Artykuł metodologiczny

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/50618

⸱

15 października 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia ilościowe określanie wewnątrzkomórkowych biomolekuł w wielu pojedynczych komórkach równolegle. W tym celu komórki są pasywnie uwięzione w środku mikrokomory. Po aktywacji warstwy kontrolnej komórka jest izolowana od otaczającej objętości w małej komorze. Otaczająca objętość może być następnie wymieniana bez wpływu na izolowaną komórkę. Jednak po krótkim otwarciu i zamknięciu komory, roztwór w komorze może zostać wymieniony w ciągu kilkuset milisekund. Ze względu na odwracalność komór, komórki mogą być wystawiane na działanie różnych roztworów sekwencyjnie w wysoce kontrolowany sposób, np. w celu inkubacji, mycia i wreszcie lizy komórek. Szczelnie zamknięte mikrokomory umożliwiają zatrzymanie lizatu, minimalizują i kontrolują rozcieńczenie po lizie komórek. Ponieważ liza i analiza zachodzą w tym samym miejscu, zachowana jest wysoka czułość, ponieważ podczas transportu nie dochodzi do dalszego rozcieńczania lub utraty analitów. Konstrukcja mikrokomory umożliwia zatem wiarygodną i powtarzalną analizę bardzo małej liczby kopii cząsteczek wewnątrzkomórkowych (attomole, zeptomole) uwalnianych z pojedynczych komórek. Co więcej, wiele mikrokomór można ułożyć w formacie matrycy, co pozwala na analizę wielu komórek jednocześnie, pod warunkiem, że do monitorowania używane są odpowiednie instrumenty optyczne. Wykorzystaliśmy już platformę do badań potwierdzających słuszność koncepcji w celu analizy białek wewnątrzkomórkowych, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników w sposób względny lub bezwzględnie wymierny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele badań w przeszłości ujawniło różnice między komórkami w dużej populacji komórek1-3, w szczególności procesy sygnalizacyjne4, lub ilości wewnątrzkomórkowych biomolekuł, takich jak białka5,6, metabolity i kofaktory7,8. Uważa się, że te niejednorodności mają fundamentalne znaczenie dla adaptacji i ewolucji komórek9, ale odgrywają również kluczową rolę w powstawaniu i leczeniu chorób takich jak rak10-13. Dlatego badania na poziomie pojedynczych komórek cieszą się dużym zainteresowaniem w badaniach biologicznych i farmakologicznych, zwłaszcza jeśli badania te ujawniają różne reakcje komórek po leczeniu bioaktywnymi substancjami chemicznymi.

W ostatnich latach powstało wiele platform analitycznych, które ułatwiają analizę pojedynczych żywych komórek lub składu chemicznego zawartości komórek. Podczas gdy sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest złotym standardem w bardzo wysokoprzepustowej analizie pojedynczych żywych komórek, metoda ta nie może być stosowana do ilościowego oznaczania związków wewnątrzkomórkowych lub wydzielanych. Pojawienie się platform mikroprzepływowych dało nadzieję na opracowanie nowych strategii analitycznych w zakresie pozycjonowania, leczenia i obserwacji pojedynczych komórek. Kamień milowy w dziedzinie mikrofluidyki został osiągnięty dzięki integracji elastycznych zaworów PDMS zrealizowanej przez Quake'a i współpracowników14,15. Zawory te są przydatne, ponieważ mogą izolować regiony na chipie, np. oddzielać dwie kultury 16. Ponadto mają one szczególne zastosowanie do analizy pojedynczych komórek, a tym samym pomagają zmniejszyć problemy z rozcieńczaniem analitu. Moc tego podejścia do analizy pojedynczych komórek została niedawno zademonstrowana przez Hansena i współpracowników, którzy przeanalizowali ekspresję genów z setek pojedynczych komórek równolegle17.

Gdy skupiasz się na białkach i metabolitach, analiza jest bardzo trudna ze względu na brak odpowiednich metod amplifikacji, dużą liczbę różnych obecnych związków i ich różnice w naturze chemicznej. Ponadto oczekuje się, że większość biomolekuł wewnątrzkomórkowych będzie obecna w małej liczbie kopii rzędu kilku dziesięciu tysięcy18, stąd zastosowana metoda analityczna musi charakteryzować się wysoką czułością. Bardziej zaawansowane testy, takie jak testy immunologiczne i testy immunologiczne sprzężone z enzymami (ELISA), są trudne do zintegrowania z urządzeniami mikroprzepływowymi, ponieważ wymagają kilku etapów mycia i inkubacji, a także unieruchomienia powierzchni.

Ze względu na te wyzwania, nie jest zaskakujące, że zgłoszono tylko kilka przykładów, w których białka lub metabolity zostały określone ilościowo na poziomie pojedynczej komórki. Na przykład badania nad wydzielaniem związków fluorescencyjnych zostały opisane19,20. Niedawno przedstawiono implementację testu ELISA do analizy wydzielanych (niefluorescencyjnych) białek z hodowli komórkowej (komórki THP-1)21 i pojedynczych komórek (immunologicznych)10. Koncentrując się na białkach wewnątrzkomórkowych, Shi i in. opracowali urządzenie mikroprzepływowe, które ułatwiło identyfikację białek wewnątrzkomórkowych do analizy szlaków sygnałowych w komórkach nowotworowych za pomocą testu immunologicznego11. Jednak określono tylko względne ilości białek i nie zastosowano amplifikacji enzymatycznej w celu zwiększenia sygnału dla białek o niskiej obfitości.

Ostatnio udało nam się połączyć mikrourządzenie do wychwytywania pojedynczych komórek z testami fluorescencyjnymi8 i testami immunologicznymi22 (Rysunek 1). Komórki są pasywnie uwięzione w mikrorozmiarach strukturach barierowych, które umożliwiają dostarczanie i (szybką) wymianę pożywki i innych środków chemicznych bez żadnego ruchu komórek. Zawór w kształcie pierścienia wokół każdej pułapki umożliwia odizolowanie komórki w bardzo małej objętości ("mikrokomora"). Zastawka ta jest uruchamiana natychmiast po wprowadzeniu buforu lizującego komórki (hipoosmolarnego), zapobiegając w ten sposób dyfuzji cząsteczek wewnątrzkomórkowych lub wydzielanych cząsteczek. Co najważniejsze, ze względu na mały rozmiar objętości (625 pl) unika się dużego rozcieńczenia cząsteczek. Ponadto, ponieważ liza i analiza są przeprowadzane w tej samej pozycji w chipie, nie ma strat analitów w wyniku transportu. Opisana tutaj konstrukcja chipa składa się z 8 naprzemiennych rzędów po 7 lub 8 mikrokomór, co daje łącznie 60 mikrokomór. Komory są uruchamiane w rzędach, tak aby wykluczyć zanieczyszczenie krzyżowe wzdłuż linii.

Platforma może być używana w połączeniu z testami fluorescencyjnymi, jak również immunologicznymi (Rysunek 1d). Dla tych ostatnich ustaliliśmy protokoły immobilizacji przeciwciał, które są kompatybilne z procesem produkcji i montażu chipów. W związku z tym platforma otwiera drogę do czułych, wiarygodnych i wymiernych testów na poziomie pojedynczej komórki. Do tej pory używaliśmy tego urządzenia do analizy enzymów wewnątrzkomórkowych i wydzielanych (względna kwantyfikacja za pomocą testów enzymatycznych), kofaktorów wewnątrzkomórkowych, białek i małych cząsteczek (bezwzględna kwantyfikacja za pomocą testów końcowych lub ELISA). Poniżej opisano proces wytwarzania chipów za pomocą wielowarstwowej miękkiej litografii oraz protokoły modelowania przeciwciał za pomocą druku mikrokontaktowego i chemii powierzchni. Dodatkowo podano kilka przykładów użycia i operacji na chipach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Główna produkcja SU-8

Przygotuj obie główne formy dla kanałów (fluidic i control, schematy i wymiary patrz Rysunek 2) z następującym protokołem, ale z różnymi wzorami masek. Proces ten przedstawiono na rysunku 3a.

  1. Zacznij od podgrzania 4-calowej płytki krzemowej przez 10 minut w temperaturze 180 °C. Załaduj odwodnioną płytkę do maszyny do powlekania i użyj następującego protokołu do powlekania wirowego SU-8 2015:
    1. Wirować wafel z prędkością 100 obr./min przez 20 sekund (otworzyć pokrywę wirówki, na tym etapie dozować SU-8, po dozowaniu zamknąć pokrywę).
    2. Wiruj wafel z prędkością 500 obr./min przez 10 sekund (spowoduje to rozprowadzenie oporu na całej płytce).
    3. Wiruj wafel z prędkością 1 750 obr./min przez 30 sekund (określa wysokość rezystu do 20 μm).
  2. Usuń opór z krawędzi płytki za pomocą acetonu (użyj wacika), ponieważ w przeciwnym razie przyklei się on do płyty grzejnej w następnym kroku. Przenieś wafel na płytę grzejną w temperaturze 95 °C i podgrzewaj przez 4 minuty. Po miękkim wypieku naświetl rezystor przez fotomaskę przyklejoną taśmą do szkła sodalimowego w wyrównywaczu maski ze światłem UV (150 mJ/cm2, mierzone przy 365 nm).
  3. Po ekspozycji ponownie podgrzej wafel w temperaturze 95 °C przez 5 minut na płycie grzejnej. Schłodź wafel do temperatury RT, a następnie zanurz go w kąpieli wywoływacza SU-8 na 4 minuty. Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć nienaświetlony SU-8. Umyj wafel izopropanolem klasy do pomieszczeń czystych i wysusz suszarką z azotem. Sprawdź pod mikroskopem, czy rozwój się powiódł (zwłaszcza pułapki komórkowe). Jeśli pułapki komórkowe są całkowicie rozwinięte, odbicie płytki krzemowej powinno być widoczne. W razie potrzeby ponownie rozwijaj wafel przez kilka minut.
  4. Piecz wafel w piekarniku przez 2 godziny w temperaturze 180 °C, aby usunąć wszystkie pozostałości rozpuszczalnika. Sprawdź wysokość kanałów za pomocą profilera schodkowego. Jeśli wysokość różni się od żądanej, powtórz ten protokół, zaczynając od kroku 1.1 z nową płytką i zmień prędkość wirowania (krok 1.1.3). Zakończ wytwarzanie formy wzorcowej, silanizując płytkę za pomocą 1H,1H,2H,2H-perfluorodecylo-dimetylochloro-silanu w eksykatorze przez noc.

2. Mistrzowska produkcja dla druku mikrokontaktowego

  1. W celu przygotowania form wzorcowych do druku mikrokontaktowego, należy odwodnić płytkę silikonową przez 10 minut w temperaturze 180 °C. Na tę płytkę należy nałożyć 1 ml HDMS z prędkością 7 500 obr./min przez 30 sekund (rezystor lepiej przylega do silanizowanej powierzchni). Przędzić 2 ml dodatniego rezystu AZ1518 z tym protokołem:
    1. Statyczne dozowanie rezystu na płytkę.
    2. Wiruj wafel przez 5 sekund z prędkością 500 obr./min.
    3. Wiruj wafel przez 60 sekund z prędkością 4000 obr./min.
  2. Po 50-sekundowym miękkim pieczeniu w temperaturze 100 °C na płycie grzejnej, wystaw rezystor na działanie światła UV (21 mJ/cm2 przy 365 nm) przez fotomaskę i na wyrównywacz maski. Rozwinąć rezystor w kąpieli AZ 726 przez 75 sekund. Opłukać rozwinięty wafel wodą DI i wysuszyć suszarką z azotem. Usunąć pozostałości rozpuszczalnika, ogrzewając wafel w temperaturze 115 °C przez 50 sekund. Sylanizuj wafel w próżni przez noc.

3. Produkcja chipa mikroprzepływowego

Do tych eksperymentów używany jest dwuwarstwowy projekt urządzenia. Obie warstwy są przygotowywane oddzielnie i łączone ze sobą, zanim chip zostanie ostatecznie przyklejony do szkiełka podstawowego (rysunek 3b). Ten krok opisuje produkcję warstw PDMS i stempla PDMS do druku mikrokontaktowego.

  1. Przygotuj mieszaninę PDMS i utwardzacza w proporcji 10:1. Przygotuj w sumie około 80 g PDMS (korzystając z naszych projektów, da to 10 chipsów). Energicznie wymieszaj obie części i odgazuj PDMS, aż mieszanina będzie pozbawiona pęcherzyków (~30 min).
  2. Umieść wafel z warstwą kontrolną wewnątrz szalki Petriego i przyklej go do dna. Następnie wlej ~50 g PDMS na wierzch i wstaw wafel na co najmniej 2 godziny do piekarnika w temperaturze 80 °C, aby zapewnić całkowite utwardzenie PDMS. Powtórz tę samą procedurę dla mikrokontaktowej płytki drukarskiej, do tego potrzebne jest ~20 g PDMS.
  3. Powlekanie PDMS na płytce warstwą fluidyczną z prędkością obrotową 2 000 obr./min, aby utworzyć warstwę PDMS o wysokości około 40 μm. Utwardzać PDMS w piekarniku przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 80 °C.
  4. Po utwardzeniu obu części usuń warstwę kontrolną z wafla i pokrój na kawałki żyletką. Przebić otwory przyłączy ciśnieniowych za pomocą dziurkacza do biopsji 1 mm. Do przechowywania zaleca się nałożenie kawałka taśmy na kanały.
  5. Aby połączyć dwie warstwy, weź powlekaną wirowo płytkę i górną część i umieść je w czyszczalni plazmowej23. Po obróbce plazmowej szybko wyrównaj obie części pod mikroskopem z dużą odległością roboczą. Dodaj trochę zapasowego PDMS wokół umieszczonych górnych części. Ten krok nie jest obowiązkowy, jednak ułatwia usunięcie PDMS z płytki. Umieść wafel w piekarniku nagrzanym do 80 °C na co najmniej 1 godzinę.
  6. Użyj skalpela, aby ostrożnie usunąć PDMS z płytki i przeciąć mikroczipy. Przebić otwory dostępowe do połączeń płynowych za pomocą dziurkacza do biopsji 1,5 mm.
  7. Chip PDMS jest teraz gotowy i może być przechowywany przez wiele miesięcy. Opcjonalnie: Jeśli chip jest używany ze zbiornikiem, odetnij górną część końcówki pipety o pojemności 200 μl i użyj zapasowej, częściowo utwardzonej PDMS, aby przykleić ją na wierzchu. Włóż frytki ponownie do piekarnika w temperaturze 80 °C na co najmniej 1 godzinę.

4. Klejenie do szkiełka

Aby użyć urządzenia do bezpośrednich testów enzymatycznych, jedynym krokiem wymaganym po klejeniu jest zablokowanie powierzchni. W przypadku tego protokołu przejdź do punktu A. Jednakże, aby użyć chipa mikroprzepływowego do testów immunologicznych lub ELISA, należy zapoznać się z protokołem B, aby ograniczyć miejsca wiązania tylko do szkiełka podstawowego (tj. w przypadku mikroskopii TIRF lub SPR). Jeśli to ograniczenie nie jest ważne, zapoznaj się z A, ale użyj biotynylowanych koniugatów w kroku 4.3 i kontynuuj krok 4.8 w protokole B, aby stworzyć w pełni funkcjonalną powierzchnię.

Przed wykonaniem protokołu A i B: Zaleca się przefiltrowanie wszystkich użytych roztworów białkowych przed wprowadzeniem ich do chipa. Szczątki i agregaty białkowe mogą w przeciwnym razie blokować pułapki komórkowe, zmniejszając w ten sposób liczbę komór, które można wykorzystać do analizy. W tym celu należy użyć niebiałkowej jednostki filtrującej adsorpcję, aby przefiltrować wszystkie roztwory przed wprowadzeniem ich do kanałów.

Protokół A (testy enzymatyczne)

  1. Aby sfinalizować urządzenie mikroprzepływowe, przymocuj części PDMS do szkiełka podstawowego. Aby to zrobić, najpierw wyczyść szklane szkiełko mydłem, wodą destylowaną i etanolem. Osuszyć szkiełko za pomocą strumienia azotu. Wyczyść część PDMS taśmą klejącą.
  2. Włóż część PDMS i oczyszczone szkło do myjki plazmowej na 45 sekund przy 18 W. Aby zapewnić ścisłe wiązanie, umieść wiór na płycie grzejnej (100 °C) na 5 minut.
  3. Po sklejeniu napełnij chip płynami. Łatwym sposobem na osiągnięcie tego celu jest użycie siły odśrodkowej. Odetnij dolną część końcówki pipety o pojemności 200 μl. W przypadku kanałów płynowych należy je wypełnić roztworem blokującym (albumina surowicy bydlęcej (4% w/v) lub poli-L-lizyna) szczepionym glikolem polietylenowym (0,05% w/v) i umieścić końcówki we wlotach. Napełnić wloty warstwy kontrolnej wodą lub roztworem izosmotycznym, np. PBS. Umieść wiór w wirówce (800 x g) na 5 minut. Kanały powinny być teraz całkowicie wypełnione płynem. Jeśli nie, powtórz ten krok.
  4. Inkubować roztwór blokujący przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Wypłukać roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS z szybkością przepływu 10 μl/min za pomocą pompy strzykawkowej. Urządzenie jest teraz gotowe do eksperymentów z komórkami.

Protokół B (testy immunologiczne)

Pełny przegląd modyfikacji powierzchni od kroku 4.7 wzwyż, proszę zapoznać się z Tabelą 1.

  1. Inkubować stemple PDMS do drukowania mikrokontaktowego z roztworem bBSA/BSA (np. 1-100). Po 30 minutach należy dokładnie oczyścić stemple wodą destylowaną i wysuszyć stempel pod strumieniem azotu. Szybko umieść stemple na oczyszczonym szkiełku podstawowym (Rysunek 4).
  2. Szklane szkiełko ze stemplem należy wystawić wraz z górną częścią chipa mikroprzepływowego na działanie plazmy tlenowej przez 45 sekund przy maksymalnej mocy (18 W) w myjce plazmowej. Po obróbce plazmowej usuń stempel i wyrównaj zadrukowaną powierzchnię pod mikrokomorami urządzenia. Umieść frytki na 30 minut na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C.
  3. Aby zablokować pozostałą powierzchnię, wprowadź sterylnie przefiltrowany roztwór BSA (4% (w/v) w PBS) do chipa za pomocą wirówki (patrz krok 4.2). Inkubować przez 1 godzinę i wypłukać roztwór z warstwy płynu za pomocą PBS (patrz krok 4.3). Chip może być następnie używany bezpośrednio lub przechowywany przez okres do 2 tygodni w temperaturze 4 °C w wilgotnym pudełku.
  4. Aby uzyskać w pełni funkcjonalną powierzchnię wiążącą, wprowadź awidynę (0,025% (w/v) w PBS) do zbiornika. Użyć natężenia przepływu 5 μl/min przez 30 minut, aby pobrać roztwór awidyny przez kanały płynu. Następnie spłukiwać PBS przez 10 minut. Dokładnie wypłucz zbiornik.
  5. Następnie dodaj białko G (0,0025% (w/v) w PBS) i spłukuj przez kolejne 30 minut. Następnie myj PBS przez kolejne 10 minut. Następnie dodaj interesujące Cię przeciwciało (0,0001% (w/v) w PBS) przez 10 minut. Po 10 minutach zatrzymaj przepływ na 15 minut, aby umożliwić wiązanie. Następnie myj PBS przez 10 minut.

5. Eksperymenty komórkowe

Protokół jest napisany ogólnie ze względu na różnorodność możliwych testów. Jako przykład podano odczynniki potrzebne do oznaczenia toksyczności G6PDH. Początkowa skuteczność wychwytywania komórek przez urządzenie wynosi około 2,5%, co oznacza, że 5 z 200 komórek zostanie uwięzionych. Ostateczne zajęcie pułapek komórkowych silnie zależy od użytej linii komórkowej, protokołu zawieszenia linii komórkowej i czasu przepłukiwania komórek przez kanał. W przypadku komórek naturalnie rosnących w zawiesinie (takich jak U937), pojedyncze komórki można znaleźć w około 75% komór po kilku minutach. Pozostałe komory albo nie są wypełnione, albo są zajęte przez dwie lub więcej komórek. Ogólnie rzecz biorąc, zajętość pojedynczej komórki jest mniejsza w przypadku przylegających linii komórkowych. W przypadku zastosowania przedstawionego tutaj dość łagodnego protokołu zawieszania, odsetek ten spada do około 30% (komórki HEK, MLT). Zajętość pojedynczych komórek można poprawić poprzez leczenie komórek trypsyną, ale może to również zmienić wyniki eksperymentów.

W zależności od docelowej cząsteczki, adsorpcja lub absorpcja do PDMS może mieć wpływ na wyniki. Adsorpcję można zmniejszyć, blokując powierzchnie za pomocą BSA lub PLL-g-PEG. Wchłanianie jest mało prawdopodobne w przypadku większości hydrofilowych biomolekuł, ale należy je sprawdzić pod kątem (małych) lipofilowych składników komórkowych.

  1. Przygotuj komórki zgodnie z określonym protokołem (np. dodawanie leku). W przypadku komórek zawiesinowych dodaj komórki bezpośrednio do chipa. W przypadku adhezyjnych linii komórkowych należy użyć bezenzymatycznego buforu dysocjacyjnego do wytworzenia zawiesiny komórkowej. Przefiltruj komórki przed wprowadzeniem ich do chipa, aby zmniejszyć liczbę klastrów komórek.
  2. Załaduj komórki do chipa za pomocą pompy strzykawkowej i przepływu do przodu, zamiast wycofywać zawiesinę ogniw. Stosować natężenie przepływu 5 μl/min dla linii komórek zawiesinowych i wyższe natężenie przepływu 10-20 μl/min dla komórek adhezyjnych, aby zmniejszyć niespecyficzne przyleganie komórek do ścianek kanału.
  3. Gdy pułapki zostaną napełnione, zamknij komory. Jeśli wiele komórek przylega niespecyficznie do powierzchni, spróbuj zmyć je buforem dysocjacyjnym komórek o natężeniu przepływu 10-30 μl/min.

Protokół A (testy enzymatyczne)

  1. Wycofaj bufor lizy przez chip. W tym przykładzie ten bufor jest buforem hipoosmolarnym z dodanym Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v/v) Tween 20). W przypadku lizy należy szybko otwierać i zamykać komory (tj. 500 ms dla natężeń przepływu 10-50 μl/min 7,21). Do testu G6PDH dodać 2 mM glukozo-6-fosforanu, 0,5 mM NADP, 0,5 U/ml diaforazy i 0,3 mM rezazuryny do buforu do lizy. Rozpocznij monitorowanie reakcji kinetycznej natychmiast po lizie.

Uwaga: Wybierz dowolny bufor, który jest odpowiedni do testu, jednak pamiętaj, że silne detergenty (takie jak Triton, SDS) natychmiast powodują lizę komórek i doprowadzą do utraty analitu podczas otwierania komory.

Protokół B (testy immunologiczne)

Krótki opis eksperymentów z komórkami ELISA (natężenia przepływu, stan komory, itp.), proszę znaleźć w Tabeli 1.

  1. W przypadku testu ELISA należy dodać wymagany odczynnik do wykrywania (np. przeciwciało drugorzędowe, antygen znakowany) bezpośrednio do buforu do lizy. Dodana animacja 20 zmniejsza niespecyficzną adsorpcję. Poddać komórki lizie zgodnie z krokiem 5.4. Inkubować mieszaninę przez 10-15 minut, aby umożliwić wiązanie (czas inkubacji zależy od użytego antygenu i przeciwciała).
  2. Koniugaty enzymatyczne przeciwciał, które niespecyficznie adsorbują się na ściankach kanału, mogą prowadzić do konwersji odczynnika detekcyjnego znajdującego się już w zbiorniku i kanałach. Aby zmniejszyć problemy związane z tą adsorpcją, należy przepłukać stały inhibitor użytego enzymu detekcyjnego przez chip w czasie inkubacji (komory zamknięte, przed dodaniem odczynnika wykrywającego). W przypadku HRP należy użyć 20 mM HCl w wodzie, aby trwale dezaktywować niespecyficznie zaadsorbowane enzymy.
  3. Po czasie inkubacji wprowadzić do chipa odczynnik detekcyjny (np. Amplex Red i nadtlenek wodoru do HRP). Ponownie krótko otworzyć komory, aby zmyć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe i dodać odczynnik wykrywający. Natychmiast rozpocznij monitorowanie reakcji kinetycznej.
  4. Kalibracja: Unieruchomić przeciwciało przeciwko obiektowi zainteresowania. Zamknij komory. Przygotuj różne stężenia analitu w buforze lub w lizacie komórkowym poza chipem. Nałóż stężenie na chip i szybko wymień objętość wewnątrz komór (czas otwarcia 500 ms). Ten czas otwarcia jest wystarczająco krótki, aby zapewnić, że w wyniku płukania analitu nie dojdzie do dodatkowej akumulacji i wykryta zostanie tylko określona liczba cząsteczek z objętości mikrokomory. Na podstawie znanego stężenia antygenu wewnątrz roztworu i objętości komory (625 pl) oblicz ilość wewnątrz komory. Następnie przejdź do kroku 5.5 i wprowadź ugrupowanie wykrywające.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza platforma jest w stanie analizować różne wewnątrzkomórkowe, jak również wydzielane cząsteczki obecne w pojedynczych komórkach lub przez nie wytwarzane. W tym miejscu chcielibyśmy przedstawić różne przykładowe badania, aby podkreślić różnorodność możliwych testów. Podamy przykład wydzielanego enzymu (ryc. 5a), a także enzymu wewnątrzkomórkowego (ryc. 5b) i białka (ryc. 5c i d). Więcej przykładów, takich jak kofaktory lub małe cząsteczki, można znale...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia mikrofluidyczna otworzyła nowe i fascynujące możliwości analizy pojedynczych komórek. W szczególności możliwość wychwytywania i unieruchamiania pojedynczych komórek za pomocą narzędzi mikroprzepływowych umożliwiła systematyczne krótko- i długoterminowe badania nad właściwościami i reakcją pojedynczych komórek. Dodatkowo, enkapsulacja komórek w mikrokropelkach o wysokiej częstotliwości, generowanych na mikrochipie, umożliwiła badania wydzielania pojedynczych komórek, których nie można przeprowadzić za pomocą k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Tomowi Robinsonowi za korektę manuskryptu, C. Bärtschiemu i H. Benzowi za zbudowanie specjalnie zbudowanego systemu kontroli ciśnienia. Chcielibyśmy również podziękować za korzystanie z obiektu clean room FIRST i Centrum Mikroskopii Świetlnej (LMC), oba na Politechnice Federalnej w Zurychu. Prace zostały sfinansowane przez Merck Serono i Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach 7 Programu Ramowego (ERC Starting Grant, nr projektu 203428, nμLIPIDs).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI:
Nazwa firmy odczynnikowejkatalogowyKomentarze (opcjonalnie)
SU-8 2015MicroChem Corp. (Netwon, MA)n.a.1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl-dimetylochloro-silan
ABCR (Karlsruhe, Niemcy)AB103608
4-metylolumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobiozydhydrat Sigma AldrichM9763
AcetonMerck VWR (Darmstadt, Niemcy)100014
AvidinAppliChem (Axon Lab AG)A-2568
AZ 1518AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Niemcy)n.a.AZ
726 developerAZ Electronic Materials (Wiesbaden, Niemcy)n.d.
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA-4503
Albumina surowicy bydlęcej, biotynaSigma AldrichA-8549
Bufor dysocjacyjny komórekInvitrogen13151-014
Heksametyldisilazan (HDMS)Sigma Aldrich40215
Kwas solnyFluka84422
IzopropanolMerck VWR (Darmstadt, Niemcy)109634
Chlorek magnezu sześciowodnyFluka63068
MR developer 600Microresist technology GmbH (Berlin, Niemcy)n.a.PBS
Invitrogen10010-031
PLL-g-PEG szczepionySuSoS, (Dü bendorf, Szwajcaria)n.a.PLL-g-PEG
biotyna szczepionaSuSoS, (Dü bendorf, Szwajcaria)n.d.Chlorek
potasuFluka60132
Białko G, biotynaSigma Fine Chemicals41624
Wafel krzemowySi-Mat (Kaufering, Niemcy)n.a.Sylgard
184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)Dow Corning39100000
Tris(hydroksymetylo)-aminomomBiorad
Tween 20Biorad1706531
SPRZĘT:
Nazwa materiałukatalogowy firmyKomentarze (opcjonalnie)
0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy PESTRP99722
Dziurkacz do biopsji 1/1,5 mmMiltex, York PA33-31AA/33-31A
Filtr komórkowy Trics 20 i mikro; mPartec04-004-2325
Wirówka Sigma 3-18KKuehnern.a.Płyta
grzejna HP 160 III BMSawatec, Saksofon, Szwajcarian.a.MA-6
wyrównywacz maskiKarl Suessn.a.Multizoom
Mikroskop AZ100MNikon Corporationn.a.Photomask
Microlitho, Essex, Wielka Brytanian.d
Myjka plazmowa PDC-32GHarrickn.a.Powlekarka
wirowa Modell WS-400 BZ-6NPP/LITELaurelln.a.Moduły
wirujące SM 180 BMSawatec, Sax, Szwajcariab.d.Profiler
krokowy Dektak XT AdvancedBrukern.a.Pompa
strzykawkowa mesysCetonin.d.
Numer 1610716 Numer .

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
  2. Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
  3. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  4. Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
  5. Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
  6. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
  7. Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
  8. Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
  9. Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  10. Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
  11. Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).
  13. Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
  14. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  15. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  16. Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
  17. White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
  18. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
  19. Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
  20. Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
  21. Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
  22. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.
  23. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
  24. Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microfluidic ChipSingle Cell AnalysisCell LysisFluorescence MicroscopyImmunoassay DetectionFluidic ControlPDMS FabricationChamber TrappingSolution ExchangeBiomolecule Quantification

Powiązane artykuły