Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

Summary

Mikroprzepływowa kontrola tlenu zapewnia więcej niż tylko wygodę i szybkość w porównaniu z komorami hipoksyjnymi do eksperymentów biologicznych. Zwłaszcza, gdy jest wdrażany poprzez dyfuzję przez membranę, tlen mikroprzepływowy może zapewnić jednoczesną modulację fazy ciekłej i gazowej na poziomie mikroskali. Technika ta umożliwia dynamiczne eksperymenty wieloparametryczne, które mają kluczowe znaczenie dla badania patofizjologii wysp trzustkowych.

Abstract

Jednoczesne natlenianie i monitorowanie czynników sprzęgających bodziec-wydzielanie glukozy w jednej technice jest kluczowe dla modelowania patofizjologicznych stanów niedotlenienia wysp trzustkowych, zwłaszcza w środowiskach po przeszczepach. Standardowe techniki komory hipoksyjnej nie są w stanie modulować obu stymulacji w tym samym czasie ani zapewniać monitorowania w czasie rzeczywistym czynników sprzężenia bodziec i wydzielanie glukozy. Aby rozwiązać te trudności, zastosowaliśmy wielowarstwową technikę mikroprzepływową, aby zintegrować modulacje zarówno fazy wodnej, jak i gazowej za pomocą membrany dyfuzyjnej. W ten sposób tworzy się warstwa stymulująca wokół mikroskalowanych wysepek w przezroczystym urządzeniu z polidimetylosiloksanu (PDMS), umożliwiając monitorowanie wyżej wymienionych czynników sprzęgających za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo dopływ gazu jest kontrolowany przez parę mikrodozowników, zapewniających ilościowe, subminutowe modulacje tlenu w zakresie 0-21%. To przerywane niedotlenienie jest stosowane do badania nowego zjawiska wstępnego kondycjonowania wysp trzustkowych. Co więcej, uzbrojeni w mikroskopię multimodalną, byliśmy w stanie przyjrzeć się szczegółowej dynamice kanału wapnia i K_ATP podczas tych zdarzeń hipoksyjnych. Przewidujemy, że niedotlenienie mikroprzepływowe, zwłaszcza ta jednoczesna technika dwufazowa, będzie cennym narzędziem w badaniu wysp trzustkowych, a także wielu tkanek ex vivo.

Introduction

Dynamiczne niedotlenienie jest ważne w biologii, szczególnie w przypadku przeszczepów wysp trzustkowych.

Dynamiczne niedotlenienie jest ważnym parametrem fizjologicznym i patofizjologicznym w wielu tkankach biologicznych. Na przykład zmiana tlenu jest silnym sygnałem rozwojowym w angiogenezie. Co więcej, wzorce przestrzenne i czasowe w niedotlenieniu modulują HIF1-alfa i odgrywają rolę w chorobach takich jak rak trzustki. Niedotlenienie jest również czynnikiem zakłócającym wpływającym na wyniki przeszczepu wysp trzustkowych. Ostatnio czasowe oscylacje hipoksji lub przerywanego niedotlenienia (IH) wykazały korzyści w "wstępnym kondycjonowaniu" wysp trzustkowych¹. Jednak zarówno statyczny, jak i przejściowy wpływ niedotlenienia na fizjologię wysp trzustkowych nie został jeszcze dobrze poznany ani zbadany, głównie ze względu na brak odpowiednich narzędzi do kontrolowania mikrośrodowiska wysp trzustkowych.

Wysepki są dobrze unaczynione in vivo

.

Wysepki trzustkowe to sferoidalne agregaty komórek endokrynnych o wielkości 50-400 μm, w tym komórek beta i alfa, które są odpowiedzialne za homeostazę glukozy. Kiedy wyspy trzustkowe są wystawione na stymulujący poziom glukozy we krwi, wychwyt i glikoliza prowadzą do produkcji ATP, która otwiera wrażliwe na ATP kanały potasu (K_ATP) i powoduje napływ wapnia, który wyzwala egzocytozę granulek insuliny. Tlen jest ważny dla napędzania tego silnie metabolicznego procesu, a na wydzielanie insuliny znaczący wpływ ma dynamika przepływu krwi i dopływu tlenu, a także gradienty glukozy. Wyspy trzustkowe z łatwością wykonują tę odpowiedź glukozowo-insulinową in vivo, ponieważ są silnie perfundowane w trzustce, a każda z nich znajduje się w odległości jednej komórki od naczynia włosowatego. Jednak gęsta sieć naczyń włosowatych wewnątrz wysp jest usuwana przez kolagenazę podczas izolacji wysp trzustkowych^2,3. W związku z tym zarówno dopływ tlenu, jak i składników odżywczych jest ograniczony do obwodu 100 μm ze względu na ograniczenia dyfuzji.

Obecne techniki mają ograniczone sukcesy w odtwarzaniu mikrośrodowiska wysepek

.

Odtworzenie natywnej dynamiki tlenu i glukozy wysepek, kluczowej do modelowania warunków fizjologicznych i patofizjologicznych, jest trudne do osiągnięcia przy użyciu standardowych komór hipoksyjnych, które wymagają skomplikowanego przepływu i nie mają ciągłego monitorowania funkcji wysp. Co więcej, terapie transplantacyjne cukrzycy typu I narażają izolowane wyspy trzustkowe na niedotlenienie w układzie wrotnym wątroby⁴, który ma znacznie niższe pO₂ (<2%, 5-15 mmHg) w porównaniu z fizjologiczną trzustką (5,6%, 40 mmHg). Po przeszczepie przeszczepy wysp trzustkowych potrzebują dwóch tygodni lub dłużej, aby zostać ponownie unaczynione. Wykazano, że ekspozycja na niedotlenienie upośledza mechanizm sprzężenia glukozy i insuliny w wyspach trzustkowych. Wśród czynników sprzęgających bodziec-wydzielanie, sygnalizacja wapniowa, potencjały mitochondrialne i kinetyka insuliny mogą być łatwo monitorowane za pomocą mikrofluidyki. Nasza poprzednia technika mikroprzepływowa demonstrowała to monitorowanie w czasie rzeczywistym z precyzyjną modulacją mikrośrodowiska wodnego wokół pojedynczej wysepki^5,6. Jednak kwantyfikacja upośledzenia niedotlenienia wysp trzustkowych jest utrudniona ze względu na brak jednoczesnych technik stymulacji i monitorowania. Dlatego połączenie mikroprzepływowej kontroli tlenu i monitorowania wysp trzustkowych może poprawić badania nad niedotlenieniem wysp trzustkowych.

Mikrofluidyka może odtwarzać i modulować mikrośrodowisko wodne i tlenowe.

Standardowa technika badań niedotlenienia tkanek i hodowli opiera się na komorach hipoksyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, komory hipoksyjne zapewniają pojedyncze stężenia tlenu z czasami równowagi w ~10-30 minutach, niezgodne z dynamicznym hipoksją w skali minutowej. W dwóch ostatnich badaniach wykorzystano małe niestandardowe komory do przerywanej ekspozycji na hipoksję na całych myszach, z sprzecznymi wynikami dotyczącymi odpowiedzi insulinowej wywołanej glukozą^7,8. Należy pamiętać, że na poziomie całego zwierzęcia wdychany tlen nie jest bezpośrednio przekształcany do naczyń włosowatych wysp trzustkowych_{pO 2}, ze względu na kontrole w układzie oddechowym. Co więcej, badania te nie mają znormalizowanych poziomów tlenu ani nie zapewniają pomiarów w czasie rzeczywistym na poziomie tkanek wysp trzustkowych.

Z drugiej strony, mikrofluidyka tlenowa może przekroczyć te ograniczenia, kontrolując tlen za pomocą sieci kanałów gazowych. Co więcej, mikrofluidyka jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo podczas modulacji tlenu, co obecnie nie jest możliwe w przypadku standardowych komór hipoksyjnych. Wiele z tych nowatorskich podejść mikroprzepływowych wykorzystuje przepuszczalność gazu polidimetylosiloksanu do rozpuszczania stężeń tlenu w mikrokanałach, które przepływają media przez komórki docelowe^9-14. Urządzenia te mają również zintegrowane wiele dyskretnych stężeń tlenu, czujniki tlenu oparte na fluorescencji, a nawet chemiczne wytwarzanie tlenu w układzie scalonym.

Mikrofluidyka oparta na solwatacji cieczy ma trudności z utrzymaniem stabilnych, ciągłych gradientów, ponieważ zależy to od mieszania konwekcyjnego, które jest wrażliwe na warunki przepływu. Dla porównania, technika, którą tutaj stosujemy, koncentruje się na zmniejszeniu ścieżki dyfuzji dostarczania tlenu. Solwatacja gazu i przepływ ścinający są eliminowane przez bezpośrednią dyfuzję tlenu przez błonę obsianą komórkami lub tkankami wysp trzustkowych. Usuwa to dodatkowe mikrofluidyki wymagane do kontrolowania solwatacji i zapobiega niepotrzebnemu naprężeniu ścinającemu wysp trzustkowych, które samo w sobie może wywołać uwalnianie insuliny. Platforma ta została wykorzystana do wykazania regulacji w górę reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w skrajnych warunkach hiperoksycznych, jak i hipoksyjnych (2-97% O₂) w hodowli komórkowej^1,15. Ze względu na bezpośrednie dostarczanie tlenu i usuwanie przepływu ścinającego, nasza platforma oparta na dyfuzji zapewnia optymalne rozwiązanie mikroprzepływowe do badania niedotlenienia wysp trzustkowych.

Stymulacja i monitorowanie multimodalne

Mikrofluidyka oparta na dyfuzji przynosi również dodatkowe korzyści, gdy jest dostosowana do badania mikrofizjologii wysp trzustkowych. Dzięki zastosowaniu membrany jako bariery dyfuzyjnej, ciecz może być odizolowana od modulacji tlenu, umożliwiając kontrolę stymulacji glukozy w wodzie niezależnie od stymulacji hipoksyjnej. Tworzy to jednoczesną stymulację przypominającą kanapkę, która przestrzennie wskazuje dostawę do wysepek. Ponadto, ponieważ gaz jest czasowo modulowany za pomocą skomputeryzowanych mikrowtryskiwaczy, możemy cyfrowo modulować stężenie tlenu od 21-0% z czasem przejściowym krótszym niż 60 sekund. Dynamiczna kontrola mikrośrodowiska tlenu i glukozy pod mikroskopem pozwala na multimodalny protokół w czasie rzeczywistym, który nie byłby możliwy lub niezwykle kłopotliwy przy użyciu standardowych komór hipoksyjnych. Za pomocą tego urządzenia monitorowano sygnalizację wapniową (Fura-AM), potencjały mitochondrialne (rodamina 123) i kinetykę insuliny (ELISA), aby uzyskać pełny obraz dynamicznej odpowiedzi glukozowo-insulinowej w warunkach niedotlenienia.

Protocol

1. Przygotowanie mysich wysepek

1. Rozwiń myszy C57BL / 6 i wyizoluj wysepki przez trawienie kolagenazy i separację gradientu gęstości Ficoll. (Patrz artykuły JOVE, o których mowa w^2,3).
2. Inkubować wysepki w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 20 mM HEPES na szalkach Petriego (37 °C, 5% CO_{2 ).} Po izolacji, hoduj wysepki przez 24 godziny przed użyciem w eksperymentach. Użyj wysepek w ciągu 1-2 dni, aby zapewnić spójne rezultaty.

2. Tworzenie platformy mikroprzepływowej

1. Wygeneruj geometrie mikrostruktury na przezroczystych fotomaskach dla każdej warstwy urządzenia: 1) wlot i wylot, 2) warstwa mikroprzepływowa glukozy z komorą peryfuzyjną (średnica 8 mm x 3 mm, 150 μl), 3) membrana 200 μm z mikrostudzienkami (średnica 500 μm, głębokość 100 μm) oraz 4) warstwy mikroprzepływowe gazu.
2. Aby wytworzyć warstwę wlotową i wylotową, należy wlać odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS na wysokość 1,5 mm do ślepej szalki Petriego i utwardzić w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Przebić porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm.
3. Aby wytworzyć warstwę mikroprzepływową glukozy, odwiruj dwie warstwy SU8-2150 o grubości 350 μm, aby utworzyć pojedynczą warstwę o grubości 700 μm na 4-calowej płytce krzemowej.
   1. Wystaw światło UV przez odpowiednią fotomaskę, aby przenieść wzór mikrokanałów na SU8 po wywołaniu, tworząc wzorzec o wysokości 700 μm.
   2. Wlej odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS na ten wzorzec na wysokość 3 mm i utwardź w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Przytnij ten PDMS do kształtu za pomocą żyletki.
   3. Przebić porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm oraz komorę o średnicy 8 mm.
4. Aby wytworzyć membranę 200 μm z mikrostudzienkami, należy obrócić SU8-2100 do 100 μm. Zastosuj tę samą litografię UV, aby przenieść wzory mikrostudzienek na ten wzorzec o wysokości 100 μm.
   1. Odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS należy odwirować na tym urządzeniu wzorcowym z prędkością 900 obr./min przez 30 sekund i utwardzić w temperaturze 80 °C przez 10 minut. Odwirować drugą warstwę na pierwszej w tych samych warunkach, w wyniku czego powstanie membrana PDMS o średnicy 200 μm zawierająca wzory mikrostudzienek.
   2. Przebij porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm przez tę membranę
5. Aby wytworzyć gazową warstwę mikroprzepływową, należy obrócić SU8-2100 do 100 μm. Zastosuj tę samą litografię UV, aby przenieść gazowe wzory mikroprzepływowe na ten wzorzec o wysokości 100 μm.
   1. Wlej odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS na ten wzorzec na wysokość 1,5 mm i utwardź w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Przytnij PDMS do kształtu za pomocą żyletki.
   2. Przebij porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm przez tę warstwę
6. Aby skleić wiele warstw, przygotuj je, czyszcząc taśmą klejącą, wystawiając na działanie łuku koronowego, a następnie wyrównując ręcznie w następującej kolejności.
   1. Przymocuj membranę do dolnej warstwy gazu za pomocą mikrostudzienek skierowanych do góry.
   2. Zwiąż mikroprzepływowy glukozę na błonie mikrostudzienki.
   3. Sklej warstwę wlotową i wylotową na samej górze, otaczając cały zespół.
   4. Wzmocnij wiązanie, dodając 1 kg masy na wierzch i piecz w temperaturze 100 °C przez 3 godziny.
7. Przetestuj szczelność gotowego urządzenia, ładując wodę do warstwy wodnej, a następnie zanurzając całe urządzenie pod wodą. Następnie przepuść powietrze przez warstwę gazu za pomocą pustej strzykawki.
8. Wysterylizuj urządzenia szczelne 70% etanolem przez warstwę wodną, a następnie przepłucz buforem PBS, w którym urządzenie jest przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

3. Konfiguracja mikrodozownika

1. Zaopatrz się w 2 mikrodozowniki, zasilacze 5 V i 20 V DC oraz cyfrową płytkę I/O do skonstruowania konfiguracji mieszania i dostarczania tlenu.
   1. Podłącz przewody sterujące mikrodozowników do dołączonych sterowników.
   2. Podłącz sterowniki do cyfrowej karty I/O na portach odpowiadających kontrolkom Labview.
   3. Podłącz zasilacze 5 V i 20 V do odpowiednich styków na jednostkach napędowych.
   4. Podłącz cyfrowe wejście/wyjście do laptopa, aby wykonać kody Labview do sterowania gazem (Dodatek).
2. Podłącz jeden mikrodozownik do azotu, a drugi do sprężonego powietrza, oba z 5% CO_{2 .} Ustaw oba gazy na 2 psi. Podłącz wyjścia dozowników w trójnik przed wejściem do urządzenia mikroprzepływowego.
3. Za pomocą urządzenia przetestowanego pod kątem szczelności scharakteryzuj przejściową reakcję modulacji tlenu poprzez cykliczne przełączanie mikrodozowników między 5-21% tlenu, jednocześnie mierząc tlen rozpuszczony w wodzie za pomocą światłowodowego czujnika tlenu (patrz lista wyposażenia i reprezentatywne wyniki).

4. Ustawianie przy mikroskopii

1. Zamontuj urządzenie na podgrzewanym stage na odwróconym mikroskopie.
2. Podłącz gazy 0% i 21%_O2 do urządzenia i skalibruj za pomocą sondy lambda.
3. Podłącz port wyjściowy mikrofluidyki glukozy do kolektora frakcji.
4. Przygotuj bufor wodorowęglanowy Krebsa Ringera (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO₃, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1 mM CaCl₂·2H₂O, 1,2 mM MgSO,₄·_7H2O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM glukozy podstawowej i 5% FBS.
5. Przygotować dwa roztwory buforowe zawierające odpowiednio 2 mM i 14 mM glukozy w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml skąpanych w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Podłączyć pompę perystaltyczną, aby pobrać bufor z prędkością 250 μl/min do rurki. Przełóż rurkę przez płytę grzejną o temperaturze 37 °C przed wejściem do urządzenia mikroprzepływowego.
7. Aby zabarwić wysepki, dodaj Fura-2 AM w DMSO i Rh123 w 100% etanolu do 2 ml KRB, aby osiągnąć końcowe stężenie barwnika odpowiednio 5 μM i 2,5 μM.
8. Pobrać wysepki za pomocą pipety o pojemności 10 μl i inkubować w barwnikach przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
9. Załaduj około 20 wysepek do urządzenia przez wlot mikrokanału glukozy. Skierować wysepki do komory, zalewając bufor z wylotu z powrotem do wlotu.
10. Płucz wysepki w buforze przez 10 minut, aby zmyć nadmiar barwników.

5. Prowadzenie jednoczesnej stymulacji tlenem i glukozą

1. Dostarcz impuls stymulacji glukozy z 5-minutową wartością bazową ustaloną przez KRB2, a następnie 15-minutową stymulację 14 mM, a następnie myj przez 15 minut w KRB2.
2. Zapis długości fali wzbudzenia 340/380 nm dla Fura-2 i emisji 534 dla Rh123.
3. Wykonuj pomiary normalnego impulsu (14 mM normoksycznego) przed każdym eksperymentem.
4. W przypadku modulacji tlenu (niedotlenienie/przerywane niedotlenienie) należy stosować przepływ buforowy tylko podczas etapów stymulacji i płukania, a nie przepływ na innych etapach, aby zminimalizować zakłócenia konwekcyjne.
5. Zbieraj ścieki z ujścia glukozy w odstępach 1-minutowych do testu insulinowego ELISA.

Results

Kluczowe dla tej techniki niedotlenienia wysp trzustkowych jest możliwość modulowania stymulacji fazy wodnej i gazowej w tej samej komorze mikroprzepływowej z fazami przejściowymi w skali minutowej. Rysunek 1 jest reprezentatywnym wynikiem a) podwójnej stymulacji i b) szybkich modulacji zmierzonych w komorze wysepek. Modulacja wodna, przejawiająca się przez wprowadzenie fluoresceiny do komory, osiąga równowagę w ciągu trzech do czterech minut mieszania. Co więcej, tlen może być zwiększany w zakresie 5-21...

Discussion

Wiele modalności zintegrowanych z tą techniką niedotlenienia wysp trzustkowych przedstawia kilka punktów wymienionych tutaj do rozwiązywania problemów. Po pierwsze, izolowane wysepki nadal ulegają degradacji i rozpadają się w hodowli z powodu enzymów trawiennych z komórek groniastych. Standaryzacja eksperymentów do 1-2 dni po izolacji wysp trzustkowych ma zatem kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych wyników. Po drugie, przepływ wodny został zatrzymany podczas niedotlenienia i przerywanego niedotlenienia, aby zapobiec ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik/Materiał
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Cyfrowa płyta grzejna	PMC Tabliczka znamionowa	722A Lampa
utwardzająca UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Komora próżniowa	Bel-Art	420220000
Mikrodozowniki	The Lee Company	IKTX0322000A
V i 20 V DC	Power Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termometr	Omega Engineering, Inc.
Pompa perystaltyczna	Gilson	Minipulse 2
Czujnik tlenu	Ocean Optics	NeoFox
Kolektor frakcji	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny	Leica	DMI 4000B
50 ml Rurki stożkowe	Fisher Scientific
Fura-2 Sondy molekularne z barwnikiem fluorescencyjnym	, Life Technologies
Sondy molekularne	z barwnikiem fluorescencyjnym Rhodamine 123
Pożywki hodowlane	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glukoza	Sigma-Aldrich
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich
30 w silikonowych rurkach	Cole-Parmer		1/16 cala x 1/8
cala 1,5 ml Probówki Eppendorf	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		Złącza strzykawkowe 1/16 cala i 4 mm
	Cole-Parmer		żeńskie Wtyk Luer 1/16 cala
Złącza proste	Cole-Parmer		1/16 cala
Złącze kolankowe	Cole-Parmer		1/16 cala