Artykuł metodologiczny

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

DOI:

10.3791/50630

⸱

18 października 2013

 , 
1Laboratory of Neural Microcircuitry - Brain Mind Institute, Ecole Polytechnique Federale de Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika patch-clamp jest dziś najbardziej znaną metodą rejestrowania aktywności elektrycznej z pojedynczych neuronów lub ich subkomórkowych przedziałów. Niemniej jednak uzyskanie stabilnych zapisów, nawet z pojedynczych komórek, pozostaje czasochłonną procedurą o znacznym stopniu złożoności. Automatyzacja wielu kroków w połączeniu z wydajnym wyświetlaniem informacji może znacznie pomóc eksperymentatorom w wykonywaniu większej liczby nagrań z większą niezawodnością i w krótszym czasie. Doszliśmy do wniosku, że aby uzyskać nagrania na dużą skalę, najbardziej efektywnym podejściem nie jest pełna automatyzacja procesu, ale uproszczenie etapów eksperymentu i zmniejszenie ryzyka błędu ludzkiego, przy jednoczesnym efektywnym uwzględnieniu doświadczenia eksperymentatora i wizualnej informacji zwrotnej. Mając na uwadze te cele, opracowaliśmy wspomagany komputerowo system, który centralizuje wszystkie elementy sterujące niezbędne do eksperymentu z wieloelektrodowym zaciskiem krosowym w jednym interfejsie, dostępnym na rynku bezprzewodowym padzie do gier, jednocześnie wyświetlając informacje związane z eksperymentem i wskazówki na ekranie komputera. W tym miejscu opisujemy różne elementy systemu, które pozwoliły nam skrócić czas potrzebny na osiągnięcie konfiguracji nagrywania i znacznie zwiększyć szanse na pomyślne nagrywanie dużej liczby neuronów jednocześnie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do rejestrowania i stymulowania wielu miejsc z mikrometrową precyzją jest niezwykle przydatna do eksperymentalnego osiągnięcia lepszego zrozumienia systemów neuronalnych. W tym celu opracowano wiele technik, ale żadna z nich nie pozwala na uzyskanie rozdzielczości submiliwoltowej osiągniętej za pomocą techniki patch-clamp, niezbędnej do badania aktywności podprogowej i indywidualnych potencjałów postsynaptycznych. W tym miejscu zajmiemy się opracowaniem dwunastoelektrodowego, wspomaganego komputerowo systemu patch-clamp, którego celem jest jednoczesne rejestrowanie i stymulowanie dużej liczby pojedynczych komórek z wystarczającą precyzją do badania połączeń neuronalnych. Chociaż można wyobrazić sobie wiele innych zastosowań dla takiego systemu, szczególnie dobrze nadaje się on do badania połączeń synaptycznych, biorąc pod uwagę, że liczba możliwych połączeń w grupie neuronów rośnie proporcjonalnie do kwadratu liczby neuronów, o których mowa. O ile więc system z trzema elektrodami pozwala na badanie występowania do sześciu połączeń i najczęściej rejestrację pojedynczego, o tyle rejestracja dwunastu neuronów pozwala na testowanie występowania do 132 połączeń i często obserwowanie kilkunastu połączeń (ryc. 1). Obserwacja dziesiątek połączeń jednocześnie umożliwia analizę organizacji małych sieci i wnioskowanie o statystycznych właściwościach struktury sieci, których nie można zbadaćw inny sposób1. Co więcej, precyzyjna stymulacja wielu komórek pozwala również na ilościowe określenie rekrutacji komórek postsynaptycznych2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu

  1. Sterowanie manipulatorami z komputera
    1. Podłącz każdą skrzynkę sterownika mikromanipulatora do komputera przez porty szeregowe (RS-232).
    2. Zaimplementuj polecenia dotyczące pozycjonowania, odpytywania i dostosowywania ustawień, które mają być wysyłane przez port szeregowy. Biorąc pod uwagę problemy z szybkością i kompatybilnością sprzętową, C/C++ jest zalecany jako język programowania.
    3. Ustandaryzuj układ odniesienia manipulatorów tak, aby zero było najbliższym możliwym położeniem w stosunku do silników, a ruch dodatni był skierowany z dala od silników.
    4. Ustawić mikroskop w jego centralnym położeniu 2 mm powyżej płaszczyzny ogniskowej próbki (współrzędne [0, 0, 2000]).
    5. Dla każdego manipulatora należy zapisać współrzędne lokalne, które umożliwiają obserwację końcówki pipety w środku pola widzenia mikroskopu. Jest to początkowy punkt odniesienia dla każdej elektrody.
  2. Wizualizacja pozycji elektrod. Bardzo przydatna jest możliwość śledzenia pozycji każdej elektrody podczas eksperymentu. Reprezentacja graficzna jest najbardziej intuicyjnym sposobem osiągnięcia tego celu. W tym celu należy dopasować układy odniesienia każdej elektrody i mikroskopu. Prostym sposobem na osiągnięcie tego jest:
    1. Przesuń końcówkę elektrody do środka pola view.
    2. Zapisz pozycję na każdej osi manipulatora i każdej osi mikroskopu.
    3. Wykonać osią x manipulatora stosunkowo duży ruch (1 mm).
    4. Zlokalizuj końcówkę jeszcze raz, poruszając tylko mikroskopem.
    5. Oblicz różnicę w położeniu mikroskopu od czasu ostatniego pomiaru. Są to rzuty ruchu osi elektrody na osie mikroskopu.
    6. Powtórz kroki 2.3 - 2.5 dla osi Y i Z manipulatora elektrod. Pozwala to na wyznaczenie macierzy rzutów na osie mikroskopu (rysunek 2), zwanej również macierzą cosinusową:
      figure-protocol-1
    7. Odwróć tę matrycę, aby umożliwić obliczenie ruchów, w trzech wymiarach, wymaganych przez manipulator elektrody do osiągnięcia danej pozycji w układzie współrzędnych mikroskopu:
      figure-protocol-2
    8. Korzystając z początkowego punktu odniesienia i matrycy cosinusowej, określ położenie każdej elektrody we współrzędnych mikroskopu.
    9. Wyświetlaj graficznie, na podstawie współrzędnych mikroskopu, położenie każdej elektrody w regularnych odstępach czasu. Zdecydowaliśmy się użyć bibliotek rysunkowych C/C++ (GDI+) do rysowania pozycji elektrod co 40 ms.
    10. Powtórz kroki 1.2.1 - 1.2.7 za każdym razem, gdy zmieniane są kąty manipulatora lub jeśli potrzebna jest zmiana położenia o kilka milimetrów, na przykład, gdy zmienia się typ elektrody.
  3. Umożliwiają zapamiętywanie pozycji istotnych cech w tkance, takich jak komórki lub anatomiczne punkty odniesienia, we współrzędnych mikroskopu.
  4. Uzyskaj odpowiednie informacje wideo i nałóż je.
    1. Mechanicznie wyrównaj oś ruchu x mikroskopu z osią poziomą kamery mikroskopu.
    2. Zainstaluj na komputerze framegrabber z funkcją wideo na żywo i nakładką oraz zestaw narzędzi do tworzenia oprogramowania (SDK).
    3. Zaimplementuj operację wyświetlania wideo na żywo za pomocą zestawu SDK.
    4. Przekształć układ współrzędnych mikroskopu w układ odniesienia kamery poprzez odpowiednią translację i skalowanie.
    5. Narysuj odpowiednie cechy we współrzędnych kamery i nałóż na obraz na żywo uzyskany obraz w regularnych odstępach czasu około 40 ms (rysunek 3).
  5. Wzmacniacze sterujące.
    1. Użyj oprogramowania wzmacniacza, aby sterować ustawieniami wzmacniacza z interfejsu.
  6. Oscyloskopy kontrolne.
    1. Podłącz oscyloskopy do komputera za pomocą portów szeregowych.
    2. Określ skalę oscyloskopu, sprzężenie i rozdzielczość czasową dla różnych etapów procedury zacisku krosowego w zacisku napięciowym (np. elektroda w kąpieli, tworzenie uszczelnienia, konfiguracja całego ogniwa) i cęgach prądowych.
    3. Wysyłaj odpowiednie polecenia ustawień oscyloskopu za każdym razem, gdy polecenia wzmacniacza są wydawane z interfejsu.
  7. Kontroluj ciśnienie w pipetach.
    1. Zamontować system kontroli ciśnienia zgodnie z rysunkiem 4.
      1. Użyj zasilacza 12 V/5 V, aby odpowiednio zasilić każdy element elektroniczny.
      2. Podłączyć wyjście jednej pompy membranowej do bufora nadciśnieniowego (pojemnik o pojemności 100 ml).
      3. Podłączyć wejście jednej pompy membranowej do bufora podciśnienia (pojemnik o pojemności 100 ml).
      4. Podłącz rurkę uchwytu pipety do czujnika ciśnienia w układzie kontroli ciśnienia i zaworu pneumatycznego, który łączy się z główną komorą ciśnieniową.
      5. Podłącz każdy z ciśnieniowych do zaworu podłączonego do głównej komory ciśnieniowej.
      6. Podłączyć zawór między główną komorą ciśnieniową a atmosferą.
      7. Podłącz czujnik ciśnienia do głównej komory ciśnieniowej.
      8. Podłącz czujnik ciśnienia do każdego bufora.
      9. Podłącz system kontroli ciśnienia do karty akwizycji danych.
      10. Podłącz każdy czujnik ciśnienia do jednego wejścia analogowego.
      11. Podłącz każdy zawór do wyjścia cyfrowego.
    2. Usuń przesunięcie ciśnienia atmosferycznego ze wszystkich czujników, otwierając wszystkie zawory z wyjątkiem tych, które łączą się z pompami membranowymi i odejmując zmierzone ciśnienie.
    3. Sterowanie ciśnieniem osprzętu roboczego
      1. Zdefiniuj w interfejsie element sterujący, aby aktywować lub dezaktywować sterowanie nadciśnieniem dla każdej pipety.
      2. Określ minimalne nadciśnienie dla pipet na poziomie około 70 mbar.
      3. Okresowo (co 0,5 sekundy) wykrywaj, kiedy ciśnienie w pipetach pod aktywną kontrolą ciśnienia spadnie poniżej ustawionego progu.
      4. Po przekroczeniu progu należy otworzyć bufor nadciśnienia do głównego przedziału ciśnieniowego, a następnie w kierunku danej pipety przez krótki czas (20 ms), aż ciśnienie w pipetach przekroczy próg. Zamknij wszystkie inne zawory.
      5. Wyłącz dalszą kontrolę ciśnienia, gdy inicjowane jest ostateczne podejście do komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
    4. Zastosuj podciśnienie do formowania uszczelnienia
      1. Zamknąć wszystkie zawory i otworzyć podciśnieniowy zawór buforowy w kierunku głównej komory ciśnieniowej, a tę komorę w kierunku danej pipety na czas wymagany przez eksperymentatora, przytrzymując wciśnięty przycisk.
  8. Centralizacja poleceń na urządzeniu interfejsu użytkownika.
    1. Podłącz dostępny w handlu bezprzewodowy gamepad do komputera.
    2. Zaimplementuj odczyt stanu joysticka. Na przykład użyj bibliotek DirectX dla C/C++, aby wykonywać odczyty co 5 ms.
    3. Porównaj bieżący stan z poprzednim stanem, aby wykryć, które przyciski zostały naciśnięte, zwolnione lub przytrzymane od ostatniego kroku czasowego.
    4. Przypisz funkcje do każdego przycisku w padzie. Przykład takiego odwzorowania pokazano na rysunku 5.

2. Procedura zacisku krosowego

  1. Przygotuj wycinki mózgu w obszarze zainteresowania.
  2. Umieść interesujący Cię wycinek mózgu, tak aby obszar zainteresowania znajdował się w środku zakresu przemieszczenia mikroskopu.
  3. Zaznaczanie komórek
    1. Zidentyfikuj interesujące Cię komórki, przeglądając za pomocą mikroskopu. Zapisz pozycję komórek w oparciu o układ współrzędnych mikroskopu, klikając prawym przyciskiem myszy na ekranie wideo na żywo nad interesującą komórką.
    2. Interfejs graficzny wyświetli wybrane komórki, a także mikropipety w celu uzyskania globalnego przeglądu, a oprogramowanie doda znacznik pozycji komórki, który zostanie nałożony na obrazy. Dodatkowo obraz komórki jest przechwytywany do wykorzystania w przyszłości w pliku "Cell#.jpg".
  4. Przypisanie komórek do pipet
    1. Po wybraniu interesujących Cię komórek przypisz, która pipeta będzie rejestrować każdą komórkę. Interfejs graficzny zawiera elementy sterujące przypisaniem, które należy ustawić. Wizualizuj podgląd końcowej konfiguracji, zaznaczając pole wyboru "Pokaż pozycje końcowe".
    2. Wybierz każdą pipetę, dla której pożądany jest podgląd końcowej pozycji, lub zaznacz pole wyboru "Zaznacz wszystko". W razie potrzeby wyłącz wyświetlanie bieżącej pozycji, aby uzyskać lepszą wizualizację.
  5. Przygotowanie pipet
    1. Napełnij pipety (6 - 8 MΩ są zwykle najlepsze, jeśli używa się wielu pipet) roztworem wewnątrzkomórkowym i załaduj je do uchwytów. Umieść stopnie czołowe w ich mocowaniach, ale nie przesuwaj ich do przodu, aby uniknąć dotykania wanny końcówką pipety.
    2. Włącz kontrolę nadciśnienia i wybierz wszystkie pipety, aby upewnić się, że końcówki pozostaną czyste. Delikatnie wsuń każdy stopień głowy na miejsce.
  6. Lokalizowanie końcówek do pipet
    1. Ustaw mikroskop w pozycji środkowej z ostrością 3 mm nad plasterkiem, naciskając przycisk R2, przytrzymując przycisk "A". Użyj odpowiedniej pozycji dla każdego manipulatora, zapisanej z poprzedniego eksperymentu, naciskając przycisk L2 i przytrzymując przycisk A.
      Uwaga: W tym momencie w polu widzenia powinien być albo charakterystyczny cień pipety, albo niewielki ruch wzdłuż osi pipety powinien wystarczyć, aby go zaobserwować w większości przypadków. Kompensacja niewielkich różnic w kształcie pipety musi być wykonywana ręcznie.
    2. Ustaw ostrość końcówki pipety. Umieść końcówkę na czerwonej centralnej kropce wyświetlacza wideo, nie przesuwając mikroskopu (powinna nadal znajdować się w pozycji [0, 0, 2000]).
    3. Poinformuj oprogramowanie, że pipeta znajduje się na środku wyświetlacza, naciskając przycisk Z, przytrzymując jednocześnie przycisk C. Po zlokalizowaniu każdej końcówki pipety należy ją odesłać do tyłu, aby można było zlokalizować następną, naciskając przycisk L1 i przytrzymując przycisk A.
  7. Zbliżanie się do cel
    1. Po dokładnym zlokalizowaniu wszystkich końcówek pipet i przypisaniu każdej pipety do komórki, automatycznie umieść pipety w pobliżu odpowiednich komórek. Po prostu kliknij prawym przyciskiem myszy środek grupy komórek i wybierz opcję "Klaster" z menu podręcznego. W wyświetlonym oknie opcji klastra wybierz wszystkie pipety, które chcesz w tej chwili ustawić, a następnie kliknij opcję "Idź ze wszystkimi zaznaczonymi pipetami". Powtórz tę operację dla każdego klastra komórek, który Cię interesuje.
    2. Wykonaj ostatnie podejście ręcznie. Położenie pipet względem komórek może być określone w różny sposób, ale zwykle wynosi po prostu 200 μm od celi w osi pipety i 200 μm nad nią w kierunku pionowym, co wystarczy, aby końcówka pipety znajdowała się na zewnątrz tkanki. Poczekaj, aż ustawienie pipet zostanie zakończone i przesuń mikroskop w kierunku pipety, naciskając przycisk R1, przytrzymując przycisk C.
    3. Ponownie skalibruj każdą pozycję pipety, ustawiając ostrość mikroskopu na jej końcówce w dowolnym miejscu na wyświetlaczu wideo i naciskając przycisk B, przytrzymując przycisk C. Na chwilę powinna pojawić się kwadratowa siatka wskazująca zidentyfikowane położenie pipety. Jeśli pozycja nie jest prawidłowa, umieść końcówkę na środkowej kropce wyświetlacza wideo i naciśnij przycisk Z, przytrzymując przycisk C.
  8. Ustanawianie konfiguracji dołączonej do komórki
    1. Upewnij się, że komórka zainteresowania bieżącej pipety jest prawidłowo oznaczona. W przeciwnym razie przesuń mikroskop, aby dopasować interesującą komórkę do centralnej czerwonej kropki. Zaznacz celę, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk C. Naciśnij przycisk L2, przytrzymując przycisk C, aby ustawić pipetę w odległości 200 μm od przypisanej celi, mikroskop automatycznie przesunie się do odpowiedniej pozycji.
    2. Dostosuj położenie pipety tak, aby pasowała do czerwonej kropki. Wyreguluj przesunięcie pipety, naciskając przycisk R1 i przytrzymując przycisk X.
    3. Aktywuj impuls testowy, naciskając przycisk L1 i przytrzymując przycisk X. Powoli zbliż pipetę do przypisanej jej celi.
    4. Obserwując tworzenie się wgłębienia na powierzchni błony komórki, zastosuj krótki impuls podciśnienia, naciskając przycisk Y, przytrzymując przycisk Z, aby przyłożone ciśnienie dotarło do komórki. Potencjał podtrzymania około -65mV powinien zostać ustalony w tym momencie poprzez naciśnięcie przycisku L2 przy jednoczesnym przytrzymaniu przycisku X.
  9. Konfiguracja całej komórki
    1. Po utworzeniu giga-uszczelki dla każdej komórki, zacznij rozrywać membrany, stosując podciśnienie.
  10. Wykonywanie nagrań
    1. Użyj systemu stymulacji/akwizycji, aby wykonać swoje nagrania. Zastosuj impulsy lub ciągi impulsów do jednej pojedynczej komórki na raz i obserwuj odpowiedzi na pozostałe komórki, aby zmapować łączność między zarejestrowanymi komórkami.
  11. Pipety cofające
    1. Po zakończeniu nagrań powoli odsuń pipety od tkanki, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk radiowy Tabela. Wybierz opcję "Recede->Pipety 500 μm", aby pipety cofnęły się na niewielką odległość wzdłuż swoich osi. Obserwuj dryf potencjału komórek (pomocne może być oczyszczenie końcówek poprzez zastosowanie dodatniego ciśnienia).
    2. Aby całkowicie cofnąć pipety, ustaw prędkość pozycjonowania na "Szybka" i powtórz tę samą operację, ale wybierz opcję "Wszystkie". Wyjmij zużyte pipety, delikatnie wysuwając głowice i odkręcając pipety od uchwytów. Zaleca się unikanie skręcania uchwytów w gniazdach, ponieważ może to znacznie zakłócić położenie końcówki pipety.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując metody opisane powyżej, udało nam się przeprowadzić rejestrację całych komórek do dwunastu neuronów jednocześnie, prawie podwajając największą liczbę neuronów jednocześnie zaciśniętych do tej pory. Przykłady sieci bezpośrednich połączeń synaptycznych między neuronami piramidowymi zarejestrowanych w warstwie V kory somatosensorycznej szczurów pokazano na rycinie 6.

Określenie profili prawdopodobieństwa połączenia jako funkcji odległości międzysomatycznej dla danego typ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwykle od razu nasuwa się pytanie o stopień powodzenia opisanej przez nas procedury. Aby uzyskać wysokie wskaźniki sukcesu, niezbędne jest przygotowanie. Pipety muszą mieć otwory na końcówki, które są odpowiednie dla rejestrowanych komórek. Ważne jest również filtrowanie roztworu wewnątrzkomórkowego, aby uniknąć zatkania pipet. Kolejnym wymogiem są wyjątkowo czyste, świeżo wyciągnięte pipety. Rozkład dwumianowy jest najprostszym modelem, który można wykorzystać do zrozumienia, w jaki sposób te kwestie wpływają na ostatec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Giladowi Silberbergowi, Michele Pignatelli, Thomasowi K. Bergerowi, Luce Gambazzi i Sonii Garcii za cenne rady dotyczące ulepszeń automatyzacji procedury zaciskania krosowego. Dziękujemy Rajnishowi Ranjanowi za cenne rady i pomoc we wdrożeniu oprogramowania. Prace te zostały częściowo sfinansowane przez unijny projekt Synapse, a częściowo przez program naukowy Human Frontiers.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MikroskopOlympusBX51WI40X Immersyjne
manipulatory obiektywoweLuigs NeumannSM-5Używany protokół szeregowy
WzmacniaczeAxon InstrumentsMultiClamp 700BSDK
używany KameraTill PhotonicsVS 55BNC Wyjście analogowe
FramegrabberTranslacja danychDT3120SDK używany
OscyloskopyTektronixTDS 2014Komunikacja szeregowa
Akwizycja danychInstruTECHITC 1600
Akwizycja danychNational InstrumentsPCI-6221Używana biblioteka (.dll)
Zawór ciśnieniowySMCSMC070C-6BG-32
Czujnik ciśnieniaHoneywell24PCDFA6G
Membrana pompaSchegoOptimal

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473(2010).
  3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
  4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
  5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
  6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
  7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
  8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
  9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
  10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
  11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).
  13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja wieloelektrodowasystem wspomagany komputerowotryb whole cellanaliza sieci neuronowychpozycjonowanie pipetytworzenie giga uszczelnieniamapowanie czno ci synaptycznejsterowanie bezprzewodowym kontrolereminterfejs wizualnej informacji zwrotnej

Powiązane artykuły