Method Article

Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

DOI:

10.3791/50616

⸱

November 17th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan-Dearborn, 2Department of Surgery/Transplant, University of Illinois at Chicago, 3Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowa kontrola tlenu zapewnia więcej niż tylko wygodę i szybkość w porównaniu z komorami hipoksyjnymi do eksperymentów biologicznych. Zwłaszcza, gdy jest wdrażany poprzez dyfuzję przez membranę, tlen mikroprzepływowy może zapewnić jednoczesną modulację fazy ciekłej i gazowej na poziomie mikroskali. Technika ta umożliwia dynamiczne eksperymenty wieloparametryczne, które mają kluczowe znaczenie dla badania patofizjologii wysp trzustkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoczesne natlenianie i monitorowanie czynników sprzęgających bodziec-wydzielanie glukozy w jednej technice jest kluczowe dla modelowania patofizjologicznych stanów niedotlenienia wysp trzustkowych, zwłaszcza w środowiskach po przeszczepach. Standardowe techniki komory hipoksyjnej nie są w stanie modulować obu stymulacji w tym samym czasie ani zapewniać monitorowania w czasie rzeczywistym czynników sprzężenia bodziec i wydzielanie glukozy. Aby rozwiązać te trudności, zastosowaliśmy wielowarstwową technikę mikroprzepływową, aby zintegrować modulacje zarówno fazy wodnej, jak i gazowej za pomocą membrany dyfuzyjnej. W ten sposób tworzy się warstwa stymulująca wokół mikroskalowanych wysepek w przezroczystym urządzeniu z polidimetylosiloksanu (PDMS), umożliwiając monitorowanie wyżej wymienionych czynników sprzęgających za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo dopływ gazu jest kontrolowany przez parę mikrodozowników, zapewniających ilościowe, subminutowe modulacje tlenu w zakresie 0-21%. To przerywane niedotlenienie jest stosowane do badania nowego zjawiska wstępnego kondycjonowania wysp trzustkowych. Co więcej, uzbrojeni w mikroskopię multimodalną, byliśmy w stanie przyjrzeć się szczegółowej dynamice kanału wapnia i KATP podczas tych zdarzeń hipoksyjnych. Przewidujemy, że niedotlenienie mikroprzepływowe, zwłaszcza ta jednoczesna technika dwufazowa, będzie cennym narzędziem w badaniu wysp trzustkowych, a także wielu tkanek ex vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne niedotlenienie jest ważne w biologii, szczególnie w przypadku przeszczepów wysp trzustkowych.

Dynamiczne niedotlenienie jest ważnym parametrem fizjologicznym i patofizjologicznym w wielu tkankach biologicznych. Na przykład zmiana tlenu jest silnym sygnałem rozwojowym w angiogenezie. Co więcej, wzorce przestrzenne i czasowe w niedotlenieniu modulują HIF1-alfa i odgrywają rolę w chorobach takich jak rak trzustki. Niedotlenienie jest również czynnikiem zakłócającym wpływającym na wyniki przeszczepu wysp trzustkowych. Ostatnio czasowe oscylacje hipoksji lub przerywanego niedotlenienia (IH) wykazały korzyści w "wstępnym kondycjonowaniu" ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mysich wysepek

  1. Rozwiń myszy C57BL / 6 i wyizoluj wysepki przez trawienie kolagenazy i separację gradientu gęstości Ficoll. (Patrz artykuły JOVE, o których mowa w2,3).
  2. Inkubować wysepki w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 20 mM HEPES na szalkach Petriego (37 °C, 5% CO2 ). Po izolacji, hoduj wysepki przez 24 godziny przed użyciem w eksperymentach. Użyj wysepek w ciągu 1-2 dni, aby zapewnić spójne rezultaty.

2. Tworzenie platformy mikroprzepływowej

  1. Wygeneruj geometrie mikrostruktury na przezroczystych fotomaskach dla każdej warst....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe dla tej techniki niedotlenienia wysp trzustkowych jest możliwość modulowania stymulacji fazy wodnej i gazowej w tej samej komorze mikroprzepływowej z fazami przejściowymi w skali minutowej. Rysunek 1 jest reprezentatywnym wynikiem a) podwójnej stymulacji i b) szybkich modulacji zmierzonych w komorze wysepek. Modulacja wodna, przejawiająca się przez wprowadzenie fluoresceiny do komory, osiąga równowagę w ciągu trzech do czterech minut mieszania. Co więcej, tlen może być zwiększany w zakresie 5-21.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele modalności zintegrowanych z tą techniką niedotlenienia wysp trzustkowych przedstawia kilka punktów wymienionych tutaj do rozwiązywania problemów. Po pierwsze, izolowane wysepki nadal ulegają degradacji i rozpadają się w hodowli z powodu enzymów trawiennych z komórek groniastych. Standaryzacja eksperymentów do 1-2 dni po izolacji wysp trzustkowych ma zatem kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych wyników. Po drugie, przepływ wodny został zatrzymany podczas niedotlenienia i przerywanego niedotlenienia, aby zapobiec .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) oraz Chicago Diabetes Project.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Odczynnik/Materiał
SpinnerLaurellWS-400
SU8MicroChemSU8-2150/SU8-2100
Cyfrowa płyta grzejnaPMC Tabliczka znamionowa722A Lampa
utwardzająca UVOmniCureS1000
PMDSDow ChemicalSylgard 184
Corona WandETPBD-20AC
Komora próżniowaBel-Art420220000
MikrodozownikiThe Lee CompanyIKTX0322000A
V i 20 V DCPower Radio Shack
NI USBNational InstrumentNI USB-6501
TermometrOmega Engineering, Inc.
Pompa perystaltycznaGilsonMinipulse 2
Czujnik tlenuOcean OpticsNeoFox
Kolektor frakcjiGilson203
PippetteFisher ScientificFinnpipette II 100μ l
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyLeicaDMI 4000B
50 ml Rurki stożkoweFisher Scientific
Fura-2 Sondy molekularne z barwnikiem fluorescencyjnym, Life Technologies
Sondy molekularnez barwnikiem fluorescencyjnym Rhodamine 123
Pożywki hodowlaneSigma-AldrichRPMI-1640
HEPESSigma-Aldrich
GlukozaSigma-Aldrich
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich
30 w silikonowych rurkachCole-Parmer1/16 cala x 1/8
cala 1,5 ml Probówki EppendorfFisher Scientific
Y-connectorsCole-ParmerZłącza strzykawkowe 1/16 cala i 4 mm
Cole-Parmerżeńskie Wtyk Luer 1/16 cala
Złącza prosteCole-Parmer1/16 cala
Złącze kolankoweCole-Parmer1/16 cala
5, Life Technologies

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
  2. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreati....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic HypoxiaOxygen ModulationIslet IsolationFluorescence MicroscopyPDMS DeviceGas Permeable MembraneCalcium DynamicsKATP ChannelIntermittent HypoxiaGlucose Stimulus

Related Articles