Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

DOI:

10.3791/50605

⸱

4 września 2013

 ,  , 
1Department of Neuroscience, IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po udarze mózgu mikroglej/makrofagi (M/M) przechodzą szybką aktywację z dramatycznymi zmianami morfologicznymi i fenotypowymi, które obejmują ekspresję nowych antygenów powierzchniowych i produkcję mediatorów, które budują i utrzymują odpowiedź zapalną. Pojawiające się dowody wskazują, że M/M są wysoce plastycznymi komórkami, które mogą przyjąć klasyczną aktywację prozapalną (M1) lub alternatywną przeciwzapalną (M2) po ostrym uszkodzeniu mózgu. Nadal jednak brakuje pełnej charakterystyki ekspresji markerów fenotypu M/M, ich kolokalizacji i ewolucji czasowej w uszkodzonym mózgu.

Protokoły immunofluorescencji specyficznie barwiące odpowiednie markery aktywacji M/M mogą być wykonywane w niedokrwiennym mózgu. Tutaj przedstawiamy protokoły oparte na immunofluorescencji, a następnie trójwymiarową analizę konfokalną jako potężne podejście do badania wzorca lokalizacji i koekspresji markerów fenotypu M / M, takich jak CD11b, CD68, Ym1, w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia wywołanego przez trwałą niedrożność tętnicy środkowej mózgu (pMCAO). Dwuwymiarowa analiza zabarwionego obszaru ujawnia, że każdy marker jest powiązany z określoną morfologią M/M i ma określoną lokalizację w zmianie niedokrwiennej. Wzorce koekspresji markera fenotypu M/M można ocenić za pomocą trójwymiarowego obrazowania konfokalnego w obszarze niedokrwiennym. Obrazy mogą być rejestrowane w określonej objętości (oś Z 10 μm i krok co 0,23 μm, co odpowiada objętości 180 x 135 x 10 μm) w trybie skanowania sekwencyjnego w celu zminimalizowania efektów przebijania i uniknięcia nakładania się długości fal. Obrazy są następnie przetwarzane w celu uzyskania trójwymiarowych renderingów za pomocą oprogramowania Imaris. Solidny widok trójwymiarowych renderingów pozwala na zdefiniowanie wyrażenia znacznika w klastrach komórek. Wykazaliśmy, że M/M mają zdolność różnicowania się w kierunku wielu fenotypów, w zależności od lokalizacji w miejscu zmiany i czasu po urazie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po ostrym uszkodzeniu mózgu, mikroglej jest szybko aktywowany i ulega dramatycznym zmianom morfologicznym i fenotypowym1-3. Ta wewnętrzna odpowiedź jest związana z rekrutacją makrofagów krwionośnych, które migrują do uszkodzonego miąższu mózgu4,5. Rola mikrogleju i makrofagów, które są antygenowo nierozróżnialne (odtąd określane jako M/M) w uszkodzeniu mózgu jest nadal dyskutowana. Coraz więcej badań wskazuje, że podobnie jak w przypadku makrofagów obwodowych, mikroglej i makrofagi rekrutowane do mózgu mogą przyjmować różne fenotypy, których skrajności odpowiadają klasycznemu prozapalnemu fenotypowi toksycznemu (M1) lub przeciwzapalnemu ochronnemu (M2). Różne stany aktywacji, w tym wydzielanie czynników pro- lub przeciwzapalnych, uwalnianie cząsteczek neurotroficznych i aktywność lizosomalna, charakteryzują się specyficznym wzorcem markerów fenotypowych, których ekspresja zależy od czasowej ewolucji otaczającego środowiska. Charakterystyka tych fenotypów M/M w uszkodzonym mózgu jest nadal skąpa. Użyliśmy dobrze ugruntowanego mysiego modelu pMCAo do analizy ekspresji i ewolucji M / M po udarze. Przedstawione tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji mają na celu uzyskanie wglądu w wygląd specyficznych markerów fenotypu M/M, ich lokalizację i koekspresję komórkową w obszarze niedokrwiennym. Zbadaliśmy kilka cząsteczek związanych z różnymi stanami aktywacji lub fenotypami, a mianowicie CD11b, marker powierzchniowy wyrażany przez leukocyty i szeroko stosowany marker aktywacji / rekrutacji M / M6-8, CD68 marker lizosomów6,7 i Ym1, białko wydzielnicze wyrażane przez alternatywnie aktywowane (M2) makrofagi i związane z odzyskiwaniem i przywracaniem funkcji9-10.

Gdy dwa markery są wyrażane przez tę samą komórkę, ale w różnych subkomórkowych kompartmentach, sama kolokalizacja może nie być zbyt pouczająca. W takim przypadku analizę koekspresji można przeprowadzić przy użyciu widoku pojedynczej płaszczyzny i renderingów trójwymiarowych. Opisujemy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie dokładnej trójwymiarowej analizy koekspresji markerów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunofluorescencja

Następujący protokół jest wykonywany na koronalnych kriosekcjach mózgu uzyskanych od myszy z transcardially perfunded (20 ml PBS, 0,1 mol/litr, pH 7,4, a następnie 50 ml schłodzonego paraformaldehydu 4% w PBS). Po perfuzji mózgi są ostrożnie usuwane i przenoszone do 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C przez noc w celu krioprotekcji. Mózgi są następnie szybko zamrażane przez zanurzenie w izopentanie w temperaturze -45 °C przez 3 minuty, a następnie zamykane w fiolkach i przechowywane w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Kriosekcje koronalne mózgu (20 μm) są cięte seryjnie i poddawane protokołowi immunofluorescencji 11, 6.

Przed użyciem doprowadź wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej. Należy pamiętać, że przedstawione robocze rozcieńczenia przeciwciał i surowicy wynikały z prób przeprowadzonych w celu uzyskania najlepszych wyników. W przypadku stosowania różnych przeciwciał i surowicy protokół musi zostać zwalidowany.

Zauważ, że ponieważ zarówno przeciwciała pierwotne anty-CD11b, jak i anty-CD68 są wytwarzane u szczurów, aby uniknąć sygnału krzyżowego przez antyszczurzą Alexę 546, użyliśmy wysokiego rozcieńczenia anty-CD11b, a następnie wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego za pomocą zestawu TSA (tyramid Cy5). Ustaliliśmy optymalne rozcieńczenie robocze dla anty-CD11b, wykonując opisany protokół z wyjątkiem kroku 1.17 i używając co najmniej 7 różnych rozcieńczeń anty-CD11b, jak podano w tabeli 1. W rezultacie wybrano rozcieńczenie 1:30 000 jako jedyne rozcieńczenie, w którym osiągnięto: 1) sygnał widzialny z Cy5 o długości fali wzbudzenia 646 nm; 2) brak sygnału z Alexa 546 przy długości fali wzbudzenia 532 nm. W ten sposób sygnał fluorescencyjny Alexa 546 jest selektywnie kojarzony z ekspresją CD68.

Optymalna zawartość rozcieńczeń dla przeciwciał anty-CD11b i anty-CD68 może się różnić w zależności od rodzaju tkanki i musi być określona przed rozpoczęciem protokołu wspólnego znakowania.

  1. Dwukrotnie przemyć kriosekcje mózgu PBS.
  2. Inkubować kriosekcje przez 5 minut w PBS zawierającym 1%H2O2(etap wymagany, ponieważ amplifikacja fluorescencyjna wymaga inkubacji z peroksydazą chrzanową, streptawidyną-HRP, patrz krok 1.12).
  3. Przemyć kriosekcje 2x PBS.
  4. Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,3% Triton.
  5. Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD11b Ab Rat [1:30 000], 10% NGS i 0,3% Triton.
  6. Przemyć kriosekcje 2x (5 min) PBS.
  7. Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym biotynylowany wtórny anty-Rat Ab [1:200] i 1% NGS.
  8. Przemyć kriosekcje 2x PBS.
  9. Przemyć kriosekcje TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
  10. Inkubować kriosekcje przez 1,5 godziny w TNB (bufor blokujący Tris-HCl-NaCl: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% odczynnik blokujący z odpowiedniego zestawu (patrz tabela odczynników)).
  11. Przemyć kriosekcje 3 razy trotylem.
  12. Inkubuj kriosekcje w TNB zawierające streptawidynę-HRP [1:100].
  13. Przemyć kriosekcje 3x trotylem.
  14. Inkubować kriosekcje przez 8 minut w rozcieńczalniku amplifikacyjnym zawierającym cyjaninę 5 Tyramid [1:300].
  15. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
  16. Inkubować kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym 10% NGS i 0,1% Triton.
  17. Inkubować kriosekcje w temperaturze 4 °C przez noc w PBS zawierającym pierwotny anty-CD68 Ab Rat [1:200], 3% NGS i 0,3% Triton.
  18. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
  19. Inkubuj kriosekcje przez 60 minut w PBS zawierającym fluorsprzężony wtórny anty-Rat Ab Alexa 546 [1:500] i 1% NGS.
  20. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
  21. Inkubować kriosekcje przez 10 minut w PBS zawierającym Hoechst 1 μg/ml.
  22. Przemyj kriosekcje 3x PBS.
  23. Zamontuj kriosekcje w Prolong Gold.

2. Akwizycja obrazów trójwymiarowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Użyty tutaj mikroskop to mikroskop IX81 wyposażony w konfokalny moduł skanujący FV500 z 3 liniami laserowymi: Ar-Kr (488nm), He-Ne czerwony (646nm) i He-Ne zielony (532nm) oraz diodą UV.

  1. Wybierz lasery wzbudzające w zależności od długości fal barwników fluorescencyjnych, które mają być wzbudzone (czerwony He-Ne dla Cy5, CD11b; He-Ne zielony dla Alexa546, CD68 i dioda UV dla Hoechst, jądra).
  2. Wybierz najlepszą kombinację zwierciadła dichroicznego do zbierania sygnałów świetlnych.
  3. Ustaw rozdzielczość obrazu na co najmniej 800 x 600 pikseli.
  4. Zidentyfikuj obszar zainteresowania za pomocą epi-fluorescencji i stopniowo zwiększaj powiększenie do obiektywu 40X.
  5. Przełącz się na tryb laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).
  6. Uruchamiaj powtarzalne skanowanie, aby dostosować fotopowielacz (PMT) i wzmocnienie dla każdego kanału. Lasery mogą być włączane indywidualnie, aby ułatwić konfigurację. Utrzymuj wzmocnienie tak niskie, jak to możliwe, aby uniknąć niepożądanych sygnałów niespecyficznych.
  7. W przypadku wykonywania skanowania powtarzalnego przesuń element sterujący ostrością, aby zdefiniować dolne i górne krańce osi z (całkowita długość osi z = 10 μm).
  8. Zatrzymaj powtarzające się skanowanie.
  9. Określ rozmiar kroku. Powinien być jak najbardziej zbliżony do rozmiaru piksela (0,225 μm), aby uzyskać standardowy stosunek rozmiaru 1:1 na osi z.
  10. Aktywuj filtr Kalmana co najmniej 2 razy.
  11. Aktywuj tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć efektów przebijania.
    12. Przesuń się w
  12. połowie osi z i uruchom skanowanie sekwencyjne xy. Sprawdź konfigurację PMT i wzmocnienie (dobry stosunek sygnału do szumu). Jeśli wynik nie jest zadowalający, powtórz krok 2.6.
  13. Uruchom pobieranie xyz.
  14. Eksportuj dane jako plik multitiff. Każdy plik multitiff zawiera zazwyczaj 3 kanały kolorów (niebieski, zielony i czerwony) oraz 44 płaszczyzny ogniskowych.

3. Trójwymiarowy widok akwizycji konfokalnych i trójwymiarowego renderingu

Prześlij pliki multitiff do oprogramowania Imaris i przetwarzaj je w następujący sposób:

  1. Otwarte oprogramowanie.
  2. Wybierz widok przewyższający.
  3. Przekaż plik multitiff.
  4. Wybierz żądany kolor dla każdego kanału.
  5. Usuń szum z tła, zwiększając minimalną wartość na panelu regulacji wyświetlacza. Dostosuj każdy kanał indywidualnie.
  6. Przejdź do widoku przekroju. Poruszaj się wzdłuż osi z, szukając kolokalizacji (żółte piksele).
  7. Kliknij na żółty obszar, aby sprawdzić, czy kolokalizacja występuje wzdłuż osi z (tj. należy do obiektu bryłowego). Rzuty osi Z są widoczne w prawej i dolnej części rysunku.
  8. Zrób migawkę.
  9. Wróć, aby przewyższyć widok.
  10. Kadrowanie 3D w celu odizolowania komórki lub grupy komórek.
  11. Wybierz jeden kanał na panelu regulacji wyświetlacza.
  12. Wybierz konstruktora algorytmu przewyższania/powierzchni. Kroki algorytmu:
    1. Wybierz kanał.
    2. Zdefiniuj próg (użyj tej samej wartości minimalnej w panelu regulacji wyświetlania).
    3. Zdefiniuj zmianę rozmiaru.
    4. Zdefiniuj wygładzanie (najlepiej = 0,200).
    5. Określ wygląd koloru.
    6. Algorytm końcowy.
  13. Powtórz krok 3.12 dla każdego kanału.
  14. Usuń zaznaczenie opcji Kanały fluorescencji na panelu regulacji wyświetlacza i zaznacz wszystkie trzy powierzchnie.
  15. Przesuń głośność, aby znaleźć najlepszy widok.
  16. Zrób migawkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład wyników uzyskanych podczas przeprowadzania protokołów znakowania i akwizycji konfokalnej w obszarze niedokrwiennym jest zilustrowany na rysunkach 1A i 1B. Dwuwymiarowy widok uzyskanych obrazów pokazuje, że po dwudziestu czterech godzinach od niedokrwienia (A) marker lizosomalny CD68 (zielony) ulega ekspresji w przerostowych ameboidalnych komórkach CD11b (czerwonych) obecnych w niedokrwionym rdzeniu. W strefie granicznej (B) komórki dodatnie CD11...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokoły oparte na immunofluorescencji, a następnie trójwymiarową analizę konfokalną jako potężne podejście do badania lokalizacji i koekspresji markerów fenotypu M / M w obszarze niedokrwiennym (bardziej szczegółowa analiza znajduje się w odnośniku 6). Metoda ta łączy specyficzne barwienie odpowiedniego markera aktywacji M/M z trójwymiarowym obrazowaniem konfokalnym. Precyzyjne dostrojenie przeciwciał, surowicy i rozcieńczeń roboczych sprzężonych z fluorem pozwala na optymalny stosunek sy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stefano Fumagalli jest członkiem Fundacji Monzino.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materials
Rat Anti-mouse CD11bUprzejmie dostarczone przez Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Mediolan, Włochy
Rat Anti-mouse CD68 AbD SerotecMCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1 Stem Cell Technologies1404
H– CHST 33342Life technologiesH21492
Mysie jądra antynerwowe (NeuN)CHEMICONMAB377
Biotynilowane kozie przeciwciało anty-szczurzeJackson Immuno Research112-065-143
TSA Cyjanina 5 System Perkin ElmerNEL705A001KT
Prolong Gold InvitrogenP36930
Anty-szczur alexa 546InvitrogenA-11081
Anty mysz Alexa 488InvitrogenA-21121
Anty-królik Alexa 594InvitrogenA-11037
surowicy koziejLaboratoriaS-1000
Tritin X-100SigmaT8787
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigmaP4417-100
Equipment
Cryostat CM1850Mikroskop
Olympus IX81 Oprogramowanie Olympus
AnalySISOprogramowanie Olympus
Imaris 5.0Bitplane
Photoshop cs2Adobe Systems
Pakiety oprogramowania GraphPad Prism wersja 4.0Oprogramowanie GraphPad Inc.
Normalne wektory konfokalny Leica

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  2. Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).
  3. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat. Med. 17, 796-808 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).
  6. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).
  7. Zanier, E. R., et al. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma. Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).
  8. Capone, C., et al. Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE. 2, e373(2007).
  9. Bhatia, S., et al. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943(2011).
  10. Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages. Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).
  11. Gesuete, R., et al. Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury. Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).
  12. Sica, A., Mantovani, A. Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protoko y immunofluorescencjiCD11b CD68 Ym1model ogniskowego niedokrwieniatrwa e MCAOprzetwarzanie obraz w Imarisakwizycja w osi Ztryb skanowania sekwencyjnegoanaliza koekspresji marker w

Powiązane artykuły