodnych fosfiny. Omawiamy ogólną strategię celowanego znakowania peptydowo-epitopowego ekspresji białek błonowych w hodowli i jej wykrywania przy użyciu podejścia ELISA opartego na całej komórce. Na koniec pokazujemy, że azF-GPCR można selektywnie znakować za pomocą sond fluorescencyjnych. Omawiane metodologie są ogólne, w tym sensie, że w zasadzie można je zastosować do dowolnej pozycji aminokwasu w dowolnym wyrażonym GPCR w celu zbadania aktywnych kompleksów sygnałowych.
Wprowadzenie
Heptahelical G-coupled protein-coupled receptors (GPCRs) to nadrodzina wysoce dynamicznych białek błonowych, które pośredniczą w ważnych i różnorodnych sygnałach zewnątrzkomórkowych. W klasycznym paradygmacie aktywacja receptora jest sprzężona ze zmianami konformacyjnymi wywołanymi przez ligand. 1, 2 Niedawne postępy w biologii strukturalnej GPCR dostarczyły istotnych informacji na temat mechanizmów molekularnych sygnalizacji transbłonowej. 3-5 Jednak, aby zrozumieć z większą precyzją chemiczną mechanizm funkcjonalny i dynamikę strukturalną sygnalizacji GPCR, potrzebny jest zestaw podejść do włączenia informacyjnych sond molekularnych i chemiczny....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Specyficzne dla danego miejsca genetyczne włączenie nienaturalnych aminokwasów do GPCR
- Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM (4,5 g/L glukozy, 2 mM glutaminy) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Transfekcję komórek wyhodowanych do 60-80% zbiegu na 10-centymetrowej płytce za pomocą odczynnika Lipofectamine Plus.
- Do 750 μl DMEM dodać 10 μl Plus odczynnika, 3,5 μg gDNA GPCR (pMT4. Rho lub pcDNA 3.1. CCR5) zawierające bursztynowy kodon stop w pożądanej pozycji, 3,5 μg supresorowego cDNA tRNA (pSVB.Yam) i 0,35 μg zmutowanego cDNA syntetazy amino-acylowej tRNA dla p-azydo-L-fenyl....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zastosowaliśmy metodologię mutagenezy z użyciem nienaturalnych aminokwasów w celu specyficznego dla miejsca wprowadzenia sond molekularnych do GPCR, wykorzystując technologię supresji kodonu bursztynowego. Schemat na Rysunku 1 przedstawia kluczowe etapy tej metodologii oraz różnorodne zastosowania włączania wszechstronnego UAA, p-azydofenyloalaniny (azF), do GPCR. Ekspresja azF-GPCR w komórkach ssaków umożliwia ukierunkowane fotousieciowanie z ligandami, a także celowane znakowanie epitopami pep.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy tutaj solidną metodologię specyficznego dla danego miejsca włączenia sondy reaktywnej azF do GPCR i demonstrujemy trzy użyteczne zastosowania tego narzędzia do badania struktury i dynamiki GPCR. Nasza metoda specyficznego dla danego miejsca włączenia UAA omija podstawowy problem dzięki alternatywnej strategii opartej na chemicznym znakowaniu32, 33 lub dołączaniu fotocrosslinkerów34 do pojedynczego dostępnego mutanta cysteiny. Chociaż substancje chemiczne, które celują w grupy tiolowe cyste.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy za hojne wsparcie kilku fundacji i darczyńców filantropijnych (zobacz SakmarLab.org).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Plazmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plazmid pcDNA.RS dla azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plazmidy pMT4.Rho i pcDNA 3.1.CCR5 | Opcjonalnie zawierają bursztynowy kodon stop (TAG) w żądanej pozycji | ||
| Komórki | Komórki adherentne | ||
| Zmodyfikowane podłoże Orła firmy Dulbecco (DMEM) | Gibco | Numer katalogowy: 10566 | |
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami | Gibco | 14200 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamina: 18324-012 Plus: 11514-015 | |
| p-azido-L-fenyloalanina | Chem-Impex International | 6162 | |
| Tabela 1. Specyficzna dla miejsca genetyczna inkorporacja nienaturalnych aminokwasów do materiałów GPCR | |||
| Lampa UV-A Maxima ML-3500S | Spectronics Corporation | azF jest aktywowana przez 365-nm | |
| światło Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Roche | 3117405001 | |
| znakowany trytem | Od współpracownika (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozyd | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sefaroza żywica | 1D4 mAb unieruchomiona na sefarozie aktywowanej CNBr żywica 2B | ||
| 1% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% żele SDS | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE wykonywane na aparacie NuPAGE |
| Aparat Trans-Blot SD | Biorad | Aparat do transferu półsuchego | |
| Immobilon membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | |
| Mleko beztłuszczowe | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Płyn scyntylacyjny |
| Fiolki scyntylacyjne | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Licznik scyntylacyjny do płynów | Perkin Elmer | Licznik beta-scyntylacyjny | |
| Anty-rodopsyna 1D4 mAb | Narodowe Centrum Hodowli Komórkowych | custom | |
| Anty-mysia peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona z IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne | Thermo Scientific | 34080 | |
| Folia Hyblot CL AR | Denville | E3018 | |
| Tabela 2. Ukierunkowane materiały fotosieciujące | |||
| 0,25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAGA-triarylofosfina | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAGA mAb | Sigma | F1804 | |
| anty-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poli-D-lizyna | Sigma | P6407 | |
| Płytka 96-dołkowa | Costar | 3601 | Przezroczyste dno, wysoko wiążące |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami EIA/RIA (wapń, magnez) | Gibco | 14040 | |
| 16% paraformaldehyd | EMS | 28908 | |
| Sprzężona z HRP | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anty-królicze IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Nadtlenek wodoru | DE Produkty zdrowotne | 97-93399 | |
| Fluorescencyjny czytnik płytek wielodołkowych CytoFluor II | Perseptive Biosystems | ||
| Tabela 3. Ukierunkowane znakowanie peptydowo-epitopowe i materiały ELISA na powierzchni komórki | |||
| Fluoresceina-fosfina | (Huber et al., przedłożone w 2012 r.) | ||
| Nonapeptide (peptyd C9) | AnaSpec | 62190 | Peptyd naśladujący 1D4-epitop NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozyd | Anatrace | D310LA | |
| Żywica 1D4-sefarozy | 1D4 mAb unieruchomiona na sefarozie aktywowanej CNBr Żywica 2B | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% żele SDS | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE wykonywane na aparacie NuPAGE |
| Skaner fluorescencyjny Confocal Typhoon 9400 | GE Healthcare | wycofany z produkcji | Skaner z laserem o długości fali 488 nm |
| Tabela 4. Fluorescencyjne materiały do etykietowania |
Bibliografia
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
