Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

Podsumowanie

Obecny artykuł przedstawia protokół do ustanowienia systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji fakultatywnego wewnątrzkomórkowego patogenu grzyba ludzkiego Candida glabrata z ludzkimi makrofagami, co będzie użytecznym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy o mechanizmach wirulencji grzybów.

Streszczenie

System modelowania hodowli komórek, jeśli ściśle naśladuje warunki środowiskowe gospodarza, może służyć jako niedroga, powtarzalna i łatwa do manipulowania alternatywa dla systemów modeli zwierzęcych do badania konkretnego etapu infekcji patogenami mikrobiologicznymi. Ludzka monocytowa linia komórkowa THP-1, która po leczeniu estrem forbolu różnicuje się w makrofagi, była wcześniej wykorzystywana do badania strategii wirulencji wielu patogenów wewnątrzkomórkowych, w tym Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu omawiamy protokół mający na celu wprowadzenie systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro przy użyciu makrofagów THP-1 w celu nakreślenia interakcji oportunistycznego ludzkiego patogenu drożdży Candida glabrata z komórkami fagocytarnymi gospodarza. Ten model systemu jest prosty, szybki, podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów i nie wymaga skomplikowanego sprzętu. Typowy eksperyment z infekcją makrofagami THP-1 trwa około 24 godzin z dodatkowymi 24-48 godzinami, aby umożliwić odzyskanym drożdżom wewnątrzkomórkowym wzrost na bogatej pożywce w celu analizy żywotności opartej na jednostkach tworzących kolonie. Podobnie jak w przypadku innych systemów modelowych in vitro, możliwym ograniczeniem tego podejścia jest trudność w ekstrapolacji uzyskanych wyników na wysoce złożony obwód komórek odpornościowych istniejący w ludzkim gospodarzu. Jednak pomimo tego obecny protokół jest bardzo przydatny do wyjaśnienia strategii, które patogen grzybowy może zastosować, aby uniknąć/przeciwdziałać odpowiedzi przeciwdrobnoustrojowej oraz przetrwać, przystosować się i namnażać w ubogim w składniki odżywcze środowisku komórek odpornościowych gospodarza.

Wprowadzenie

Gatunki Candida są główną przyczyną zagrażających życiu inwazyjnych infekcji grzybiczych u pacjentów z obniżoną odpornością¹. Candida glabrata, pojawiający się patogen szpitalny, jest drugim lub trzecim najczęściej izolowanym gatunkiem Candida od pacjentów Oddziału Intensywnej Terapii, w zależności od położenia geograficznego^1-3. Filogetycznie C. glabrata, haploidalne drożdże pączkujące, są bliżej spokrewnione z niepatogennymi drożdżami modelowymi Saccharomyces cerevisiae niż z chorobotwórczymi Candida spp., w tym C. albicans⁴. W związku z tym, C. glabrata nie ma niektórych kluczowych cech wirulencji grzybów, w tym krycia, wydzielanej aktywności proteolitycznej i plastyczności morfologicznej^4-5.

Chociaż C. glabrata nie tworzy strzępek, może przetrwać i replikować się u mysich i ludzkich makrofagów^6-8, co sugeruje, że rozwinął unikalne mechanizmy patogenezy. Dostępne są ograniczone informacje na temat strategii stosowanych przez C. glabrata w celu przetrwania w ubogim w składniki odżywcze wewnątrzkomórkowym środowisku makrofagów i przeciwdziałania oksydacyjnym i nieoksydacyjnym reakcjom gospodarza wywoływanym przez komórki odpornościowe gospodarza⁵. Odpowiedni system modelowy makrofagów jest warunkiem wstępnym do nakreślenia interakcji C. glabrata z komórkami fagocytarnymi gospodarza za pomocą funkcjonalnych podejść genomicznych i proteomicznych. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) pochodzenia ludzkiego i mysiego zostały wcześniej wykorzystane do badania interakcji C. glabrata z komórkami odpornościowymi gospodarza^7,9. Jednak trudności w uzyskaniu PBMC i BMDM, ich ograniczona długość życia i wewnętrzna zmienność wśród różnych dawców ssaków ograniczają wykorzystanie tych komórek jako wszechstronnych systemów modelowych.

Tutaj opisujemy metodę tworzenia systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania komórek C. glabrata w makrofagach pochodzących z ludzkiej linii komórek monocytowych THP-1. Ogólnym celem tego protokołu było wprowadzenie prostego, niedrogiego, szybkiego i powtarzalnego systemu modeli hodowli komórkowych, którym można łatwo manipulować w celu zbadania różnych aspektów interakcji między gospodarzem a patogenem grzybowym.

Komórki THP-1 były wcześniej używane do rozszyfrowywania odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko szerokiej gamie patogenów, w tym bakteriom, wirusom i grzybom^10-12. Komórki monocytowe THP-1 są łatwe w utrzymaniu i mogą być różnicowane, po leczeniu estrem forbolu, do makrofagów, które naśladują makrofagi pochodzące z monocytów człowieka i wyrażają odpowiednie markery makrofagów¹³. Głównymi zaletami systemu modelowania makrofagów THP-1 są łatwość obsługi i brak wyrafinowanych wymagań sprzętowych.

Przedstawiony tutaj protokół można łatwo dostosować do badania interakcji innych patogenów grzybów ludzkich z komórkami odpornościowymi gospodarza. Obecna procedura może być również wykorzystana do identyfikacji czynników wirulencji dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu wysokoprzepustowych badań przesiewowych mutantów. Dowodem słuszności koncepcji jest udane wykorzystanie systemu modeli hodowli THP-1 do identyfikacji zestawu 56 genów, które są niezbędne do przetrwania C. glabrata w ludzkich makrofagach⁸.

Protokół

Zaleca się przeprowadzenie eksperymentów z infekcją C. glabrata w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

1. Przygotowanie monowarstwy makrofagów THP-1.
2. Przygotowanie zawiesiny komórek C. glabrata.
3. Zakażenie makrofagów THP-1 komórkami C. glabrata.
4. Pomiar szybkości fagocytozy i replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą testu jednostek tworzących kolonie.
5. Monitorowanie replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

1. Przygotowanie monowarstwy makrofagów THP-1

1. THP-1 to ludzka monocytowa linia komórkowa pochodząca z krwi obwodowej rocznego dziecka płci męskiej cierpiącego na ostrą białaczkę monocytową¹⁴. THP-1, zawiesinowa linia komórkowa, jest rutynowo utrzymywana w temperaturze 37 °C w nawilżonej pożywce hodowlanej 5% CO₂ in RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS (płodowa surowica bydlęca). Leczenie 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA, ester forbolu) powoduje końcowe różnicowanie komórek monocytowych THP-1 w makrofagi. Co ważne, leczenie PMA nie wpływa na żywotność komórek, a komórki zróżnicowane nie dzielą się.
2. Wysiewać około 1,5 x 10⁶ monocytów THP-1 w 100 mm szalkach hodowlanych w kompletnej pożywce RPMI-1640 (pożywka RPMI-1640 uzupełniona 10% surowicą, 2 mM glutaminą i 1x antybiotykami; 10 ml / talerz) i pozwolić komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 2 dni.
3. Gdy komórki THP-1 osiągną gęstość 8 x 10⁵ komórek/ml, przenieś naczynie hodowlane do okapu z przepływem laminarnym do hodowli komórkowej i delikatnie zawiruj, aby ponownie zawiesić osadzone komórki.
4. Odpipetować zawiesinę komórek, umieścić w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować z prędkością 1 000 obr./min (130 x g) przez 4 minuty. Odrzucić supernatant i zawiesić osad komórek THP-1 w 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki RPMI-1640.
5. Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowej gęstości 10⁶ komórek/ml za pomocą wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki RPMI-1640
6. Dodać 1 μl 160 mM bulionu PMA (roztwór 12-mirystynianu 13-octanu forbolu przygotowany w dimetylosulfotlenku) do 10 ml zawiesiny komórek THP-1 (końcowe stężenie 16 nM) i dobrze wymieszać. Dozować 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować płytkę w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 przez} 12 godzin.
7. Usuń starą pożywkę, dodaj 1 ml podgrzanej kompletnej pożywki RPMI-1640 i pozwól komórkom odzyskać sprawność przez 12 godzin w temperaturze 37°C w 5% CO₂ .
8. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby upewnić się, że owalne komórki monocytowe THP-1 w zawiesinie zostały zróżnicowane w spłaszczone, wrzecionowate i przylegające makrofagi. Te zróżnicowane komórki są teraz gotowe do prowadzenia badań nad infekcją C. glabrata.

2. Przygotowanie zawiesiny komórek C. glabrata

C. dziki szczep Bg2 zostanie użyty do infekowania makrofagów THP-1. Komórki C. glabrata są rutynowo hodowane w płynnym pożywce YPD (ekstrakt drożdżowy (1%)-pepton (2%)-dekstroza (2%)). Stałe podłoże YPD przygotowuje się przez dodanie 2% agaru przed autoklawowaniem podłoża.

1. Aby przygotować kulturę C. glabrata, należy pobrać pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli i zaszczepić w 10 ml płynnej pożywki YPD i inkubować przez 14-16 godzin z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 30 °C.
2. Odwirować tę kulturę (1 ml) przy 4 000 obr./min (1 800 x g) przez 5 minut w mikrowirówce stołowej, przemyć komórki trzykrotnie sterylnym PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4) i zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.
3. Zmierzyć OD₆₀₀ zawiesiny komórek C. glabrata i rozcieńczyć odpowiednią objętością sterylnego PBS, aby uzyskać gęstość 2 x 10⁶ komórek/ml (OD₆₀₀ = 0,1). Alternatywnie, pożądaną gęstość komórek można uzyskać, licząc komórki drożdży za pomocą hemocytometru.

3. Zakażenie makrofagów THP-1 komórkami C. glabrata

1. Dodać 50 μl zawiesiny komórek C. glabrata do makrofagów THP-1 (10 6 komórek wysianych na dołek 24-dołkowej płytki hodowlanej) w celu uzyskania MOI (wielokrotność infekcji) 0,1 i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Aby określić liczbę żywotnych drożdży, rozcieńczyć 50 μl zawiesiny komórek C. glabrata 100-krotnie w sterylnym PBS i rozlać 100 μl na pożywce stałej YPD. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C i ręcznie policzyć liczbę kolonii drożdży, które pojawiły się po 1-2 dniach. Liczby te będą odtąd określane jako 0 hr C. glabrata CFU (jednostki tworzące kolonie).
3. Po 2 godzinach kokulturacji komórek THP-1 z komórkami C. glabrata, odrzuć pożywkę hodowlaną, odwracając 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w zbiorniku i delikatnie przemyj trzykrotnie wstępnie podgrzanym sterylnym PBS w celu usunięcia niefagocytozowanych zewnątrzkomórkowych komórek C. glabrata. Delikatne płukanie PBS jest absolutnie niezbędne, aby osiągnąć całkowite usunięcie wszystkich drożdży zewnątrzkomórkowych bez powodowania uszkodzeń monowarstwy makrofagów THP-1.

4. Pomiar szybkości fagocytozy i replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą testu jednostki tworzącej kolonię

1. Liza C. glabrata zakażone makrofagi THP-1 w 1 ml sterylnego_H2Oprzez 2 minuty, delikatnie zeskrobać, aby usunąć resztki makrofagów ze studzienki i zebrać lizat komórkowy w probówce do mikrowirówki. Weryfikacja mikroskopowa całkowitej lizy makrofagów ma kluczowe znaczenie dla odzyskania wszystkich zinternalizowanych drożdży.
2. Przygotować 100-krotne rozcieńczenie lizatu w sterylnym PBS, rozlać 100 μl na pożywce stałej YPD i inkubować na płytkach w temperaturze 30 °C.
3. Po 1-2 dniach należy ręcznie policzyć liczbę kolonii C. glabrata, które pojawiły się na pożywce YPD, pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (2 hr CFU) i obliczyć szybkość fagocytozy, która odnosi się do procentu komórek C. glabrata, które są spożywane przez makrofagi THP-1 po 2-godzinnej kokubacji, korzystając z następującego wzoru.
   % fagocytozy = [(jtk po 2 godzinach)/(jtk po 0 godzinach)] X 100
4. Aby zmierzyć szybkość wewnątrzkomórkowej replikacji komórek C. glabrata w makrofagach THP-1, zbierz drożdże wewnątrzkomórkowe w różnych punktach czasowych po zakażeniu, tj. 4, 6, 8, 10, 12 i 24 godzin, powtarzając kroki 3.3-4.3.
5. Oblicz przeżycie / replikację krotności komórek C. glabrata w makrofagach THP-1, dzieląc całkowite CFU w dowolnym punkcie czasowym przez te po 2 godzinach (drożdże fagocytozowane).

5. Monitorowanie replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

1. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1, nasiennych PMA umieścić 5 x 10⁵ komórek THP-1 w każdym dołku z dwóch szkiełek czterodołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 12 godzin.
2. Zastąp starą pożywkę wstępnie podgrzaną kompletną pożywką RPMI-1640 i pozwól komórkom zregenerować się po leczeniu PMA przez 12 godzin.
3. Przygotować zawiesinę komórek C. glabrata znakowaną GFP (zielone białko fluorescencyjne) zgodnie z opisem w sekcji 2 i zainfekować makrofagi THP-1 do MOI 1. Jeśli szczepy C. glabrata wykazujące ekspresję GFP nie są dostępne, komórki drożdży znakowane FITC (izotiocyjanianem fluoresceiny) można wykorzystać do monitorowania wczesnych zdarzeń po zakażeniu, tj. szybkości fagocytozy i dojrzewania fagolizosomalnego po 2 godzinach.
4. Inkubować szkiełka przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} ostrożnie je odwrócić, aby wyrzucić pożywkę i przemyć 3x sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS.
5. Dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki RPMI-1640 do każdej komory jednego szkiełka i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 22 godziny.
6. Aby utrwalić 2-godzinne makrofagi THP-1 zakażone C. glabrata, dodaj 500 μl 3,7% formaldehydu (przygotowanego w PBS) do każdej komory drugiego szkiełka i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.
7. Przemyć szkiełko trzykrotnie PBS, dodać 500 μl Triton-X (0,7%) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności.
8. Umyj szkiełko 3x PBS, wyjmij komorę z szkiełka hodowlanego i susz na powietrzu przez 3-5 min w ciemności.
9. Ostrożnie zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego Vectashield zawierającego DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) na szkiełku, unikając tworzenia się pęcherzyków. Delikatnie usuń nadmiar płynu za pomocą Kimwipe i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Przechowywać szkiełko w ciemności w temperaturze 4°C do czasu użycia.
10. Powtórz kroki 5.4 i 5.6-5.9, aby przetworzyć komórki THP-1 24 godziny po zakażeniu.
11. Obrazowanie komórek za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (obiektyw 60-krotny zanurzony w oleju, wzbudzenie przy 405 nm i 488 nm odpowiednio dla barwienia DAPI i GFP).

Wyniki

Analizy infekcji makrofagów THP-1 traktowanych PMA komórkami C. glabrata typu dzikiego (wt) wykazały, że komórki wt były fagocytowane przez makrofagi w stopniu 55-65% po 2 h koinkubacji. Ponadto komórki C. glabrata były w stanie oprzeć się zabijaniu przez makrofagi THP-1 i wykazywały umiarkowany, 5- do 7-krotny wzrost CFU po 24 h kokultury z makrofagami THP-1⁸.  Wewnątrzkomórkową replikację komórek typu dzikiego, transformowanych plazmidem wykazującym ekspresję GFP, w m...

Dyskusja

Wrodzony układ odpornościowy odgrywa ważną rolę w zwalczaniu oportunistycznych infekcji grzybiczych. Makrofagi przyczyniają się do obrony przeciwgrzybiczej poprzez spożycie i zniszczenie patogenu grzybowego. W związku z tym wyjaśnienie czynników, które są niezbędne do przetrwania i/lub przeciwdziałania przeciwdrobnoustrojowym funkcjom makrofagów, pogłębi naszą wiedzę na temat strategii wirulencji grzybów. W tym kontekście ustaliliśmy system modelowy hodowli komórkowych in vitro przy użyciu makrofagów pochodzącyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Ludzka linia komórkowa ostrej białaczki monocytowej
RPMI-1640	Hyclon	SH30096.01	Do utrzymania komórek THP-1
12-mirystynian 13-octan	Phorbol Sigma-Aldrich	P 8139	Uwaga: Niebezpieczny
YPD	BD-Difco	242710	Do hodowli komórek Candida glabrata
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775	Do wiązania makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)			Bufor (137 mM NaCl, 10 mM fosforan, 2,7 mM KCl,  pH 7,4) do mycia
Cytrynian soli fizjologicznej (SSC)			Bufor (3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu o 20-krotnym stężeniu) do płukania
Bufor			Bufor (50% formamidu, 5x Denhardt' s solution, 5x SSC, 1% SDS) do hybrydyzacji
Pożywka montażowa VECTASHIELD	Vector Labs	H-1200	Do montażu szkiełek do mikroskopii konfokalnej
32znakowane P α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	Do znakowania radioizotopowego znaczników sygnatur
Szalki do hodowli tkankowych 100 mm	Corning	430167	Do hodowli komórek THP-1
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Corning	3527	Aby przeprowadzić badania infekcji C. glabrata w makrofagach THP-1
4-komorowe szkiełko szklane poddane hodowli tkankowej	BD Falcon	REF354104	Do obrazowania makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata
Hemocytometr	Rohem Indie		Do oznaczania liczby komórek
Mikrowirówka stołowa	Beckman Coulter	Microfuge 18	Do wirowania komórek w mikroprobówkach
Wirówka stołowa	Remi	R-8C	Do obracania komórek w probówkach 15 ml
Spektrofotometr	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	Do monitorowania absorbancji komórek drożdży
Inkubator płytkowy	Labtech	Chłodniczy	Do uprawy komórek C. glabrata komórek
Inkubator Shaker	Nowy Brunszwik	Innova 43	Do uprawy komórek C. glabrata
Inkubator CO2  z płaszczem wodnym	Thermo Electron Corporation	Forma seria 2	Do hodowli komórek THP-1
Mikroskop konfokalny	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	Do obserwacji makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata
Mikroskop złożony	Olympus	CKX 41	Aby obserwować C. glabrata i makrofagi THP-1
Maszyna do PCR		BioRad DNA Engine	Do amplifikacji unikalnych znaczników z wejściowego i wyjściowego genomowego DNA
Piec do hybrydyzacji	Labnet	Problot 12S	Do hybrydyzacji
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	Do skanowania membran hybrydowych
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	Do denaturacji znakowanych radioaktywnie znaczników podpisu
Jednostka dokumentacji żelu	Alphainnontech	Alphaimager	Do wizualizacji DNA barwionego bromkiem etydyny w żelach agarozowych