Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stworzyliśmy nowatorski system obrazowania o wysokiej przepustowości do analizy zachowania 7-dniowych larw danio pręgowanego na wielotorowych płytkach. System ten mierzy spontaniczne zachowania i reakcję na bodziec awersyjny, który jest pokazywany larwom za pośrednictwem prezentacji PowerPoint. Zarejestrowane obrazy są analizowane za pomocą makra ImageJ, które automatycznie dzieli kanały kolorów, odejmuje tło i stosuje próg w celu identyfikacji rozmieszczenia poszczególnych larw w pasach. Następnie możemy zaimportować współrzędne do arkusza Excela, aby określić ilościowo prędkość pływania, preferencje dotyczące krawędzi lub boku pasa, zachowanie spoczynkowe, thigmotaxis, odległość między larwami i zachowanie unikające. Subtelne zmiany w zachowaniu są łatwo wykrywane za pomocą naszego systemu, dzięki czemu jest on przydatny do analiz behawioralnych po ekspozycji na toksyny środowiskowe lub farmaceutyki.
Wprowadzenie
Danio pręgowany stają się popularnym modelem dla nauk genetycznych, rozwojowych i behawioralnych 1-4. Wykluwają się z kosmówki po 2-3 dniach od zapłodnienia (dpf), rozwijają w pełni sprawne narządy po 4-5 dpf, a do 7 dpf 5,6 wykazują dużą liczbę zachowań. Larwy danio pręgowanego idealnie nadają się do wysokoprzepustowych analiz ze względu na ich niewielkie rozmiary 7,8. Oprogramowanie jest dostępne na rynku do zautomatyzowanych analiz zachowania larw i dorosłych ryb danio pręgowanego 9-14. Jednak to oprogramowanie może być drogie i ma ograniczone możliwości pomiaru złożonych zachowań larw danio pręgowanego na płytkach wielodołkowych.
Stworzyliśmy nowatorski system obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest tani w instalacji i może określić ilościowo wiele różnych zachowań u 7 dpf larw danio pręgowanego 15,16. System pozwala nam szybko i skutecznie testować subtelne nieprawidłowości behawioralne po ekspozycji embrionalnej na szereg farmaceutyków i toksyn środowiskowych 16-18.
System został zbudowany przy użyciu drewnianych szafek, które mieszczą kamerę cyfrową na górze szafki. Kamera jest skierowana w dół do dolnej części szafki, w której umieszczony jest laptop z ekranem skierowanym do góry 15. Obrazowanie poklatkowe służy do uchwycenia rozmieszczenia larw na pasach. Larwy mogą być umieszczane w maksymalnie czterech płytkach wielodołkowych lub wielopasmowych, które są umieszczone na górze ekranu laptopa. Używamy prezentacji PowerPoint jako bodźca awersyjnego, na który larwy reagują, oddalając się (unikanie) i płynąc w kierunku krawędzi (thigmotaxis) 15,17. Obrazy są importowane do ImageJ, w którym za pomocą zautomatyzowanego makra dzielone są kanały kolorów, odejmowanie tła i stosowanie progu w celu identyfikacji poszczególnych larw. Współrzędne są podane dla każdej larwy na każdym obrazie i można je wstawić do pliku Excel, którego używamy do ilościowego określenia zachowania unikania i tigmotaksji, odległości między rybami, prędkości pływania i ilości odpoczynku 16.
Protokół
1. Zbieranie zarodków danio pręgowanego i hodowla larw
- Szklane naczynia z Pyrexu ze "sztuczną" trawą (wykonaną z zielonej przędzy) (ryc. 1) należy włożyć do zbiorników o świcie i pozostawić na dwie godziny w celu zebrania zarodków danio pręgowanego. Szklane naczynia zawierające zarodki należy przelać na ręczne sitko i spłukać wodą dejonizowaną. Zarodki należy następnie hodować w wodzie jajecznej. Woda jajeczna zawiera 60 mg/l Instant Ocean w wodzie dejonizowanej i 0,25 mg/l błękitu metylenowego, który jest stosowany jako inhibitor pleśni.
- W zależności od hipotezy danego eksperymentu, zarodki mogą być leczone natychmiast lub w określonych stadiach rozwoju przy użyciu środków toksycznych lub farmaceutycznych. Substancje toksyczne i farmaceutyki są zwykle rozpuszczane w DMSO (w stężeniu 1,000X) i powinny być dalej rozcieńczane bezpośrednio w pożywce wodnej jaja.
- Podczas leczenia embrionów i larw farmaceutykami lub substancjami toksycznymi, larwy i zarodki mogą być trzymane na głębokich szalkach Petriego w gęstości około 50-60 larw na 50 ml aż do analiz behawioralnych przy 7 dpf (roztwór wody z jaj należy zmieniać co najmniej co drugi dzień, aby uniknąć rozwoju grzybów/bakterii z martwych zarodków).
2. Przygotowanie form do analiz behawioralnych
- Specjalnie opracowane formy z tworzywa sztucznego o wymiarach 11,7 cm x 7,6 cm x 5 mm zostały zbudowane na zamówienie. Formy są potrzebne do tworzenia pasów za pomocą agarozy, którą wlewa się do jednostudzienkowych plastikowych płytek firmy Thermo Scientific. Płytki jednodołkowe mają wymiary 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm.
- Formy zawierają pięć pasów, w których boki są ustawione pod kątem 60°. Pasy w formach mają wysokość 3,5 mm z podstawą 18 mm u góry, która jest najszersza, podczas gdy szerokość od dołu wynosi 14 mm. Między pasami w formie jest 4 mm odstęp (rysunek 2).
- Aby przygotować pasy, wlej 50 ml stopionej agarozy (0,8% agarozy w wodzie dejonizowanej z 60 mg/L Instant Ocean) do płytki z jednym dołkiem. Formę należy następnie bardzo powoli umieścić na wierzchu ciekłej agarozy, aby wyeliminować tworzenie się pęcherzyków i można ją usunąć, gdy agaroza ostygnie (co zajmuje około 45 minut).
- Pasy agarozy powinny być wykonane nie wcześniej niż jeden dzień przed przeprowadzeniem eksperymentu behawioralnego (aby uniknąć wysychania agarozy) Pasy można przechowywać w temperaturze pokojowej z pokrywkami na naczyniach przez około 36 godzin. Pasy agarozy powinny być używane tylko do jednego eksperymentu, a następnie powinny zostać wyrzucone.
3. Przechwytywanie obrazu
- W każdym pasie płytek można umieścić do 20 larw. Zazwyczaj używa się 5 larw na pas, aby ułatwić jak najdokładniejsze śledzenie prędkości pływania i zmniejszyć liczbę larw potrzebnych na eksperyment. Tory mogą być wypełnione wodą jajeczną z lub bez farmaceutyków lub toksyn, w zależności od eksperymentu. Pasy ruchu nie powinny być jednak wypełniane do końca, dopóki nie zostaną umieszczone w szafach do obrazowania; Zapobiegnie to przepełnieniu. Aby zapewnić spójność, larwy powinny mieć okres aklimatyzacji wynoszący dziesięć minut po umieszczeniu ich w foremkach agarozowych i umieszczeniu na ekranie laptopa. Skuteczne przenoszenie larw z szalki Petriego na pas agarozy pomoże zmniejszyć stres larw. Najłatwiej jest, gdy larwy są trzymane w płytkich zbiornikach lub na szalkach Petriego.
- W szafkach fotograficznych znajduje się aparat cyfrowy Canon używany do fotografii poklatkowej oraz laptop. Kamerę należy umieścić w górnej części obudowy i skierować w stronę dolnej części obudowy, gdzie należy umieścić laptopa z ekranem o przekątnej 15,6 cala z ekranem skierowanym do góry (Rysunek 3). Cztery płytki należy umieścić ręcznie bezpośrednio na ekranie laptopa. W tym czasie pasy ruchu można uzupełnić wodą jajeczną lub obróbką chemiczną, tak aby znajdowały się na poziomie górnej części pasa (w celu wyeliminowania cieni na krawędziach pasów na zdjęciach).
- Prezentacja PowerPoint jest używana jako bodziec awersyjny dla larw. W przeszłości ruchome czerwone kule pokazywano larwom danio pręgowanego na 6 lub 12 płytkach wielodołkowych 15,17,18. Bieżący program PowerPoint rozpoczyna się od pustego białego tła przez 15 minut, po którym następuje 15-minutowy ruchomy czerwony pasek w górnej połowie płyty (Rysunek 4). Aby wyeliminować przegrzanie larw, najlepiej kupić laptopa, którego temperatura ekranu nie przekracza 28 °C. Aby uniknąć parowania cieczy w obrębie pasów agarozy, maksymalny czas obrazowania powinien być ograniczony do mniej niż jednej godziny.
- Aparat cyfrowy powinien być zaprogramowany do fotografii poklatkowej, robiąc zdjęcia co 6 sekund, co daje łącznie 300 zdjęć na eksperyment. Jednak częstotliwość i długość można dostosować w zależności od eksperymentu i kwantyfikacji behawioralnej. W przeszłości stosowano wydłużone czasy obrazowania przy użyciu dłuższych odstępów między poszczególnymi obrazami. Kamerę można ustawić na niższą rozdzielczość do obrazowania z prędkością wideo (30 klatek na sekundę). Podczas gdy niższa rozdzielczość ogranicza nagrania do jednej płytki wielodołkowej, nagrania wideo są odpowiednie do obrazowania szybkich wydarzeń pływackich 15.
4. Analiza obrazu
- Obrazy powinny być otwierane za pomocą ImageJ i używane z makrem, które zostało specjalnie napisane wewnętrznie. Makro automatycznie dzieli kanały kolorów, aby można było usunąć czerwony kolor, odejmuje tło, stosuje próg i identyfikuje larwy na podstawie analizy cząstek. Najbardziej aktualnym makro do analizy larw z pięcioma pasami ruchu jest Zebrafish_macro25k. Użyj monitów w makrze, aby ustawić liczbę obrazów, kolor do odjęcia, próg obrazu itp.
- Po przepuszczeniu wszystkich obrazów przez makro ImageJ zostanie wyświetlony plik wyników, który będzie zawierał współrzędne x,y poszczególnych larw dla każdego obrazu wraz z numerem obrazu i numerem pasa.
- Plik wyników powinien być zapisany w formacie Excel i posortowany na podstawie pustego tła w porównaniu z ruchomym tłem paska, a następnie numerem studni. Należy użyć szablonu Excela, który ma wbudowane równania, które automatycznie określają rozmieszczenie larw w studzienkach, odległość między larwami, prędkość ruchu i ilość odpoczynku. Najnowszy szablon Excela to 25ib utworzony w laboratorium Creton, który jest dostępny na żądanie. Wykresy przedstawiające różne grupy leczenia powinny być wbudowane w arkusz Excel wraz z testami t w celu porównania między grupami leczonymi i kontrolnymi. Dalszą analizę statystyczną można przeprowadzić za pomocą SPSS.
Wyniki
W naszych wcześniejszych testach, z wykorzystaniem awersyjnego bodźca w postaci odbijającej się kuli, nieleczone larwy typu dzikiego reagują na poruszającą się kulę poprzez opływanie dna naczynia (zachowanie unikowe) oraz przemieszczanie się w stronę krawędzi naczynia (zachowanie tygmotaktyczne) 15. Później potwierdziliśmy, że zachowanie tygmotaktyczne w tym teście jest miarą zachowań związanych z lękiem u larw zebrafish 17. Odnotowano istotne różnice w ruchu larw oddalających się od kuli oraz w preferencji krawędzi w porównaniu do czystego białego tła. Zachowania te zostały potwierdzone również w naszym nowym teście z wykorzystaniem poruszającego się czerwonego paska i są one jeszcze bardziej wyraźne 16. Co więcej, możemy teraz przeanalizować większą liczbę zachowań w jednym teście, w tym prędkość pływania, spoczynek, preferencję końca lub boku naczynia oraz odległość między rybami (Rycina 5). Larwy kontrolne hodowane w wodzie do jaj wykazują zwiększoną preferencję do przebywania na dnie naczynia i na krawędzi toru po zaprezentowaniu im bodźca awersyjnego (poruszającego się czerwonego paska). Podobne wyniki uzyskuje się, gdy larwy są hodowane w wodzie do jaj zawierającej 1 μg/ml DMSO, rozpuszczalnika powszechnie stosowanego do rozpuszczania różnych farmaceutyków i toksyn w formie 1,000X roztworów stokowych.
Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 5 dla larw traktowanych wodą z jaj i DMSO (jako kontrolami) oraz różnymi stężeniami pestycydów fosforoorganicznych, powszechnie występujących w żywności nieorganicznej. Przedstawione wyniki stanowią próbkę z jednego eksperymentu. Jednakże po powtórzeniu badania wyniki wskazują, że prędkość pływania oraz zachowanie tygmotaktyczne ulegają zmianie pod wpływem niskich stężeń pestycydów fosforoorganicznych, które odpowiadają poziomach występującym w spożywanej przez ludzi żywności 18.
Rysunek 1. Tace do zbierania. Szklane naczynia Pyrex służą do zbierania zarodków ze zbiorników z dorosłymi rybami. Pokrywy naczyń Pyrex zostały wycięte i wyposażone w plastikowe siatki, do których przyszyto zieloną włóczkę. Tworzy to warunki do rozmnażania dorosłych danio pręgowanych poprzez naśladowanie naturalnego środowiska.
Rycina 2. Formuła plastikowa i ścieżki agarozowe. A) Po lewej stronie przedstawiono formę. 0.8% agarozy wlewa się do płyty z jednym dołkiem; formę powoli wsuwa się do środka, a następnie wyjmuje po ostygnięciu agarozy. B) Płyta po prawej stronie pokazuje ścieżki utworzone w agarozie za pomocą plastikowej formy.
Rysunek 3. Komory obrazowania. Komory obrazowania zostały specjalnie zbudowane w naszym laboratorium i wykorzystane do wysokoprzepustowych analiz behawioralnych. Cyfrowa kamera o rozdzielczości 15 megapikseli została przymocowana do górnej części komory i skierowana w dół, aby rejestrować obrazy larw w odstępach czasu, znajdujących się w wielokanałowych płytkach umieszczonych na ekranie laptopa. Pomiędzy płytkami a ekranem znajduje się plastikowy dyfuzor, który służy do zapobiegania powstawaniu prążków mory na rejestrowanych obrazach.
Rycina 4. Puste tło i awersyjny bodziec w programie PowerPoint. Jest to obecnie stosowana prezentacja PowerPoint służąca do wywoływania zmian behawioralnych u larw danio pręgowanego. Zapewnia ona wyraźne różnice w zachowaniu między A) pustym tłem a B) poruszającym się czerwonym paskiem.
Rycina 5. Zachowania ilościowo określone w badaniu wysokoprzepustowym. Przykład zachowań ilościowo określonych w naszym teście behawioralnym w arkuszu Excel, którego używamy do zapisu współrzędnych x,y larw. Białe słupki przedstawiają dane z larw eksponowanych na puste tło, a czerwone słupki przedstawiają dane z larw eksponowanych na czerwony ruchomy pasek w programie PowerPoint. Wykresy wskazują pomiary, które można uzyskać z analizy behawioralnej: A) procent larw leżących w torze, B) procent larw znajdujących się na końcu toru, C) procent larw znajdujących się na krawędzi toru, D) dystans między rybami (mm), E) prędkość pływania larw (mm/min), F) procent czasu odpoczynku larw. Na przedstawionych wykresach dane pochodzą z traktowania larw kontrolą DMSO oraz kilkoma stężeniami pestycydów w zakresie od 0,001 do 0,1 μM (poziomy powszechnie spotykane w diecie człowieka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Dyskusja
Chociaż stale ulepszamy nasz nowatorski test behawioralny, zawsze był on przydatny do wykrywania zachowań unikających i thigmotaxis u larw danio pręgowanego 15. Przeprowadzono wiele prób w celu optymalizacji wyników testu, takich jak kolor użytego bodźca, idealna liczba larw na pasie i długość testu behawioralnego. Wcześniej używaliśmy płytek wielodołkowych (z 6 lub 12 dołkami) 15,17,18. Jednak ostatnio stworzyliśmy nowatorską formę torową, aby stworzyć większą przestrzeń do pływania dla larw, co pozwala nam zebrać większą liczbę miar behawioralnych w jednym teście 16 (ryc. 5). Inne modyfikacje obejmują warianty pokazanego PowerPointa (zmieniony ruch lub długość testu) oraz rozmiar używanych pasów (mamy również formy dla węższych pasów).
Obecnie ten wysokowydajny zautomatyzowany system jest wyjątkowy ze względu na jego zdolność do jednoczesnego pomiaru szerokiego zakresu zachowań larw danio pręgowanego, takich jak prędkość, unikanie, bliskość innych larw i thigmotaxis na płytach wielopasmowych. Wyniki można uzyskać szybko, a dużą liczbę larw można przeanalizować w czasie obrazowania. System jest zarówno niedrogi w budowie, jak i szybki i łatwy w konfiguracji. Ograniczeniem tego systemu jest to, że ruchy 3D nie mogą być oceniane u larw danio pręgowanego. Zautomatyzowane systemy, które śledzą dorosłe ryby, mają zdolność 3D i mogą identyfikować szerszy zakres zachowań, takich jak ruch w górę lub w dół w słupie wody 10,19. Kolejnym ograniczeniem jest to, że nasz system obrazowania nie jest obecnie zoptymalizowany pod kątem analiz o wysokiej przepustowości z prędkością wideo. Obrazowanie z prędkością wideo jest możliwe po ustawieniu kamery na niższą rozdzielczość 15, ale ogranicza to analizę do jednej płyty.
Korzystając z nowo opracowanej metody "pasa", kilka części testu musiało zostać wykonanych w precyzyjny sposób. Podczas umieszczania larw na pasach bardzo ważne jest, aby upewnić się, że poziom płynu jest bardzo płytki, dopóki płytki nie zostaną umieszczone na górze ekranu laptopa. Jeśli pasy są zbyt wypełnione płynem, larwy uciekną na obrzeża talerza. Ponadto podczas wkładania formy do agarozy należy uważać, aby bardzo powoli opuszczać formę. Jeśli pleśń zostanie włożona zbyt szybko, w agarozie utworzą się pęcherzyki, które zostaną zidentyfikowane przez makro Obraz J jako dodatkowe larwy. Zaleca się, że jeśli pasy agarozy mają nawet kilka pęcherzyków, najlepiej zrobić nowe.
W przyszłości chcielibyśmy zoptymalizować nasze testy behawioralne, aby przeanalizować inne złożone zachowania, takie jak uczenie się u larw danio pręgowanego, i zbadać, w jaki sposób na uczenie się może wpływać narażenie na toksyny i farmaceutyki we wczesnym okresie rozwoju. Obecnie pracujemy nad testami, które mogą być przydatne do analizy zachowań związanych z uczeniem się, w których wyniki behawioralne mogą ułatwić określenie, które obszary mózgu są dotknięte przez określone toksyny lub farmaceutyki podczas rozwoju. Opracowano zautomatyzowane testy do pomiaru zachowań związanych z uczeniem się u larw danio pręgowanego 20 , a testy te mogą być modyfikowane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dzięki zastosowaniu solidnej reakcji unikania na płytkach wielopasmowych.
Proponujemy, aby ten test behawioralny mógł być wykorzystany w przyszłych badaniach do testowania skutków rozwojowych dużej liczby farmaceutyków i substancji toksycznych. Takie badania dostarczyłyby wielu informacji na temat konkretnych czynników ryzyka i przyczyniłyby się do ustalenia lepszych wytycznych dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa dla kobiet w ciąży i dzieci.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Seanowi Pełkowskiemu za pomoc w optymalizacji testu behawioralnego. Prace te były wspierane przez National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 oraz National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 i R03 ES017755.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik | |||
| Instant Ocean | That Pet Place | 198262 | |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Methylene Blue | That Pet Place | 214325 | |
| Equipment | |||
| One well plates | Fisher | 12-565-493 | |
| Aparat cyfrowy | Canon | EOS Rebel T1i Szafki | |
| obrazowe | WoodCraft Towers | ||
| Laptopy | Acer Aspire | Any jest dobry, o ile ma 15,6 cala. Ekran LCD o rozdzielczości 1366 x 768 pikseli i jasności 220 cd/m2. | |
| Obiektyw aparatu | Canon | EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS obiektyw zmiennoogniskowy | |
| Plastikowy dyfuzor | Pendaflex | 52345 | |
| Software | |||
| PowerPoint 2010 | Microsoft | ||
| ImageJ | NIH | a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http:// rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Excel 2010 | Microsoft | ||
| Oprogramowanie statystyczne | SPSS 20 |
Bibliografia
- Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).
- Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neuroscience. 11, 90(2010).
- Levin, E. D., Cerutti, D. Ch. 15. Methods of behavioral analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5 edn, Univ of Oregon Press. (2007).
- Kokel, D., Bryan, J., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).
- Rihel, J., Prober, D. A., et al. Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior. PLoS ONE. 6, e17597(2011).
- Sledge, D., Yen, J. Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity. Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).
- Stewart, A., Wu, N. Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).
- Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits. Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).
- Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities. J. Vis. Exp. (20), e923(2008).
- Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae. Unpublished observations. , (2012).
- Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).
- Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Neurotoxicol. Teratol. , (2012).
- Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).
- Colwill, R., Creton, R. Zebrafish protocols for neurobehavioral research. Kalluef, A., Stewart, A. 66, Springer Protocols. (2012).
Przedruki i uprawnienia
