Obecny artykuł przedstawia protokół do ustanowienia systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji fakultatywnego wewnątrzkomórkowego patogenu grzyba ludzkiego Candida glabrata z ludzkimi makrofagami, co będzie użytecznym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy o mechanizmach wirulencji grzybów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
System modelowania hodowli komórek, jeśli ściśle naśladuje warunki środowiskowe gospodarza, może służyć jako niedroga, powtarzalna i łatwa do manipulowania alternatywa dla systemów modeli zwierzęcych do badania konkretnego etapu infekcji patogenami mikrobiologicznymi. Ludzka monocytowa linia komórkowa THP-1, która po leczeniu estrem forbolu różnicuje się w makrofagi, była wcześniej wykorzystywana do badania strategii wirulencji wielu patogenów wewnątrzkomórkowych, w tym Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu omawiamy protokół mający na celu wprowadzenie systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro przy użyciu makrofagów THP-1 w celu nakreślenia interakcji oportunistycznego ludzkiego patogenu drożdży Candida glabrata z komórkami fagocytarnymi gospodarza. Ten model systemu jest prosty, szybki, podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów i nie wymaga skomplikowanego sprzętu. Typowy eksperyment z infekcją makrofagami THP-1 trwa około 24 godzin z dodatkowymi 24-48 godzinami, aby umożliwić odzyskanym drożdżom wewnątrzkomórkowym wzrost na bogatej pożywce w celu analizy żywotności opartej na jednostkach tworzących kolonie. Podobnie jak w przypadku innych systemów modelowych in vitro, możliwym ograniczeniem tego podejścia jest trudność w ekstrapolacji uzyskanych wyników na wysoce złożony obwód komórek odpornościowych istniejący w ludzkim gospodarzu. Jednak pomimo tego obecny protokół jest bardzo przydatny do wyjaśnienia strategii, które patogen grzybowy może zastosować, aby uniknąć/przeciwdziałać odpowiedzi przeciwdrobnoustrojowej oraz przetrwać, przystosować się i namnażać w ubogim w składniki odżywcze środowisku komórek odpornościowych gospodarza.
Wprowadzenie
Gatunki Candida są główną przyczyną zagrażających życiu inwazyjnych infekcji grzybiczych u pacjentów z obniżoną odpornością1. Candida glabrata, pojawiający się patogen szpitalny, jest drugim lub trzecim najczęściej izolowanym gatunkiem Candida od pacjentów Oddziału Intensywnej Terapii, w zależności od położenia geograficznego1-3. Filogetycznie C. glabrata, haploidalne drożdże pączkujące, są bliżej spokrewnione z niepatogennymi drożdżami modelowymi Saccharomyces cerevisiae niż z chorobotwórczymi Candida spp., w tym C. albicans4. W związku z tym, C. glabrata nie ma niektórych kluczowy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zaleca się przeprowadzenie eksperymentów z infekcją C. glabrata w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
- Przygotowanie monowarstwy makrofagów THP-1.
- Przygotowanie zawiesiny komórek C. glabrata.
- Zakażenie makrofagów THP-1 komórkami C. glabrata.
- Pomiar szybkości fagocytozy i replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą testu jednostek tworzących kolonie.
- Monitorowanie replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.
1. Przygotowanie monowarstwy makrofagów THP-1
- THP-1 to ludzka monocytowa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Analizy infekcji makrofagów THP-1 traktowanych PMA komórkami C. glabrata typu dzikiego (wt) wykazały, że komórki wt były fagocytowane przez makrofagi w stopniu 55-65% po 2 h wspólnej inkubacji. Ponadto komórki C. glabrata były w stanie oprzeć się zabiciu przez makrofagi THP-1 i wykazywały umiarkowany, 5- do 7-krotny wzrost CFU po 24 h kokultury z makrofagami THP-18. Wewnątrzkomórkowa replikacja komórek typu dzikiego, przetransformowanych plazmidem wykazującym ekspresję GFP, .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wrodzony układ odpornościowy odgrywa ważną rolę w zwalczaniu oportunistycznych infekcji grzybiczych. Makrofagi przyczyniają się do obrony przeciwgrzybiczej poprzez spożycie i zniszczenie patogenu grzybowego. W związku z tym wyjaśnienie czynników, które są niezbędne do przetrwania i/lub przeciwdziałania przeciwdrobnoustrojowym funkcjom makrofagów, pogłębi naszą wiedzę na temat strategii wirulencji grzybów. W tym kontekście ustaliliśmy system modelowy hodowli komórkowych in vitro przy użyciu makrofagów pochodzącyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Innovative Young Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 oraz BT/PR13289/BRB/10/745/2009 grant z Departamentu Biotechnologii Rządu Indii oraz główne fundusze Centrum Odcisków Palców i Diagnostyki DNA, Hyderabad. MNR i GB są laureatami stypendiów Junior i Senior Research Fellowship Rady Badań Naukowych i Przemysłowych w celu uzyskania stopnia doktora na Uniwersytecie Manipal. SB jest laureatem stypendium Junior and Senior Research Fellowship na Wydziale Biotechnologii w celu uzyskania stopnia doktora na Uniwersytecie Manipal.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Ludzka linia komórkowa ostrej białaczki monocytowej |
| RPMI-1640 | Hyclon | SH30096.01 | Do utrzymania komórek THP-1 |
| 12-mirystynian 13-octan | Phorbol Sigma-Aldrich | P 8139 | Uwaga: Niebezpieczny |
| YPD | BD-Difco | 242710 | Do hodowli komórek Candida glabrata |
| Formaldehyd | Sigma-Aldrich | F8775 | Do wiązania makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata |
| soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) | Bufor (137 mM NaCl, 10 mM fosforan, 2,7 mM KCl, pH 7,4) do mycia | ||
| Cytrynian soli fizjologicznej (SSC) | Bufor (3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu o 20-krotnym stężeniu) do płukania | ||
| Bufor | Bufor (50% formamidu, 5x Denhardt' s solution, 5x SSC, 1% SDS) do hybrydyzacji | ||
| Pożywka montażowa VECTASHIELD | Vector Labs | H-1200 | Do montażu szkiełek do mikroskopii konfokalnej |
| 32znakowane P α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | Do znakowania radioizotopowego znaczników sygnatur |
| Szalki do hodowli tkankowych 100 mm | Corning | 430167 | Do hodowli komórek THP-1 |
| 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | Corning | 3527 | Aby przeprowadzić badania infekcji C. glabrata w makrofagach THP-1 |
| 4-komorowe szkiełko szklane poddane hodowli tkankowej | BD Falcon | REF354104 | Do obrazowania makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata |
| Hemocytometr | Rohem Indie | Do oznaczania liczby komórek | |
| Mikrowirówka stołowa | Beckman Coulter | Microfuge 18 | Do wirowania komórek w mikroprobówkach |
| Wirówka stołowa | Remi | R-8C | Do obracania komórek w probówkach 15 ml |
| Spektrofotometr | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | Do monitorowania absorbancji komórek drożdży |
| Inkubator płytkowy | Labtech | Chłodniczy | Do uprawy komórek C. glabrata komórek |
| Inkubator Shaker | Nowy Brunszwik | Innova 43 | Do uprawy komórek C. glabrata |
| Inkubator CO2 z płaszczem wodnym | Thermo Electron Corporation | Forma seria 2 | Do hodowli komórek THP-1 |
| Mikroskop konfokalny | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | Do obserwacji makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata |
| Mikroskop złożony | Olympus | CKX 41 | Aby obserwować C. glabrata i makrofagi THP-1 |
| Maszyna do PCR | BioRad DNA Engine | Do amplifikacji unikalnych znaczników z wejściowego i wyjściowego genomowego DNA | |
| Piec do hybrydyzacji | Labnet | Problot 12S | Do hybrydyzacji |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | Do skanowania membran hybrydowych |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | Do denaturacji znakowanych radioaktywnie znaczników podpisu |
| Jednostka dokumentacji żelu | Alphainnontech | Alphaimager | Do wizualizacji DNA barwionego bromkiem etydyny w żelach agarozowych |
Bibliografia
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance stu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
