Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Summary

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Abstract

Technika patch-clamp jest dziś najbardziej znaną metodą rejestrowania aktywności elektrycznej z pojedynczych neuronów lub ich subkomórkowych przedziałów. Niemniej jednak uzyskanie stabilnych zapisów, nawet z pojedynczych komórek, pozostaje czasochłonną procedurą o znacznym stopniu złożoności. Automatyzacja wielu kroków w połączeniu z wydajnym wyświetlaniem informacji może znacznie pomóc eksperymentatorom w wykonywaniu większej liczby nagrań z większą niezawodnością i w krótszym czasie. Doszliśmy do wniosku, że aby uzyskać nagrania na dużą skalę, najbardziej efektywnym podejściem nie jest pełna automatyzacja procesu, ale uproszczenie etapów eksperymentu i zmniejszenie ryzyka błędu ludzkiego, przy jednoczesnym efektywnym uwzględnieniu doświadczenia eksperymentatora i wizualnej informacji zwrotnej. Mając na uwadze te cele, opracowaliśmy wspomagany komputerowo system, który centralizuje wszystkie elementy sterujące niezbędne do eksperymentu z wieloelektrodowym zaciskiem krosowym w jednym interfejsie, dostępnym na rynku bezprzewodowym padzie do gier, jednocześnie wyświetlając informacje związane z eksperymentem i wskazówki na ekranie komputera. W tym miejscu opisujemy różne elementy systemu, które pozwoliły nam skrócić czas potrzebny na osiągnięcie konfiguracji nagrywania i znacznie zwiększyć szanse na pomyślne nagrywanie dużej liczby neuronów jednocześnie.

Introduction

Zdolność do rejestrowania i stymulowania wielu miejsc z mikrometrową precyzją jest niezwykle przydatna do eksperymentalnego osiągnięcia lepszego zrozumienia systemów neuronalnych. W tym celu opracowano wiele technik, ale żadna z nich nie pozwala na uzyskanie rozdzielczości submiliwoltowej osiągniętej za pomocą techniki patch-clamp, niezbędnej do badania aktywności podprogowej i indywidualnych potencjałów postsynaptycznych. W tym miejscu zajmiemy się opracowaniem dwunastoelektrodowego, wspomaganego komputerowo systemu patch-clamp, którego celem jest jednoczesne rejestrowanie i stymulowanie dużej liczby pojedynczych komórek z wystarczającą precyzją do badania połączeń n....

Protocol

1. Przygotowanie sprzętu

1. Sterowanie manipulatorami z komputera
   1. Podłącz każdą skrzynkę sterownika mikromanipulatora do komputera przez porty szeregowe (RS-232).
   2. Zaimplementuj polecenia dotyczące pozycjonowania, odpytywania i dostosowywania ustawień, które mają być wysyłane przez port szeregowy. Biorąc pod uwagę problemy z szybkością i kompatybilnością sprzętową, C/C++ jest zalecany jako język programowania.
   3. Ustandaryzuj układ odniesienia manipulatorów tak, aby zero było najbliższym możliwym położeniem w stosunku do silników, a ruch dodatni był skierowany z dala od silników.
   4. Ustawić mikroskop w je....

Results

Stosując metody opisane powyżej, udało nam się przeprowadzić rejestrację całych komórek do dwunastu neuronów jednocześnie, prawie podwajając największą liczbę neuronów jednocześnie zaciśniętych do tej pory. Przykłady sieci bezpośrednich połączeń synaptycznych między neuronami piramidowymi zarejestrowanych w warstwie V kory somatosensorycznej szczurów pokazano na rycinie 6.

Określenie profili prawdopodobieństwa połączenia jako funkcji odległości międzysomatycznej dla danego typ.......

Discussion

Zwykle od razu nasuwa się pytanie o stopień powodzenia opisanej przez nas procedury. Aby uzyskać wysokie wskaźniki sukcesu, niezbędne jest przygotowanie. Pipety muszą mieć otwory na końcówki, które są odpowiednie dla rejestrowanych komórek. Ważne jest również filtrowanie roztworu wewnątrzkomórkowego, aby uniknąć zatkania pipet. Kolejnym wymogiem są wyjątkowo czyste, świeżo wyciągnięte pipety. Rozkład dwumianowy jest najprostszym modelem, który można wykorzystać do zrozumienia, w jaki sposób te kwestie wpływają na ostatec.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop	Olympus	BX51WI	40X Immersyjne
manipulatory obiektywowe	Luigs Neumann	SM-5	Używany protokół szeregowy
Wzmacniacze	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK
używany Kamera	Till Photonics	VS 55	BNC Wyjście analogowe
Framegrabber	Translacja danych	DT3120	SDK używany
Oscyloskopy	Tektronix	TDS 2014	Komunikacja szeregowa
Akwizycja danych	InstruTECH	ITC 1600
Akwizycja danych	National Instruments	PCI-6221	Używana biblioteka (.dll)
Zawór ciśnieniowy	SMC	SMC070C-6BG-32
Czujnik ciśnienia	Honeywell	24PCDFA6G
Membrana pompa	Schego	Optimal