Artykuł metodologiczny

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50588

⸱

13 września 2013

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Chemical Biology and Signal Transduction, The Rockefeller University

W tym artykule

Podsumowanie

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Streszczenie

Aby ułatwić strukturalne i dynamiczne badania kompleksów sygnalizacyjnych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), potrzebne są nowe podejścia do wprowadzania do receptorów informacyjnych sond lub etykiet, które nie zaburzają funkcji receptora. Użyliśmy technologii supresji kodonów bursztynowych do genetycznego kodowania nienaturalnego aminokwasu, p-azydo-L-fenyloalaniny (azF) w różnych docelowych pozycjach w GPCR heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków. Wszechstronność grupy azydologicznej jest zilustrowana tutaj w różnych zastosowaniach do badania GPCR w ich naturalnym środowisku komórkowym lub w warunkach rozpuszczalnych w detergentach. Po pierwsze, demonstrujemy opartą na komórkach technologię celowanego fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR, w której małocząsteczkowy ligand znakowany trytem jest sieciowany z genetycznie kodowanym aminokwasem azydo. Następnie demonstrujemy specyficzną dla miejsca modyfikację GPCR przez bioortogonalną reakcję ligacji Staudingera-Bertozziego, która jest ukierunkowana na grupę azydonową przy użyciu pochodnych fosfiny. Omawiamy ogólną strategię celowanego znakowania peptydowo-epitopowego ekspresji białek błonowych w hodowli i jej wykrywania przy użyciu podejścia ELISA opartego na całej komórce. Na koniec pokazujemy, że azF-GPCR można selektywnie znakować za pomocą sond fluorescencyjnych. Omawiane metodologie są ogólne, w tym sensie, że w zasadzie można je zastosować do dowolnej pozycji aminokwasu w dowolnym wyrażonym GPCR w celu zbadania aktywnych kompleksów sygnałowych.

Wprowadzenie

Heptahelical G-coupled protein-coupled receptors (GPCRs) to nadrodzina wysoce dynamicznych białek błonowych, które pośredniczą w ważnych i różnorodnych sygnałach zewnątrzkomórkowych. W klasycznym paradygmacie aktywacja receptora jest sprzężona ze zmianami konformacyjnymi wywołanymi przez ligand. 1, 2 Niedawne postępy w biologii strukturalnej GPCR dostarczyły istotnych informacji na temat mechanizmów molekularnych sygnalizacji transbłonowej. 3-5 Jednak, aby zrozumieć z większą precyzją chemiczną mechanizm funkcjonalny i dynamikę strukturalną sygnalizacji GPCR, potrzebny jest zestaw podejść do włączenia informacyjnych sond molekularnych i chemicznych do badania aktywnych kompleksów sygnalizacyjnych.

W tym celu dostosowaliśmy metodę wprowadzania do receptorów ekspresji sond niezakłócających lub minimalnie zakłócających w oparciu o mutagenezę nienaturalnych aminokwasów (UAA) przy użyciu technologii tłumienia kodonów bursztynowych, wcześniej zapoczątkowanej przez Schultza i współpracowników. 6 Zoptymalizowaliśmy metodologię mutagenezy UAA, aby osiągnąć wysokowydajny system ekspresji i mutagenezy dla białek takich jak GPCR, które są trudne do ekspresji w większości systemów heterologicznych innych niż komórki ssaków. Używając ortogonalnie zmodyfikowanego supresorowego tRNA i wyewoluowanej pary syntetazy aminoacylo-tRNA dla określonego UAA, wprowadziliśmy UAA w miejscu specyficznym dla wyrażonych docelowych GPCR. Pomyślne włączenie UAA, p-acetylo-L-fenyloalaniny (AcF), p-benzoilo-L-fenyloalaniny (BzF) i p-azydo-L-fenyloalaniny (azF) wykazano w naszym modelu GPCR - rodopsyny i ludzkiego receptora chemokiny C-C, CCR5. 7, 8

Zasadniczo, UAA może być genetycznie kodowany w dowolnym miejscu w sekwencji białka, a ta właściwość jest nieocenionym narzędziem biochemicznym, ponieważ umożliwia skanowanie za pomocą pojedynczego kodonu docelowego GPCR. Skupiamy się tutaj w szczególności na wszechstronności UAA, azF, który ma reaktywne ugrupowanie azydologiczne. Oprócz tego, że służy jako unikalna sonda podczerwieni (IR), 9 azF może również służyć jako fotoaktywowany środek sieciujący poprzez reakcję z sąsiednimi aminami pierwszorzędowymi lub wodorami alifatycznymi. Dodatkowo, biologicznie obojętna grupa azydologiczna może uczestniczyć jako selektywny uchwyt chemiczny w bioortogonalnych reakcjach znakowania. W tym miejscu przedstawiamy przykłady ilustrujące użyteczne zastosowania specyficznego dla miejsca włączania azF do GPCR, takie jak celowane fotosieciowanie w celu wychwytywania kompleksu receptor-ligand oraz modyfikacja GPCR za pomocą bioortogonalnego znakowania epitopów i strategii znakowania fluorescencyjnego.

Odczynniki fotoaktywowane były używane do badania systemów biologicznych od lat 60.10 W tym okresie odnotowano obfitość eksperymentów z sieciowaniem receptor-ligand w celu zbadania kompleksów GPCR, z których większość obejmowała użycie ligandów fotopowinowactwa. 11, 12 Zastosowania te są jednak ograniczone technicznie, ponieważ wymagają syntezy ligandów posiadających grupę sieciującą. 13-15 Ponadto, ze względu na ugrupowanie sieciujące w ligandzie, trudno jest określić położenie usieciowania na GPCR. Wprowadzenie grup fotosieciujących jako UAA do białek przy użyciu technologii supresji kodonów bursztynowych jest cennym postępem. 16, 17 Opracowaliśmy technikę fotosieciowania w celu identyfikacji interfejsu wiązania na receptorze, który bierze udział w tworzeniu kompleksu receptor-ligand w żywych komórkach poprzez wprowadzenie grup fotolabilnych do GPCR.18, 19 Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół i metodę analizy danych w celu zastosowania tej ukierunkowanej technologii fotosieciowania w celu identyfikacji miejsca wiązania liganda drobnocząsteczkowego, trityowany marawirok, na CCR5. Metoda ta wykorzystuje precyzyjną kwantyfikację radioaktywnego uchwytu na ligandzie, a także zachowuje natywną strukturę chemiczną ligandu.

Techniki oparte na fluorescencji pomagają w precyzyjnym zrozumieniu strukturalnych podstaw aktywacji receptora poprzez bezpośrednie badanie stanu konformacyjnego receptora. 20, 21 Jednak techniki pozwalające na elastyczne wprowadzanie znaczników fluorescencyjnych do GPCR w zależności od miejsca są ograniczone. Jesteśmy zainteresowani zastosowaniem bioortogonalnych strategii modyfikacji chemicznej w celu ułatwienia wykrywania pojedynczych cząsteczek (SMD) kompleksów sygnałowych GPCR. 22 Grupa azydologiczna może uczestniczyć w bioortogonalnych chemiach, takich jak ligacja Staudingera-Bertozziego,23, 24 cykloaddycja azydkowo-alkinowa bez miedzi (SpAAC)25 i katalizowana miedzią cykloaddycja azydkowo-alkinowa (CuAAC). 26 Skupimy się tutaj na reakcji ligacji Staudingera-Bertozziego, która obejmuje specyficzną reakcję między azydkiem a fosfiną. Demonstrujemy zastosowanie dwóch różnych pochodnych fosfiny, sprzężonych z epitopem peptydu (peptyd FLAG) lub znacznikiem fluorescencyjnym (fluoresceina) w celu uzyskania specyficznej dla miejsca modyfikacji GPCR.

Wcześniej optymalizowaliśmy warunki do specyficznego dla miejsca oznaczania wariantów rodopsyny azF, korzystając ze struktury krystalicznej promieniowania rentgenowskiego i symulacji dynamicznych, aby wybrać miejsca docelowe, które są narażone na działanie rozpuszczalnika. 27, 28 Zilustrowaliśmy również możliwość uzyskania etykietowania bez tła za pomocą ligacji Staudingera-Bertozziego. 29 Demonstrujemy tutaj ogólną procedurę zastosowaną w celu uzyskania fluorescencyjnego znakowania receptora rozpuszczonego w detergentach, który jest unieruchomiony na matrycy powinowactwa immunologicznego, a następnie wizualizowany przez fluorescencję w żelu. Dodatkowo demonstrujemy użyteczne rozszerzenie tej strategii znakowania w celu zidentyfikowania pozycji podatnych na znakowanie na receptorze o nieznanej strukturze, CCR5. Odbywa się to przy użyciu ukierunkowanej strategii znakowania peptydów i epitopów, która opiera się na bioortogonalnej modyfikacji wariantów azF-GPCR w formacie o niskiej przepustowości opartej na komórkach. 30 Metoda ta wykorzystuje wieloetapowe właściwości wykrywania testu ELISA na powierzchni komórki do monitorowania zdarzeń etykietowania.

Metodologie, które tutaj omawiamy, są ogólne i w zasadzie mogą być stosowane do każdego GPCR włączonego do azF przy użyciu technologii tłumienia bursztynowych kodonów. W przedstawionych tutaj protokołach szczegółowo opisujemy etapy związane z ekspresją receptorów przyłączonych do UAA w komórkach ssaków, takich jak azF, przy użyciu metody nienaturalnej mutagenezy aminokwasów i ich późniejszych zastosowań w celu ułatwienia strukturalnych i dynamicznych badań GPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Specyficzne dla danego miejsca genetyczne włączenie nienaturalnych aminokwasów do GPCR

  1. Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM (4,5 g/L glukozy, 2 mM glutaminy) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  2. Transfekcję komórek wyhodowanych do 60-80% zbiegu na 10-centymetrowej płytce za pomocą odczynnika Lipofectamine Plus.
    1. Do 750 μl DMEM dodać 10 μl Plus odczynnika, 3,5 μg gDNA GPCR (pMT4. Rho lub pcDNA 3.1. CCR5) zawierające bursztynowy kodon stop w pożądanej pozycji, 3,5 μg supresorowego cDNA tRNA (pSVB.Yam) i 0,35 μg zmutowanego cDNA syntetazy amino-acylowej tRNA dla p-azydo-L-fenyloalaniny (pcDNA.RS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wykonaj również podobną transfekcję przy użyciu wt GPCR cDNA (niezawierającego bursztynowego kodonu stop), aby służyć jako kontrola. Dodać tę mieszaninę do 750 μl DMEM z 17 μl lipofektaminy. Po zrównoważeniu przez 15 minut w temperaturze pokojowej doprowadzić całkowitą objętość do 4 ml.
    2. Odessać pożywkę na 10-centymetrową płytkę, nanieść mieszaninę transfekcji na komórki i powrócić do 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Po 4-6 godzinach uzupełnij komórki 4 ml DMEM zawierającym 20% FBS i 1 mM azF.
  3. Następnego dnia zastąp pożywkę wzrostową DMEM zawierającym 10% FBS i 0,5 mM azF.
  4. Zbierz komórki 48 godzin po transfekcji, aby przeanalizować ekspresję lub przejść do procedur fotosieciowania lub etykietowania opisanych w poniższych sekcjach.
    1. Potwierdzić ekspresję mutanta bursztynu GPCR w obecności użytków rolnych w pożywce wzrostowej. Robimy to za pomocą zachodniej detekcji immunoblotów. Lizować osad komórkowy w 1% (w/v) dodecylo-β-D-maltozydzie (DDM) w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odwirować lizat przy 16 000 x g i rozpuścić supernatant w warunkach redukujących za pomocą SDS-PAGE. Przenieś do membrany PVDF i przeprowadź analizę immunoblot w celu wykrycia ekspresji receptora na całej długości za pomocą 1D4 mAb (National Cell Culture Center), który rozpoznaje zmodyfikowany epitop na C-końcu receptora. Rozdział 31

2. Mapowanie miejsca wiązania liganda za pomocą ukierunkowanego fotolinkowania

  1. 48 godzin po transfekcji, odessać pożywkę z komórek i zastąpić 4 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powrót do temperatury 37 °C na 15 minut.
  2. Ponownie zawieś komórki za pomocą 1x PBS i przenieś do probówki Falcon. Wirować z prędkością 1 500 obr./min przez 2 minuty w celu osadzenia komórek i zasysania supernatantu.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x buforowanym roztworze soli Hanka zawierającym 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA i trytytowany ligand w nasycającym stężeniu wiązania przez wymagany czas i temperaturę, aby zapewnić tworzenie kompleksu receptor-ligand.
  4. Przenieść zawiesinę komórek na płytkę 24- lub 96-dołkową w celu fotoaktywacji azF przy długości fali 365 nm (np. użyć lampy UV-A) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Utrzymać płytkę na lodzie, aby uniknąć podgrzewania próbki i lizy komórek.
  5. Przenieść komórki do probówki Eppendorfa, odwirować w celu osadzenia komórek, usunąć supernatant i przystąpić do analizy. Granulki można przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  6. Zawiesić osady komórkowe w buforze do lizy zawierającym 1% (w/v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 i inhibitory proteazy. Po 1-godzinnej inkubacji w temperaturze 4 °C odwirować lizat komórkowy przez 10 minut przy 16 000 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.
  7. Dodać żywicę 1D4 mAb-sefarozy 2B do supernatantu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w celu immunooczyszczania GPCR przy użyciu zmodyfikowanego epitopu C-końca 1D4 mAb. Następnego dnia przemyj kulki kilka razy buforem do lizy. Eluować próbki za pomocą 1% SDS w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem.
  8. Przenieść porcję eluentu do 15 ml fiolki zawierającej płyn scyntylacyjny i policzyć licznik scyntylacji beta w celu ilościowego określenia ilości specyficznego wiązania trytyowanego liganda z receptorem.
  9. Rozpuść pozostały 1D4 mAb oczyszczony eluent za pomocą standardowej elektroforezy żelowej. Używamy 4-12% żelu SDS-PAGE, a następnie półsucho przenosimy do membrany PVDF w celu immunoblottingu. Dołączamy również tor ze standardową drabinką białkową, aby pomóc w wizualnym przybliżeniu masy cząsteczkowej.
    1. Zablokować membranę PVDF 5% mlekiem w buforze TBS zawierającym 0,05% Tween-20. Zbadaj błonę, aby potwierdzić ekspresję receptora na całej długości za pomocą 1D4 mAb, a następnie sprzężonego z HRP przeciwciała anty-mysiego IgG.
    2. Traktuj odczynnikiem o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i wystaw membranę na film autoradiograficzny, aby uwidocznić pasma.
  10. Przeciąć membranę żyletką, aby oddzielić każdą linię próbki, a następnie przeciąć na określonych znacznikach masy cząsteczkowej. Przenieść segmenty membrany do fiolek zawierających płyn scyntylacyjny. Określ ilościowo ilość trytu w każdym segmencie błony, licząc na liczniku beta-scyntylacji.
  11. Zidentyfikuj dodatnie fotowiązanie krzyżowe z detekcją trytu o pozornej masie cząsteczkowej równej sumie GPCR i liganda.

3. Celowane oznaczanie epitopów i test immunoenzymatyczny na powierzchni komórki (ELISA)

  1. 24 godziny po transfekcji, umyj komórki 1 ml 1x PBS i trypsynizuj 1 ml 0,25% trypsyny przez 3 min. Uzupełnij 9 ml DMEM zawierającym 10% FBS i 0,5 mM azF. Ponownie zawieś komórki i policz gęstość komórek. Używamy standardowego hemocytometru.
  2. Na 96-dołkowej płytce o wysokim poziomie wiązania i przezroczystym dnie należy wstępnie potraktować 100 ml 0,01 mg/ml poli-D-lizyny na dołek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, kilkakrotnie przemyć 1x PBS i wysuszyć na powietrzu.
  3. Na płytkę 96-dołkową przelać 200 μl transfekowanych komórek o gęstości 6 x 104 - 8 x 104 komórek/basenik i powrócić do temperatury 37 °C w atmosferze 5%CO2
    4. .
  4. Następnego dnia przygotuj komórki do etykietowania. Delikatnie przemyć trzy razy 100 μl/studzienkę 1x PBS, aby usunąć wszelkie podłoża wzrostowe zawierające azF. Upewnij się, że komórki pozostają przylegające, na przykład używając PBS zawierającego Ca2+ i Mg2+.
  5. Przygotować 50-200 μM odczynnika do znakowania triarylofosfiny FLAG-w 1x HBSS/PBS z zapasu utrzymywanego na poziomie 5-20 mM w PBS. Nałożyć 60 ml na każdą studzienkę (w trzech egzemplarzach dla każdego mutanta bursztynu) i powrócić do temperatury 37 °C na 30 minut do 4 godzin. Utrzymuj zestaw studzienek bez obróbki etykietowej w 1x HBSS / PBS. Dołącz również kontrolkę wt GPCR do porównania z wariantami azF-GPCR.
  6. Umyj komórki 3 razy 100 μl/studzienkę buforu blokującego, BB (1x PBS, 0,5% BSA), aby całkowicie usunąć nieprzereagowaną etykietę.
  7. Nałóż 100 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu (przygotowanego z 16% bulionu w 1x PBS) na komórki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy BB.
  8. Wykonaj standardowy protokół ELISA na powierzchni komórki, aby wykryć znakowany receptor i ekspresję receptora. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1,5 godziny na lodzie, a następnie inkubować przeciwciała wtórne w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    1. Dodać 100 μl przeciwciała anty-FLAG M2 (np. 1:2 000 rozcieńczenie przeciwciała wytworzonego w BB) w celu wykrycia epitopu peptydu FLAG odczynnika znakującego triarylofosfinę. Sonduj również studnie nieoznakowane traktowane jako kontrola negatywna. Dodaj przeciwciało anty-CCR5 2D7 (używamy rozcieńczenia 1:500) do oddzielnego zestawu studzienek, aby określić ekspresję powierzchni komórek wt lub azF-GPCR.
    2. Przemyć komórki trzykrotnie BB i inkubować ze 100 μl sprzężonego z HRP przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego IgG (rozcieńczenie 1:2,000).
    3. Ostrożnie umyj komórki pięć razy BB. Dodać 50 μl bufora detekcyjnego: Amplex Red, 20 mM H2O2, 1x PBS (stosunek 1:10:90) i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej. Zbierz dane spektralne na fluorescencyjnym czytniku płytek wielodołkowych przy λex=530 i λem=590.

4. Bioortogonalne oznakowanie fluorescencyjne GPCR

  1. Lizować 107 pobranych komórek wykazujących ekspresję wariantów wt lub azF-rodopsyny w 1 ml buforu solubilizacyjnego zawierającego 1% (w/v) DM, 50 mM HEPES lub Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 i inhibitory proteazy przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odwirować lizat komórkowy przy 15 000 x g przez 10 minut i zebrać frakcję supernatantu.
  2. Dodaj 100 μl żywicy sefarozy 1D4-mAb 2B, aby wychwycić receptor za pomocą zaprojektowanego epitopu końca C 1D4. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4 °C. Przemyć żywicę trzykrotnie 0,1% (m/v) DDM w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH 7,3.
  3. Dodać 0,1 mM fluoresceiny-fosfiny w całkowitej objętości 0,3 - 0,5 ml do znakowania receptora unieruchomionego na matrycy powinowactwa immunologicznego (1D4-mAb sefaroza 2B). Inkubować przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Odwirować i usunąć supernatant. Umyj żywicę, aby usunąć nieprzereagowaną etykietę.
  4. Eluować znakowany receptor za pomocą 100 ml buforu elucyjnego zawierającego 0,1% (w/v) DDM i 0,33 mg/ml nonapeptydu (peptyd C9 przeciwko epitopowi 1D4) w 2 mM buforze fosforanowym o pH 6,0 przez inkubację na lodzie przez 1 godzinę.
  5. Rozdziel oznakowane próbki za pomocą SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych. Umyj żele krótko w PBS, a następnie zwizualizuj znakowanie azF-GPCR za pomocą fluorescencji w żelu. Na przykład użyj konfokalnego skanera fluorescencyjnego z laserem o długości fali 488 nm, aby wykryć receptor zmodyfikowany fluoresceiną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowaliśmy metodologię mutagenezy z użyciem nienaturalnych aminokwasów w celu specyficznego dla miejsca wprowadzenia sond molekularnych do GPCR, wykorzystując technologię supresji kodonu bursztynowego. Schemat na Rysunku 1 przedstawia kluczowe etapy tej metodologii oraz różnorodne zastosowania włączania wszechstronnego UAA, p-azydofenyloalaniny (azF), do GPCR. Ekspresja azF-GPCR w komórkach ssaków umożliwia ukierunkowane fotousieciowanie z ligandami, a także celowane znakowanie epitopami pep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy tutaj solidną metodologię specyficznego dla danego miejsca włączenia sondy reaktywnej azF do GPCR i demonstrujemy trzy użyteczne zastosowania tego narzędzia do badania struktury i dynamiki GPCR. Nasza metoda specyficznego dla danego miejsca włączenia UAA omija podstawowy problem dzięki alternatywnej strategii opartej na chemicznym znakowaniu32, 33 lub dołączaniu fotocrosslinkerów34 do pojedynczego dostępnego mutanta cysteiny. Chociaż substancje chemiczne, które celują w grupy tiolowe cyste...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za hojne wsparcie kilku fundacji i darczyńców filantropijnych (zobacz SakmarLab.org).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plazmid pSVB. Yam(Ye et al., 2008)
Plazmid pcDNA.RS dla azF(Ye et al., 2009)
Plazmidy pMT4.Rho i pcDNA 3.1.CCR5Opcjonalnie zawierają bursztynowy kodon stop (TAG) w żądanej pozycji
KomórkiKomórki adherentne
Zmodyfikowane podłoże Orła firmy Dulbecco (DMEM)GibcoNumer katalogowy: 10566 
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco14200 
Płodowa surowica bydlęcaGemini Bio-products100-106 
Lipofectamine PlusInvitrogenLipofectamina: 18324-012
Plus: 11514-015		 
p-azido-L-fenyloalaninaChem-Impex International6162 
 Tabela 1. Specyficzna dla miejsca genetyczna inkorporacja nienaturalnych aminokwasów do materiałów GPCR
Lampa UV-A Maxima ML-3500SSpectronics CorporationazF jest aktywowana przez 365-nm
światło Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS)Gibco14065 
HEPESIrvine Scientific9319 
Albumina surowicy bydlęcejRoche3117405001 
znakowany trytemOd współpracownika (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozydAnatraceD310LA 
1D4-sefaroza żywica1D4 mAb unieruchomiona na sefarozie aktywowanej CNBr żywica 2B
1% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS)Fisher ScientificBP166 
NuPAGE Novex 4 - 12% żele SDSInvitrogenNP0322BOXSDS-PAGE wykonywane na aparacie NuPAGE
Aparat Trans-Blot SDBioradAparat do transferu półsuchego
Immobilon membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)MilliporeIPVH00010 
Mleko beztłuszczoweFisher ScientificNC9934262 
Tween-20Aldrich274348 
Ecoscint ANational DiagnosticsLS-273Płyn scyntylacyjny
Fiolki scyntylacyjneFisher Scientific333726 
LKB Wallac 1209 Rackbeta Licznik scyntylacyjny do płynówPerkin ElmerLicznik beta-scyntylacyjny
Anty-rodopsyna 1D4 mAbNarodowe Centrum Hodowli Komórkowychcustom 
Anty-mysia peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona z IgGKPL, Inc.474-1806 
SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjneThermo Scientific34080 
Folia Hyblot CL ARDenvilleE3018 
 Tabela 2. Ukierunkowane materiały fotosieciujące
0,25% TrypsinInvitrogen15050065 
FLAGA-triarylofosfinaSigmaGPHOS1 
M2 FLAGA mAbSigmaF1804 
anty-CCR5 2D7 mAbBD Biosciences555990 
Poli-D-lizynaSigmaP6407 
Płytka 96-dołkowaCostar3601Przezroczyste dno, wysoko wiążące
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami EIA/RIA (wapń, magnez)Gibco14040 
16% paraformaldehydEMS28908 
Sprzężona z HRPKPL, Inc.474-1516 
anty-królicze IgGKPL, Inc.474-1516 
Amplex RedInvitrogenA12222 
Nadtlenek wodoruDE Produkty zdrowotne97-93399 
Fluorescencyjny czytnik płytek wielodołkowych CytoFluor IIPerseptive Biosystems 
 Tabela 3. Ukierunkowane znakowanie peptydowo-epitopowe i materiały ELISA na powierzchni komórki
Fluoresceina-fosfina(Huber et al., przedłożone w 2012 r.)
Nonapeptide (peptyd C9)AnaSpec62190Peptyd naśladujący 1D4-epitop NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozydAnatraceD310LA 
Żywica 1D4-sefarozy1D4 mAb unieruchomiona na sefarozie aktywowanej CNBr Żywica 2B
NuPAGE Novex 4 - 12% żele SDSInvitrogenNP0322BOXSDS-PAGE wykonywane na aparacie NuPAGE
Skaner fluorescencyjny Confocal Typhoon 9400GE Healthcarewycofany z produkcjiSkaner z laserem o długości fali 488 nm
 Tabela 4. Fluorescencyjne materiały do etykietowania
HEK 293T Ligand

Bibliografia

  1. Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
  2. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
  3. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  4. Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  5. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  6. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
  7. Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
  8. Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
  9. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
  10. Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
  11. Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
  12. Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
  13. Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
  14. Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
  15. Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
  16. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
  17. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
  18. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
  19. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
  20. Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
  21. Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
  22. Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
  23. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  24. Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
  26. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
  27. Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
  28. Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
  29. Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
  30. Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
  31. Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
  32. Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
  33. Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
  34. Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
  35. Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
  36. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  37. Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
  38. Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sygnalizacja GPCRnienaturalny aminokwassupresja kodonu bursztynowegoazydofenyloalaninaukierunkowane sieciowanie fotochemiczneligacja bioortogonalnaznakowanie fluorescencyjneznakowanie epitopoweanaliza ywych kom reksolubilizacja detergentem

Powiązane artykuły