Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Po ostrym uszkodzeniu mózgu, mikroglej jest szybko aktywowany i ulega dramatycznym zmianom morfologicznym i fenotypowym^1-3. Ta wewnętrzna odpowiedź jest związana z rekrutacją makrofagów krwionośnych, które migrują do uszkodzonego miąższu mózgu^4,5. Rola mikrogleju i makrofagów, które są antygenowo nierozróżnialne (odtąd określane jako M/M) w uszkodzeniu mózgu jest nadal dyskutowana. Coraz więcej badań wskazuje, że podobnie jak w przypadku makrofagów obwodowych, mikroglej i makrofagi rekrutowane do mózgu mogą przyjmować różne fenotypy, których skrajności odpowiadają klasycznemu prozapalnemu fenotypowi toksycznemu (M1) lub przeciwzapalnemu ochronnemu (M2). Różne stany aktywacji, w tym wydzielanie czynników pro- lub przeciwzapalnych, uwalnianie cząsteczek neurotroficznych i aktywność lizosomalna, charakteryzują się specyficznym wzorcem markerów fenotypowych, których ekspresja zależy od czasowej ewolucji otaczającego środowiska. Charakterystyka tych fenotypów M/M w uszkodzonym mózgu jest nadal skąpa. Użyliśmy dobrze ugruntowanego mysiego modelu pMCAo do analizy ekspresji i ewolucji M / M po udarze. Przedstawione tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji mają na celu uzyskanie wglądu w wygląd specyficznych markerów fenotypu M/M, ich lokalizację i koekspresję komórkową w obszarze niedokrwiennym. Zbadaliśmy kilka cząsteczek związanych z różnymi stanami aktywacji lub fenotypami, a mianowicie CD11b, marker powierzchniowy wyrażany przez leukocyty i szeroko stosowany marker aktywacji / rekrutacji M / M^6-8, CD68 marker lizosomów^6,7 i Ym1, białko wydzielnicze wyrażane przez alternatywnie aktywowane (M2) makrofagi i związane z odzyskiwaniem i przywracaniem funkcji^9-10.

Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych subkomórkowych kompartmentach, sama kolokalizacja może nie być zbyt pouczająca. W takim przypadku analizę koekspresji można przeprowadzić przy użyciu widoku pojedynczej płaszczyzny i renderingów trójwymiarowych. Opisujemy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie dokładnej trójwymiarowej analizy koekspresji markerów.

1. Immunofluorescencja

Następujący protokół jest wykonywany na koronalnych kriosekcjach mózgu uzyskanych od myszy z transcardially perfunded (20 ml PBS, 0,1 mol/litr, pH 7,4, a następnie 50 ml schłodzonego paraformaldehydu 4% w PBS). Po perfuzji mózgi są ostrożnie usuwane i przenoszone do 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez noc w celu krioprotekcji. Mózgi są następnie szybko zamrażane przez zanurzenie w izopentanie w temperaturze -45 °C przez 3 minuty, a następnie zamykane w fiolkach i przechowywane w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Kriosekcje koronalne mózgu (20 μm) są cięte seryjnie i poddawane protokołowi immunofluorescencji ^{11, 6}.

Przed użyciem doprowadź wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej. Należy pamiętać, że przedstawione robocze rozcieńczenia przeciwciał i surowicy wynikały z prób przeprowadzonych w celu uzyskania najlepszych wyników. W przypadku stosowania różnych przeciwciał i surowicy protokół musi zostać zwalidowany.

Zauważ, że ponieważ zarówno przeciwciała pierwotne anty-CD11b, jak i anty-CD68 są wytwarzane u szczurów, aby uniknąć sygnału krzyżowego przez antyszczurzą Alexę 546, użyliśmy wysokiego rozcieńczenia anty-CD11b, a następnie wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego za pomocą zestawu TSA (tyramid Cy5). Ustaliliśmy optymalne rozcieńczenie robocze dla anty-CD11b, wykonując opisany protokół z wyjątkiem kroku 1.17 i używając co najmniej 7 różnych rozcieńczeń anty-CD11b, jak podano w tabeli 1. W rezultacie wybrano rozcieńczenie 1:30 000 jako jedyne rozcieńczenie, w którym osiągnięto: 1) sygnał widzialny z Cy5 o długości fali wzbudzenia 646 nm; 2) brak sygnału z Alexa 546 przy długości fali wzbudzenia 532 nm. W ten sposób sygnał fluorescencyjny Alexa 546 jest selektywnie kojarzony z ekspresją CD68.

Optymalna zawartość rozcieńczeń dla przeciwciał anty-CD11b i anty-CD68 może się różnić w zależności od rodzaju tkanki i musi być określona przed rozpoczęciem protokołu wspólnego znakowania.

1. Dwukrotnie przemyć kriosekcje mózgu PBS.
2. Inkubować kriosekcje przez 5 minut w PBS zawierającym 1%_H2O2(etap wymagany, ponieważ amplifikacja fluorescencyjna wymaga inkubacji z peroksydazą chrzanową, streptawidyną-HRP, patrz krok 1.12).
3. Przemyć kriosekcje 2x PBS.
4. Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,3% Triton.
5. Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD11b Ab Rat [1:30 000], 10% NGS i 0,3% Triton.
6. Przemyć kriosekcje 2x (5 min) PBS.
7. Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym biotynylowany wtórny anty-Rat Ab [1:200] i 1% NGS.
8. Przemyć kriosekcje 2x PBS.
9. Przemyć kriosekcje TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
10. Inkubować kriosekcje przez 1,5 godziny w TNB (bufor blokujący Tris-HCl-NaCl: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% odczynnik blokujący z odpowiedniego zestawu (patrz tabela odczynników)).
11. Przemyć kriosekcje 3 razy trotylem.
12. Inkubuj kriosekcje w TNB zawierające streptawidynę-HRP [1:100].
13. Przemyć kriosekcje 3x trotylem.
14. Inkubować kriosekcje przez 8 minut w rozcieńczalniku amplifikacyjnym zawierającym cyjaninę 5 Tyramid [1:300].
15. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
16. Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,1% Triton.
17. Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD68 Ab Rat [1:200], 3% NGS i 0,3% Triton.
18. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
19. Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym fluorsprzężony wtórny anty-Rat Ab Alexa 546 [1:500] i 1% NGS.
20. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
21. Inkubować kriosekcje przez 10 minut w PBS zawierającym Hoechst 1 μg/ml.
22. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
23. Zamontuj kriosekcje w Prolong Gold.

2. Akwizycja obrazów trójwymiarowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Użyty tutaj mikroskop to mikroskop IX81 wyposażony w konfokalny moduł skanujący FV500 z 3 liniami laserowymi: Ar-Kr (488nm), He-Ne czerwony (646nm) i He-Ne zielony (532nm) oraz diodą UV.

1. Wybierz lasery wzbudzające w zależności od długości fal barwników fluorescencyjnych, które mają być wzbudzone (czerwony He-Ne dla Cy5, CD11b; He-Ne zielony dla Alexa546, CD68 i dioda UV dla Hoechst, jądra).
2. Wybierz najlepszą kombinację zwierciadła dichroicznego do zbierania sygnałów świetlnych.
3. Ustaw rozdzielczość obrazu na co najmniej 800 x 600 pikseli.
4. Zidentyfikuj obszar zainteresowania za pomocą epi-fluorescencji i stopniowo zwiększaj powiększenie do obiektywu 40X.
5. Przełącz się na tryb laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).
6. Uruchamiaj powtarzalne skanowanie, aby dostosować fotopowielacz (PMT) i wzmocnienie dla każdego kanału. Lasery mogą być włączane indywidualnie, aby ułatwić konfigurację. Utrzymuj wzmocnienie tak niskie, jak to możliwe, aby uniknąć niepożądanych sygnałów niespecyficznych.
7. W przypadku wykonywania skanowania powtarzalnego przesuń element sterujący ostrością, aby zdefiniować dolne i górne krańce osi z (całkowita długość osi z = 10 μm).
8. Zatrzymaj powtarzające się skanowanie.
9. Określ rozmiar kroku. Powinien być jak najbardziej zbliżony do rozmiaru piksela (0,225 μm), aby uzyskać standardowy stosunek rozmiaru 1:1 na osi z.
10. Aktywuj filtr Kalmana co najmniej 2 razy.
11. Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć efektów przebijania.
Przesuń się w
12. połowie osi z i uruchom skanowanie sekwencyjne xy. Sprawdź konfigurację PMT i wzmocnienie (dobry stosunek sygnału do szumu). Jeśli wynik nie jest zadowalający, powtórz krok 2.6.
13. Uruchom pobieranie xyz.
14. Eksportuj dane jako plik multitiff. Każdy plik multitiff zawiera zazwyczaj 3 kanały kolorów (niebieski, zielony i czerwony) oraz 44 płaszczyzny ogniskowych.

3. Trójwymiarowy widok akwizycji konfokalnych i trójwymiarowego renderingu

Prześlij pliki multitiff do oprogramowania Imaris i przetwarzaj je w następujący sposób:

1. Otwarte oprogramowanie.
2. Wybierz widok przewyższający.
3. Przekaż plik multitiff.
4. Wybierz żądany kolor dla każdego kanału.
5. Usuń szum z tła, zwiększając minimalną wartość na panelu regulacji wyświetlacza. Dostosuj każdy kanał indywidualnie.
6. Przejdź do widoku przekroju. Poruszaj się wzdłuż osi z, szukając kolokalizacji (żółte piksele).
7. Kliknij na żółty obszar, aby sprawdzić, czy kolokalizacja występuje wzdłuż osi z (tj. należy do obiektu bryłowego). Rzuty osi Z są widoczne w prawej i dolnej części rysunku.
8. Zrób migawkę.
9. Wróć, aby przewyższyć widok.
10. Kadrowanie 3D w celu odizolowania komórki lub grupy komórek.
11. Wybierz jeden kanał na panelu regulacji wyświetlacza.
12. Wybierz konstruktora algorytmu przewyższania/powierzchni. Kroki algorytmu:
    1. Wybierz kanał.
    2. Zdefiniuj próg (użyj tej samej wartości minimalnej w panelu regulacji wyświetlania).
    3. Zdefiniuj zmianę rozmiaru.
    4. Zdefiniuj wygładzanie (najlepiej = 0,200).
    5. Określ wygląd koloru.
    6. Algorytm końcowy.
13. Powtórz krok 3.12 dla każdego kanału.
14. Usuń zaznaczenie opcji Kanały fluorescencji na panelu regulacji wyświetlacza i zaznacz wszystkie trzy powierzchnie.
15. Przesuń głośność, aby znaleźć najlepszy widok.
16. Zrób migawkę.

Przykład wyników uzyskanych podczas przeprowadzania protokołów znakowania i akwizycji konfokalnej w obszarze niedokrwiennym jest zilustrowany na rysunkach 1A i 1B. Dwuwymiarowy widok uzyskanych obrazów pokazuje, że po dwudziestu czterech godzinach od niedokrwienia (A) marker lizosomalny CD68 (zielony) ulega ekspresji w przerostowych ameboidalnych komórkach CD11b (czerwonych) obecnych w niedokrwionym rdzeniu. W strefie granicznej (B) komórki dodatnie CD11b wykazują okrągłe ciała komórkowe i rozgałęzione procesy dodatnie do CD68. Rzuty osi Z (prawa i dolna część A i B) umożliwiają wizualizację, czy rozkład znaczników udokumentowany w widoku pojedynczej płaszczyzny występuje również wzdłuż osi z. Tam, gdzie zachodzi kolokalizacja, generowane są żółte piksele. CD11b jest receptorem dla fragmentów C3 i wykazuje rozkład błonowy. CD68 znakuje lizosomy i dlatego jest obecny głównie w cytozolu. Podwójnie dodatnie komórki CD11b / CD68 zwykle mają niewielki procent kolokalizowanych wokseli iw większości przypadków CD11b otacza CD68 (Figura 1A). Tylko wtedy, gdy fagosomy są związane z błoną komórkową podczas procesu fagocytarnego, następuje kolokalizacja między CD11b i CD68 (ryc. 1B).

Na rysunku 2 przedstawiono przetwarzanie obrazu, które prowadzi do definicji koekspresji markera. W A trójwymiarowy widok konfokalnych obrazów nabytych wskazuje na obecność dodatniej komórki CD68 (zielonej) i dodatniej komórki Ym1 (czerwonej), ale nie może być używany do definicji kolokalizacji. Rzeczywiście, fluorescencyjne woksele leżące równolegle do pola widzenia obserwatora mogą dawać kolokalizowany sygnał (żółty), który może nie być związany z rzeczywistą odległością między znacznikami (nie są to obiekty stałe i mogą wystąpić efekty przezroczystości). Aby zdefiniować kolokalizację, należy preferować pojedynczy widok płaszczyzny z rzutami osi z (B). Poruszając się wzdłuż osi Z w poszukiwaniu kolokalizacji (żółte piksele), uzyskuje się rzut osi Z (widoczny po prawej i lewej stronie B). Woksele fluorescencyjne można przekształcić w ciała stałe poprzez trójwymiarowe renderowanie (rysunek 2C). Obrót objętości pozwala na najlepszy widok (od C' do C''''') do patrzenia na obiekty i prawidłowego przypisania ekspresji markera do określonego ciała komórkowego. Duże powiększenie i solidny widok trójwymiarowych renderingów umożliwiają zdefiniowanie ekspresji znacznika w skupiskach komórek (D-D''). Po dużym powiększeniu i renderowaniu 3D, dwa markery (CD68 i Ym1) wydają się należeć do różnych komórek, chociaż znajdują się w bliskiej odległości.

Przykład oceny koekspresji markera fenotypu M/M w obszarze niedokrwiennym pokazano na rysunku 3. Koekspresja CD11b (czerwony), marker aktywacji/rekrutacji M / M, CD68 (zielony), marker związany z lizosomami, a także Ym1, wyrażany przez alternatywne aktywowane M / M są badane w obszarze niedokrwiennym. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat stanu funkcjonalnego M/M, oceniliśmy ich związek z neuronami (NeuN, na niebiesko). Obrazy badanego obszaru (rysunki 3A-3D) są oceniane jako obiekty trójwymiarowe (rysunki 3A'-3D'). Podwójnie dodatnie komórki CD11b/CD68 są badane przez trójwymiarowe renderowanie (ryc. 3A' i 3B'). Analiza pokazuje, że neurony (niebieskie) są często otoczone komórkami CD11b dodatnimi zarówno w rdzeniu niedokrwiennym, jak i w strefie granicznej po 24 godzinach od niedokrwienia. W większości przypadków komórki CD11b otaczające neurony są dodatnie dla CD68 w obu strefach, co sugeruje, że komórki te są zaangażowane w aktywną fagocytozę. Żadna z podwójnie dodatnich komórek CD11b / Ym1 (ryc. 3C i 3C') nie wydaje się angażować w interakcję fagocytarną z neuronami, będąc podwójnie dodatnimi komórkami CD11b / Ym1, które nigdy nie mają kontaktu z komórkami NeuN dodatnimi.

Tabela 1. Precyzyjne dostrojenie rozcieńczenia roboczego dla szczurzego przeciwciała anty-CD11b.

Rysunek 1. Koekspresja CD11b (czerwony) i CD68 (zielony) 24 godziny po pMCAO. Mikroskopia konfokalna dla CD11b i CD68 pokazuje, że w niedokrwiennym rdzeniu komórki CD11b są głównie kuliste, a niektóre z nich są dodatnie wobec CD68 (A). W strefie granicznej (B) zarówno zaokrąglone, jak i rozgałęzione komórki CD11b są dodatnie w stosunku do CD68. Jądra są w kolorze niebieskim. Paski: 20 μm.

Rysunek 2. Koekspresja CD68 (zielony) i Ym1 (czerwony) po 24 godzinach od pMCAO. Trójwymiarowy obraz konfokalny uzyskany w obszarze niedokrwiennym, CD68 (zielony), Ym1 (czerwony) i jądra (niebieski) (A). Widok jednopłaszczyznowy z rzutami osi z wyklucza obecność kolokalizowanych wokseli (brak żółtego sygnału, B). Renderowanie trójwymiarowe zamienia fluorescencyjne woksele w ciała stałe (C). Głośność jest obracana, aby znaleźć najlepszy widok (C'-C''''). Przyjrzyj się bliżej skupisku komórek (D). Renderowanie trójwymiarowe pomaga określić, czy znaczniki są wyrażane przez tę samą komórkę w przypadku klastra komórek (D'). CD68 i Ym1, choć w bliskim kontakcie, nie ulegają koekspresji przez te same komórki, będąc wyraźnie związane z różnymi jądrami (D''). Pręty: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą liczbę.

Rysunek 3. Koekspresja CD11b (czerwony) i NeuN (niebieski) z CD68 (zielony) lub z Ym1 po 24 godzinach po pMCAO. Mikroskopia konfokalna w niedokrwiennym rdzeniu (A; renderowanie 3D w A') i w strefie granicznej (B-B') ujawnia, że podwójnie dodatnie komórki CD11b / CD68 otaczają komórki NeuN dodatnie, co może wskazywać na fagocytozę neuronów. Komórki Ym1 dodatnie znajdują się wyłącznie w rdzeniu niedokrwiennym (CD). Analiza konfokalna podwójnie dodatnich komórek CD11b / Ym1 pokazuje, że nie wydają się one być zaangażowane w interakcję fagocytarną z neuronami (komórki NeuN dodatnie, C; renderowanie 3D w C'). Pojedyncze komórki dodatnie CD11b zarówno w rdzeniu niedokrwiennym (C-C'), jak i w strefie granicznej (D-D') otaczają neurony. Bar: 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.