Method Article

Jednoczesne przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych za pomocą systemu podziału emisji z dwiema kamerami: Zastosowania adhezji komórek

DOI:

10.3791/50604

⸱

September 4th, 2013

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwukamerowe systemy podziału emisji dla dwukolorowej mikroskopii fluorescencyjnej generują sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym z wyjątkową rozdzielczością optyczną i czasową, co jest wymogiem niektórych testów żywych komórek, w tym testów adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym. Gdy oprogramowanie jest używane do łączenia obrazów z jednocześnie pozyskanych kanałów emisji, tworzone są pseudokolorowe sekwencje obrazów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokolorowa mikroskopia immunofluorescencyjna do wykrywania określonych cząsteczek w błonie komórkowej może być połączona z równoległymi testami w komorze przepływu płytek w celu zbadania mechanizmów regulujących adhezję komórek w warunkach dynamicznego przepływu. Na przykład komórki rakowe znakowane wieloma fluoroforami mogą być perfundowane na potencjalnie reaktywnym substracie w celu modelowania mechanizmów przerzutów raka. Jednak wielokanałowe systemy jednokamerowe i kamery kolorowe wykazują braki w pozyskiwaniu obrazu do analizy komórek w czasie rzeczywistym. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy system podziału emisji z dwiema kamerami, aby jednocześnie rejestrować w czasie rzeczywistym sekwencje obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek w komorze przepływowej. Dwukamerowe systemy podziału emisji filtrują zdefiniowane zakresy długości fal do dwóch monochromatycznych kamer CCD, rejestrując w ten sposób jednocześnie dwa identyczne przestrzennie, ale specyficzne dla fluoroforu obrazy. Następnie, jednokanałowe obrazy o pseudokolorowych kolorach są łączone w jedną sekwencję scaloną w czasie rzeczywistym, która może ujawnić wiele docelowych cząsteczek na komórkach poruszających się szybko w obszarze zainteresowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody analizy cząsteczek na powierzchni komórki, takie jak barwienie immunologiczne, wykorzystują sondy, które są chemicznie sprzężone z fluoroforami, co pozwala na wykrycie docelowych cząsteczek. Obrazowanie żywych komórek i hydrodynamiczne testy adhezji komórek oparte na przepływie są zwykle rejestrowane za pomocą monochromatycznych kamer CCD zaprojektowanych do rejestrowania procesów fizjologicznych na poziomie komórkowym i/lub molekularnym 1, 2. Kamery te są bardzo czułe, zapewniają dużą liczbę klatek na sekundę (ponad 30 klatek na sekundę) i zapewniają wyjątkową rozdzielczość czasową (ze względu na dużą liczbę klatek na sekundę i krótkie czasy naświet....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Instalacja oprogramowania

  1. Kup oprogramowanie StreamPix 5 Multi-Camera z modułem SimulPix lub innym oprogramowaniem do obrazowania, które umożliwia zbieranie i łączenie obrazów zarejestrowanych przez monochromatyczne kamery CCD.
  2. Minimalne wymagania dla StreamPix 5 obejmują: Komputer wyposażony w Core 2 Duo o częstotliwości 2,4 GHz lub lepszej i 2 GB pamięci RAM lub wyższej. Obsługiwana kamera cyfrowa lub analogowa IEEE i kompatybilny frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 lub 64 bit. Monitor obsługujący rozdzielczość 1 024 x 768 lub wyższą. Karta graficzna o dobrej wydajności 2D (zalecany jest OCU express 16x lub lepszy) i dysk twardy o prędkości....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test adhezji w komorze z równoległym przepływem płytkowym został użyty do zademonstrowania systemu podziału emisji z dwiema kamerami, który jednocześnie rejestrował sekwencje obrazów w czasie rzeczywistym w dwóch kanałach emisyjnych (Rysunek 1). System podziału emisji z podwójną kamerą wykrył komórki BT-20, które były znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami monoklonalnymi anty-ludzkimi CD24 i HECA-452 (wykrywającymi antygeny sjalofukozylowane) i odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (Figur.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System podziału emisji z dwiema kamerami ma rozdzielczość przestrzenną, czasową i optyczną potrzebną do rejestrowania wysokiej jakości obrazów w zastosowaniach, w których ruch komórek lub molekularnych jest szybki. Generując reprezentatywne wyniki, parametry w systemie podziału emisji z dwiema kamerami, w tym ustawienia oprogramowania i ustawienia kamery, zostały zoptymalizowane w celu uzyskania połączonej sekwencji obrazu, w której toczące się i przylegające komórki były wyrównane przestrzennie i czasowo. Ten etap optym.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Dr. Douglasowi Goetzowi (Wydział Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej, Uniwersytet Ohio) oraz Dr. Fabianowi Benencii (Wydział Nauk Biomedycznych, Uniwersytet Ohio) za wnikliwe dyskusje i recenzję manuskryptu. Dziękujemy również dr. Christopherowi Huppenbauerowi za pomocne dyskusje techniczne (W. Nuhsbaum Inc.). Prace te były wspierane przez granty z National Science Foundation (CBET-1106118) i National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
odczynnik/Materiał
BT-20 komórkiATCCHTB-19
CHO-ECells Prezent od Dr. R. Sacksteina (Brigham and Women' s Szpital, Harvard Medical School)
MEM Thermo ScientificSH30024.01
FBSThermo ScientificSH30396.03
Penicylina-streptomycynaThermo ScientificSV30010
0,25% trypsyna / 0,1% EDTAThermo ScientificSV30031.01
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
HECA-452 przeciwciało monoklonalneBD Biosciences555946
Przeciwciało monoklonalne antyludzkie CD24BD Biosciences555426
Przeciwciało przeciw szczurom IgM AlexaFluor 488InvitrogenA21212
IgG przeciw myszym AlexaFluor 568InvitrogenA11004
[header]
Equipment
EXi Niebieska mikroskopia fluorescencyjna Cyfrowa kamera CCDObrazowanieEXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Cyfrowa kamera CCDQ ObrazowanieRET-EXi-F-M-12-C
DC2 Rozdzielacz emisjiFotometriaDC2
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMI6000 B
Oprogramowanie Streampix 5Norpix
Q

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dual Camera Emission SplittingParallel Plate Flow ChamberReal time Image AcquisitionCell Adhesion AssayFluorescence MicroscopyCamera Alignment ProcedureMonochrome CCD CamerasFluorescent Cell LabelingFlow Chamber SetupDigital Image Correction

Related Articles