Method Article

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

DOI:

10.3791/50604

⸱

September 4th, 2013

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokolorowa mikroskopia immunofluorescencyjna do wykrywania określonych cząsteczek w błonie komórkowej może być połączona z równoległymi testami w komorze przepływu płytek w celu zbadania mechanizmów regulujących adhezję komórek w warunkach dynamicznego przepływu. Na przykład komórki rakowe znakowane wieloma fluoroforami mogą być perfundowane na potencjalnie reaktywnym substracie w celu modelowania mechanizmów przerzutów raka. Jednak wielokanałowe systemy jednokamerowe i kamery kolorowe wykazują braki w pozyskiwaniu obrazu do analizy komórek w czasie rzeczywistym. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy system podziału emisji z dwiema kamerami, aby jednocześnie rejestrować w czasie rzeczywistym sekwencje obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek w komorze przepływowej. Dwukamerowe systemy podziału emisji filtrują zdefiniowane zakresy długości fal do dwóch monochromatycznych kamer CCD, rejestrując w ten sposób jednocześnie dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy. Następnie, jednokanałowe obrazy o pseudokolorowych kolorach są łączone w jedną sekwencję scaloną w czasie rzeczywistym, która może ujawnić wiele docelowych cząsteczek na komórkach poruszających się szybko w obszarze zainteresowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody analizy cząsteczek na powierzchni komórki, takie jak barwienie immunologiczne, wykorzystują sondy, które są chemicznie sprzężone z fluoroforami, co pozwala na wykrycie docelowych cząsteczek. Obrazowanie żywych komórek i hydrodynamiczne testy adhezji komórek oparte na przepływie są zwykle rejestrowane za pomocą monochromatycznych kamer CCD zaprojektowanych do rejestrowania procesów fizjologicznych na poziomie komórkowym i/lub molekularnym 1, 2. Kamery te są bardzo czułe, zapewniają dużą liczbę klatek na sekundę (ponad 30 klatek na sekundę) i zapewniają wyjątkową rozdzielczość czasową (ze względu na dużą liczbę klatek na sekundę i krótkie czasy naświetlania). Jednak kamery monochromatyczne mogą rejestrować tylko jeden kanał emisyjny (wykrywający pojedynczy fluorofor) w celu zbierania obrazów. Systemy podziału emisji z jednej kamery mogą być włączone w celu przechwytywania wielu kanałów emisji, ale często zmniejszają pole widzenia i wymagają tego samego czasu ekspozycji do obrazowania wszystkich kanałów. Aby uchwycić pełne spektrum kolorów z komórek oznaczonych wieloma fluoroforami, alternatywą może być użycie kolorowej kamery. Jednak kolorowe kamery na ogół nie są w stanie zapewnić rozdzielczości czasowej wymaganej do obrazowania żywych komórek w niektórych zastosowaniach. Inne urządzenie do obrazowania jest potrzebne do zastosowań, w których korzystne jest obrazowanie żywych komórek na wielu długościach fal przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości czasowej. Podstawowym zastosowaniem eksperymentalnym jest test adhezji w komorze z przepływem równoległym, w którym komórki są perfundowane w fizjologicznie odpowiednich warunkach na potencjalnie reaktywnym substracie 1, 3. Komórki w przepływie, które wyrażają określone cząsteczki powierzchniowe komórki, mogą przylegać i toczyć się po podłożu, takim jak monowarstwa komórkowa wyrażająca cząsteczki adhezyjne lub zaadsorbowane powierzchniowo białka macierzy zewnątrzkomórkowej 4, 5. Toczące się komórki mogą ulegać ruchom rotacyjnym i translacyjnym w ułamkach sekundy. Cechy molekularne na toczących się i przylegających komórkach, takie jak skupiska cząsteczek na powierzchni komórki, również mogą ulegać aktywnej reorganizacji na powierzchni komórki. W związku z tym systemy obrazowania muszą zapewniać wyjątkową rozdzielczość czasową (30 klatek na sekundę lub więcej i "prawie zerowe" czasy ekspozycji), aby wygenerować sekwencję obrazu, która ilustruje krok po kroku postęp toczenia się komórek 6, 7. Systemy podziału emisji z dwiema kamerami są w stanie spełnić te wymagania w przypadku komórek obrazowania znakowanych wieloma fluoroforami.

Systemy podziału emisji z dwóch kamer dzielą i filtrują kanały fluorescencji na dwie podobne kamery, aby jednocześnie rejestrować dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy, zachowując pełne pole widzenia. Technologia ta umożliwia bezpośrednie porównywanie obrazu uchwyconego w czasie rzeczywistym w każdym kanale i pozwala użytkownikowi szybko przełączać się między modelami kamer o różnych możliwościach obrazowania. Ta funkcja jest przydatna do wprowadzania zmian w ustawieniach przechwytywania obrazu w jednym aparacie, które lepiej pozwalają systemowi na wychwytywanie fluoroforów o różnej intensywności, czasie życia i współczynnikach ekstynkcji 8. W połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania, systemy podziału emisji z dwiema kamerami umożliwiają rejestrowanie w czasie rzeczywistym testów obrazowania żywych komórek na wielu długościach fal i mogą usprawnić testy in vitro, które wykorzystują fluorescencję do badania zachowania komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instalacja oprogramowania

  1. Kup oprogramowanie StreamPix 5 Multi-Camera z modułem SimulPix lub innym oprogramowaniem do obrazowania, które umożliwia zbieranie i łączenie obrazów zarejestrowanych przez monochromatyczne kamery CCD.
  2. Minimalne wymagania dla StreamPix 5 obejmują: Komputer wyposażony w Core 2 Duo o częstotliwości 2,4 GHz lub lepszej i 2 GB pamięci RAM lub wyższej. Obsługiwana kamera cyfrowa lub analogowa IEEE i kompatybilny frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 lub 64 bit. Monitor obsługujący rozdzielczość 1 024 x 768 lub wyższą. Karta graficzna o dobrej wydajności 2D (zalecany jest OCU express 16x lub lepszy) i dysk twardy o prędkości 7 200 obr./min do nagrywania w konfiguracji RAID-O.

2. Instalacja systemu dwóch kamer zdolnego do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym w dwóch kolorach

  1. Podłącz rozdzielacz emisji DC2 Photometrics lub podobne urządzenie do rozdzielania emisji z dwiema kamerami do mikroskopu, wsuwając adapter DC2 C-mount do portu wideo mikroskopu tak, aby dostępna była obudowa dichroiku na urządzeniu.
  2. Włóż dwie monochromatyczne kamery CCD do żeńskiego mocowania C-mount 1 i żeńskiego C-mount 2. Preferowane są identyczne kamery. Można używać podobnych kamer, ale kompatybilność zależy od wewnętrznego sprzętu, przede wszystkim przetwornika obrazu CCD.
  3. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wyświetlić obrazy z obu kamer. Poniższe kroki (2.3.1 - 2.3.4) dotyczą StreamPix 5 z modułem SimulPix i muszą być dostosowane do innych programów do obrazowania z wielu kamer.
    1. Otwórz StreamPix 5 i wybierz "obszar roboczy" na wstążce zadań.
    2. Otwórz "menedżer przestrzeni roboczej" znajdujący się po prawej stronie ekranu i wybierz "nowy obszar roboczy".
    3. Po nazwaniu kamery postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby wybrać chwytak z wstępnie wypełnionej listy. Wybierz chwytak pasujący do modelu kamery i powtórz te czynności dla drugiego obszaru roboczego kamery. W przypadku scalonego obszaru roboczego powtórz tę czynność jeszcze raz, ale pojawi się komunikat o błędzie "wszystkie kamery są w użyciu". Ten komunikat jest normalny.
    4. Po wczytaniu scalonej przestrzeni roboczej przypisz kamery z przestrzeni roboczej 1 i przestrzeni roboczej 2 do scalonej przestrzeni roboczej w panelu dokowania znajdującym się po prawej stronie ekranu wyświetlania.
  4. Wyrównaj kamery w systemie podziału emisji z dwóch kamer.
    1. Ustaw kamery w jasnym polu lub kontraście fazowym zgodnie z siatką kalibracyjną dostarczoną przez producenta za pomocą obiektywu PlanApo 40X (lub większego).
    2. Wyślij światło do okularów mikroskopu, umieść siatkę kalibracyjną z powłoką metaliczną, która została dostarczona przez producenta, na stoliku mikroskopu i ustaw siatkę pod kątem prostym na stoliku mikroskopu.
    3. Ustaw ostrość na siatce.
    4. Przesuń, ale nie zdejmuj, obudowę dichroiczną, aby wyrównać kamerę 1 (kamera obejściowa). Wyświetlanie siatki bez kategoryzacji i bez skalowania automatycznego. Ustaw ostrość obrazu za pomocą pokrętła regulacji ostrości na porcie 1 C-mount.
    5. Wciśnij całkowicie obudowę dichroiczną do dwukanałowego urządzenia akwizycyjnego, tak aby obraz został podzielony przez dichroik do obu kamer.
    6. Poluzuj trzy dociskowe 5/64" i obróć drugą kamerę na żeńskim C-mount 2, aż orientacja siatki będzie identyczna na obu obrazach. Za pomocą pokrętła regulacji ostrości na porcie 2 C-mount ustaw ostrość na obrazie z aparatu 2
      7. .
    7. Sfinalizuj wyrównanie, korzystając z połączonego obrazu w scalonym obszarze roboczym oprogramowania do obrazowania. Pozwala to zobaczyć w czasie rzeczywistym pseudokolorową nakładkę dwóch obrazów siatki kalibracyjnej. Dostosuj połączone pozycje obrazu, używając tylko pokrętła R/L po prawej stronie DC2. Reguluj to pokrętło, aż prawa/lewa pionowa granica obrazów zostanie dokładnie wyrównana.
    8. Użyj pokrętła U/D, aby wyregulować wyrównanie drugiego obrazu w górę/w dół, aż poziome paski siatki zostaną prawidłowo wyrównane.
    9. Jeśli podczas wyrównywania góra/dół nastąpi lekki obrót kamery, rozwiąż ten problem, poluzowując trzy 5/64" cala kamery 2 i obracaj, aż wyświetlany obraz zostanie prawidłowo wyrównany.

3. Przygotowanie komórek rakowych do testu adhezyjnego w komorze z przepływem równoległym

  1. Hodowla komórek raka piersi BT-20 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełniona do kompletnej pożywki 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2, jak opisano wcześniej 2.
  2. Zbierz komórki rakowe za pomocą rozcieńczonej trypsyny i policz komórki za pomocą hemocytometru.
  3. Przemyć i zawiesić komórki w stężeniu10-7 komórek/ml w 0,1% albuminie z surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS z wapniem i magnezem (DPBS+).
  4. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe, oczyszczony mysi anty-ludzki CD24 i oczyszczony szczurzy HECA-452 (antygeny anty-sjalofukozylowane), do z góry określonego optymalnego stężenia w 0,1% BSA DPBS+. Inkubuj komórki przez 30 minut 9, 10.
  5. Odwirować komórki z prędkością 1 200 obr./min, aby uzyskać osad komórkowy. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i dwukrotnie przemyć komórki 0,1% BSA DBPS+.
  6. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe, kozie przeciwciała anty-mysie IgG AlexaFluor 568 (maksimum emisji, 603 nm) i kozie przeciwciała antyszczurze IgM AlexaFluor 488 (maksimum emisji, 519 nm), do z góry określonego optymalnego stężenia w 0,1% BSA DPBS+. Inkubować komórki przez 30 minut.
  7. Umyj komórki dwukrotnie i zawieś w 0,1% BSA DPBS+ w 106 komórek/ml w 0,1% BSA DPBS+.

4. Przygotowanie reaktywnego podłoża do testu adhezji w komorze z przepływem równoległym

  1. Podłącz dwie oddzielne długości rurki do portów wlotowych i wylotowych równoległej komory przepływowej płyty, która mieści się w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Jedna rurka połączy się ze zbiornikiem oznakowanych komórek zawieszonych w 0,1% BSA DPBS+, a druga z pompą strzykawkową, która będzie pobierać płyn o określonym natężeniu przepływu.
  2. Podłącz przewód podciśnieniowy do komory przepływowej 1.
  3. Umieścić komorę przepływową nad naczyniem do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającym monowarstwę komórek jajnika chomika chińskiego wykazujących ekspresję selektyny E (CHO-E). Komórki CHO-E hodowano w kompletnym pożywce MEM w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2 2.
  4. Wyreguluj komorę przepływu i/lub uszczelkę komory przepływu, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie próżniowe 1.
  5. Pobrać płyn ze zbiornika, monitorując zespół komory przepływowej pod kątem prawidłowego uszczelnienia i braku wizualnych dowodów na tworzenie się pęcherzyków powietrza 1.
  6. Umieść zespół komory przepływowej w mikroskopie (Leica DMI 6000B)1.

5. Akwizycja obrazu dwukolorowego

  1. Zasil kompaktowe źródło światła Leica EL-6000 lub podobne urządzenie, aby generować światło o dużej intensywności i połącz je w światłowód. Użyj odwróconego mikroskopu, aby przepuścić to światło przez kombinowaną kostkę filtracyjną, tj. kostkę filtra G / R (zielony / czerwony), aby wzbudzić fluorofory o pożądanym kolorze/intensywności.
  2. Upewnij się, że obudowa dichroiczna znajduje się we właściwej pozycji roboczej (wciśnięta) i nie jest w trybie obejścia.
  3. Uruchom mikroskop w trybie fluorescencji i wybierz odpowiednią kostkę filtra fluorescencyjnego (zielony/czerwony).
  4. Określ czas ekspozycji i wzmocnienie w aparacie 1 (czerwony; 620±60 nm) i aparacie 2 (zielony; 535±40 nm).
    1. Wciśnij dichroik, aby uzyskać obrazy zarówno w czerwonym, jak i zielonym kanale emisji. Użyj testu w komorze przepływowej z komórkami znakowanymi tylko czerwonym fluoroforem i uzyskaj obraz w kanale czerwonym, dostosowując czas ekspozycji kamery 1 w "ustawieniach na żywo" oprogramowania do obrazowania.
    2. Dopasuj czas naświetlania kamery 2 do czasu naświetlania aparatu 1. Jeśli obraz jest obserwowany w kanale zielonym, obecne są artefakty przebijające, a czas ekspozycji w obu kamerach musi zostać skrócony.
    3. Zachowując równoważny czas ekspozycji w kamerze 1 i kamerze 2, skróć czas ekspozycji, aż artefakt przebijający przestanie być widoczny w kanale zielonym. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie kamery 1, aby poprawić widoczność obrazu w kanale czerwonym.
    4. Powtórz kroki 5.4.1 - 5.4.3 z komórkami oznaczonymi tylko zielonym fluoroforem, ale zdefiniuj czas ekspozycji za pomocą kamery 2, aby zobrazować komórki w kanale zielonym bez artefaktów przebijania w kanale czerwonym zebranym przez kamerę 1.
    5. Miareczkowanie przeciwciał należy retitować, jeśli nie można wyeliminować artefaktów przebijania 11 lub jeśli czasy ekspozycji kamery 1 i kamery 2 znacznie się różnią, tak że połączone obrazy mogą być czasowo niewyrównane.
  5. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby wyświetlić obrazy jednocześnie zarejestrowane z dwóch monochromatycznych kamer CCD w eksperymencie w komorze przepływowej.
  6. Łącz obrazy zebrane z obu kamer za pomocą modułu SimulPix w Streampix 5 lub alternatywnego pakietu oprogramowania.
  7. W razie potrzeby użyj cyfrowych korekt korekcji w SimulPix lub alternatywnym oprogramowaniu, aby wyrównać przestrzennie scalone obrazy. Obrazy można korygować za pomocą modułu SimulPix w celu regulacji w poziomie, pionie i obracaniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym został użyty do zademonstrowania systemu podziału emisji z dwiema kamerami, który jednocześnie rejestrował sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych (Rysunek 1). System podziału emisji z podwójną kamerą wykrył komórki BT-20, które były znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami monoklonalnymi anty-ludzkimi CD24 i HECA-452 (wykrywającymi antygeny sjalofukozylowane) i odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (Figur...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System podziału emisji z dwiema kamerami ma rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną potrzebną do rejestrowania wysokiej jakości obrazów w zastosowaniach, w których ruch komórek lub molekularnych jest szybki. Generując reprezentatywne wyniki, parametry w systemie podziału emisji z dwiema kamerami, w tym ustawienia oprogramowania i ustawienia kamery, zostały zoptymalizowane w celu uzyskania połączonej sekwencji obrazu, w której toczące się i przylegające komórki były wyrównane przestrzennie i czasowo. Ten etap optym...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Dr. Douglasowi Goetzowi (Wydział Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej, Uniwersytet Ohio) oraz Dr. Fabianowi Benencii (Wydział Nauk Biomedycznych, Uniwersytet Ohio) za wnikliwe dyskusje i recenzję manuskryptu. Dziękujemy również dr. Christopherowi Huppenbauerowi za pomocne dyskusje techniczne (W. Nuhsbaum Inc.). Prace te były wspierane przez granty z National Science Foundation (CBET-1106118) i National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
odczynnik/Materiał
BT-20 komórkiATCCHTB-19
CHO-ECells Prezent od Dr. R. Sacksteina (Brigham and Women' s Szpital, Harvard Medical School)
MEM Thermo ScientificSH30024.01
FBSThermo ScientificSH30396.03
Penicylina-streptomycynaThermo ScientificSV30010
0,25% trypsyna / 0,1% EDTAThermo ScientificSV30031.01
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
HECA-452 przeciwciało monoklonalneBD Biosciences555946
Przeciwciało monoklonalne antyludzkie CD24BD Biosciences555426
Przeciwciało przeciw szczurom IgM AlexaFluor 488InvitrogenA21212
IgG przeciw myszym AlexaFluor 568InvitrogenA11004
[header]
Equipment
EXi Niebieska mikroskopia fluorescencyjna Cyfrowa kamera CCDObrazowanieEXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Cyfrowa kamera CCDQ ObrazowanieRET-EXi-F-M-12-C
DC2 Rozdzielacz emisjiFotometriaDC2
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMI6000 B
Oprogramowanie Streampix 5Norpix
Q

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529(2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103(2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dual Camera Emission SplittingParallel Plate Flow ChamberReal time Image AcquisitionCell Adhesion AssayFluorescence MicroscopyCamera Alignment ProcedureMonochrome CCD CamerasFluorescent Cell LabelingFlow Chamber SetupDigital Image Correction

Related Articles