Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Podsumowanie

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Streszczenie

Skuteczne określanie mas białek jest kluczowe dla wielu badań biologicznych (np. dla badań biologii strukturalnej). Dokładne określenie masy pozwala ocenić poprawność pierwszorzędowych sekwencji białek, obecność mutacji i/lub modyfikacji potranslacyjnych, możliwą degradację białka, jednorodność próbki oraz stopień włączenia izotopu w przypadku znakowania (np. znakowanie ¹³C).

Spektrometria mas (MS) jonizacji elektrorozpylaniem (ESI) jest szeroko stosowana do oznaczania masy zdenaturowanych białek, ale na jej efektywność wpływa skład bufora próbki. W szczególności obecność soli, detergentów i zanieczyszczeń poważnie osłabia skuteczność analizy białek za pomocą ESI-MS. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) MS jest atrakcyjną alternatywą ze względu na tolerancję na sól oraz prostotę pozyskiwania i interpretacji danych. Co więcej, oznaczanie masy dużych białek heterogenicznych (większych niż 100 kDa) jest łatwiejsze za pomocą MALDI-MS ze względu na brak nakładających się na siebie rozkładów wysokiego stanu naładowania, które są obecne w widmach ESI.

Tutaj prezentujemy przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-czasu przelotu (TOF). Ilustrujemy zalety stosowania mieszaniny dwóch matryc (tj. kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego i kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego) oraz użyteczność metody cienkowarstwowej jako podejścia do osadzania próbki. Omówiono również krytyczną rolę czystości matrycy i rozpuszczalnika, wzorców stosowanych do kalibracji, energii lasera oraz czasu akwizycji. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczamy informacji niezbędnych nowicjuszowi do analizy nienaruszonych białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wprowadzenie

Biologia strukturalna opiera się na produkcji wysokiej jakości białek ¹ i dlatego musi być połączona z wydajnymi i niezawodnymi technikami analizy białek ^2,3. W naszym laboratorium spektrometrii mas (MS) w Instytucie Biologii Strukturalnej musimy potwierdzić pierwotną sekwencję białek, ocenić obecność mutacji i modyfikacji potranslacyjnych, degradację białek, jednorodność próbki oraz jakość znakowania izotopowego (np. białka deuterowane do badań magnetycznego rezonansu jądrowego⁴). Ponieważ biolodzy strukturalni używają ograniczonej proteolizy do odróżniania strukturalnie sztywnych domen od elastycznych części, musimy wiarygodnie scharakteryzować takie skrócone białka za pomocą MS.

Gdy biomolekuły są analizowane przez MS, stosuje się dwa możliwe podejścia do miękkiej jonizacji takich ciężkich i labilnych molekuł. Jonizacja elektronrozpylacyjna (ESI) jonizuje cząsteczki bezpośrednio z fazy ciekłej ⁵; Jonizacja desorpcji laserowej wspomagana matrycą (MALDI) wymaga, aby biomolekuły były współkrystalizowane z cząsteczkami organicznymi absorbującymi promieniowanie ultrafioletowe (tj. cząsteczkami matrycy) ⁶.

ESI time-of-flight (TOF) MS w połączeniu z chromatografią cieczową stała się rutynową techniką analizy nienaruszonych białek, ponieważ pozwala na określenie masy z dużą dokładnością (≤ 50 ppm). Jest jednak dość podatny na skład buforu próbki (w szczególności na sole i detergenty) oraz na zanieczyszczenia (tj. polimery), które czasami są trudne do wyeliminowania, powodując tłumienie sygnału analitu.

MALDI-TOF MS stanowi skuteczną alternatywę dla ESI-MS, ponieważ na jego wydajność w mniejszym stopniu wpływają składniki buforowe, detergenty i zanieczyszczenia, a pozwala na określenie nienaruszonej masy białka z wystarczającą dokładnością (≤ 500 ppm) do walidacji sekwencji. Po trawieniu białek, MALDI-TOF MS może być również wykorzystany do analizy otrzymanych peptydów w celu dalszego potwierdzenia sekwencji pierwotnej poprzez tzw. "odcisk palca masy peptydowej".

W naszych rękach określanie masy nienaruszonych białek, które są większe niż 100 kDa i niejednorodne (z powodu modyfikacji lub obcięć), jest łatwiejsze przez MALDI-MS niż przez ESI-MS. Wynika to z braku nakładających się na siebie rozkładów stanów ładunku obecnych w widmach ESI. Ponadto, ponieważ proces MALDI nie jest zależny od wielkości analitu⁷, taka metoda daje wysoką czułość, gdy masa biomolekuły przekracza 100 kDa. Niezwykłe analizy nienaruszonych białek przeprowadzono przy użyciu domowych przyrządów między końcem lat 80-tych a początkiem lat 90-tych.

MALDI-TOF może być również używany jako narzędzie przesiewowe do oceny jakości próbek białek, ponieważ wymaga mniej czasu na przygotowanie próbki i jest mniej podatny na zakłócenia spowodowane powszechnymi zanieczyszczeniami (np. solami). Po pierwszej, szybkiej ocenie przez MALDI-MS, próbka może być dalej analizowana przez ESI-TOF w celu określenia jej masy z większą dokładnością. Co więcej, MALDI generuje jony zawierające mniej ładunków niż ESI, a zatem pozyskiwanie i interpretowanie danych MALDI jest prostsze. Dzięki temu studenci zajmujący się biologią strukturalną mogą analizować swoje rekombinowane białka tuż po krótkim szkoleniu.

Dwa kluczowe czynniki wpływają na jakość widm MALDI: matryca i technika użyta do osadzania matrycy (np. wysuszona kropla ⁸ i cienka warstwa ^12-16,17,18). Pojedyncza matryca organiczna [np. kwas sinapinowy (SA) ^19-21 lub kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (α-CHCA) ^14,22,23] jest często stosowana do badania MS nienaruszonych białek i usieciowanych kompleksów białkowych. Korzystając z α-CHCA, grupa Chait przedstawiła wcześniej szczegółowy protokół przygotowania ultracienkiej warstwy przed analizą MALDI białek rozpuszczalnych i błonowych^14,15. Niedawno Gorka i in. zilustrowali powłokę docelową na bazie grafitu, aby poprawić analizę MALDI peptydów i białek przy użyciu α-CHCA jako matrycy²⁴.

Tutaj prezentujemy prosty protokół analizy nienaruszonych białek przez MALDI-TOF MS, wykorzystujący mieszaninę dwóch matryc: kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) i α-CHCA ²⁵. Systematycznie ocenialiśmy wydajność mieszanki DHB-CHCA w porównaniu z matrycami SA i α-CHCA, w celu kontroli nienaruszonych białek. Mieszanina matryc pozwala na lepszą rozdzielczość (tj. piki białka są znacznie ostrzejsze). Co więcej, obecność intensywnych jonów o wielu ładunkach (tj. M⁺²H²⁺, M+3H³⁺, itp.) umożliwia dokładniejsze określenie masy, ponieważ rozdzielczość osiowych instrumentów MALDI-TOF jest wyższa przy niższej masie nad ładunkiem (m/z) ²⁶. Jest to szczególnie przydatne do oznaczania masy cząsteczkowej białek większych niż 100 kDa.

Wyższa czułość jest również osiągana przy użyciu mieszaniny DHB-CHCA (0,5 pmoli białka zauważone na tarczy MALDI).

Jak wspomnieliśmy powyżej, ważnym czynnikiem, który powinien być brany pod uwagę podczas korzystania z instrumentu MALDI, jest osadzanie matrycy. Laugesen i wsp. zaproponowali po raz pierwszy zastosowanie mieszaniny DHB-CHCA ²⁵ z wykorzystaniem osadzania się wysuszonych kropel. Lepsze wyniki (np. znacznie wyższa czułość) zaobserwowaliśmy jednak, gdy zastosowaliśmy metodę cienkiej warstwy, w której pierwszą warstwę tworzy α-CHCA rozpuszczony w acetonie. Metoda cienkowarstwowa ^12,27 implikuje tworzenie się jednorodnego podłoża kryształów matrycy na tarczy MALDI, co zostało opisane w filmie JoVE wcześniej ¹⁵. Następnie próbka jest osadzana na tym podłożu, a na końcu osadza się dodatkową matrycę (patrz poniżej). W tym artykule ilustrujemy również, jak zdeponować próbkę na tarczy MALDI, ale także jak oczyścić tarczę¹⁵, dokonać rekrystalizacji i przygotować matryce.

Podsumowując, naszym celem jest dostarczenie wszystkich niezbędnych informacji do analizy nienaruszonych białek naukowcom (w szczególności biologom strukturalnym), którzy muszą ocenić jakość produkowanych białek w szybki i prosty sposób, a którzy nie są tak zaznajomieni z MALDI-TOF MS. Zgodnie z przewidywaniami z połowy lat dziewięćdziesiątych XX wieku^, stwardnienie rozsiane wywarło większy wpływ na badania biologiczne, ponieważ zwiększyła się jego dostępność dla biologów. Mamy nadzieję, że przekazane przez nas informacje okażą się przydatne w udostępnieniu MALDI-TOF biologom i naukowcom, którzy chcieliby rozpocząć korzystanie ze spektrometrii mas.

Protokół

1. Przygotowanie próbki białka: Wymiana buforu (opcjonalnie)

5-25 μl mikromolowych stężeń białka (1 do 20 μM) jest konieczne. Wymianę buforową można przeprowadzić za pomocą odśrodkowych urządzeń ultrafiltracyjnych (np. Vivaspin, Sartorius) lub kolumn filtracyjnych w żelu do mikrowirówek (np. kolumny chromatograficzne Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad) ^29,30. Kroki wymiany bufora można powtarzać 2-3 razy. Szczegółowy opis wymiany buforowej został wcześniej przedstawiony ^29,30. Na przykład jako końcowy bufor wykorzystujemy 20 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (tj. Tris) pH 8.

Uwaga: Ten krok można pominąć w wielu przypadkach. Należy ją przeprowadzić, gdy próbka białka zawiera cząsteczki lub, które mogą silnie zakłócać wykrywanie stwardnienia rozsianego [np. glicerol; kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy, HEPES]. Jest to również przydatne do poprawy jakości widm.

2. Rekrystalizacja matryc w celu poprawy ich czystości (opcjonalnie)

1. Wlać 10 ml 40% etanolu (EtOH) do kolby Pyrex.
2. Dodać 600 mg matrycy.
3. Używając łaźni wodnej i grzałki oporowej, ogrzej roztwór matrycy i mieszaj go aż do całkowitego rozpuszczenia matrycy za pomocą szklanego pręta lub mieszadła magnetycznego.
4. Powtarzaj krok 2, aż uzyskasz nasycony roztwór.

Uwaga: Użycie zbyt dużej objętości rozpuszczalnika lub rozpuszczenie matrycy znacznie poniżej temperatury wrzenia roztworu spowoduje niską wydajność kryształów lub brak kryształów w ogóle.

5. Pozwól roztworowi powoli ostygnąć. Możesz pozostawić go w temperaturze pokojowej na kilka godzin, a następnie w temperaturze 4 °C na noc. Uwaga: jeśli kryształy nie są uformowane, krystalizację można wywołać poprzez zadrapanie wnętrza zlewki (tuż pod powierzchnią roztworu) za pomocą szklanego pręta mieszającego.
6. Zbierz kryształy matrycy przez filtrację.
7. Przepłucz kryształy minimalną ilością lodowatego rozpuszczalnika i przefiltruj je.
8. Pozostaw kryształy do wyschnięcia. Na tym etapie możesz użyć próżni.

3. Czyszczenie tarczy ze stali nierdzewnej MALDI

1. Opłucz płytkę MALDI metanolem (MeOH) i delikatnie przetrzyj chusteczką czyszczącą przeznaczoną specjalnie do zastosowań laboratoryjnych (np. Kimwipe).
2. Opłucz cel za pomocą_H2Oi przetrzyj go chusteczką czyszczącą.
3. Włożyć płytkę MALDI do zlewki o pojemności 600 ml i zalać ją 50% EtOH.
4. Sonikować cel w roztworze EtOH przez 10 minut w kąpieli ultradźwiękowej.
5. Jeśli na płytce pozostały resztki, powtórz kroki 1-4 jeszcze raz.
6. Na koniec opłucz tarczę MeOH (lub wodą, patrz uwaga poniżej), przechyl ją w taki sposób, aby cały płyn zebrał się na chusteczce czyszczącej. Pozostaw obiekt do wyschnięcia w temperaturze pokojowej lub przy użyciu przepływu azotu i gazu.

Uwaga: Podobna procedura została wcześniej opisana ¹⁵.

Uwaga: Rozpuszczalnik (MeOH lub woda) użyty do ostatniego płukania celu określa niektóre cechy celu. Jeśli tarcza zostanie przepłukana MeOH, próbka rozprowadza się na tarczy znacznie bardziej niż przy użyciu wody.

4. Roztwór cienkowarstwowy α-CHCA: Przygotowanie i osadzanie na tarczy MALDI

1. Rozpuść α-CHCA w acetonie, aby uzyskać nasycony roztwór.
2. Ręcznie (bez pipety) zanurzyć końcówkę o pojemności 10 μl (np. GELoader Tip, Eppendorf) w roztworze nasyconym α-CHCA: niewielka ilość roztworu spłynie do końcówki (ze względu na kapilarność).
3. Dotknąć bardzo szybko (tj. 1 sekundę) tarczy MALDI końcówką pipety i nanieść roztwór acetonu α-CHCA na tarczę MALDI. Będzie to stanowić cienką warstwę matrycy, w której zostanie zdeponowana próbka białka. Spróbuj wygenerować cienką warstwę tak małą, jak to możliwe.

Uwaga: Używając SA jako matrycy, przygotowujemy cienką warstwę za pomocą nasyconego roztworu SA w acetonie.

5. Przygotowanie roztworów matrycowych: SA, α-CHCA, DHB i mieszaniny CHCA_DHB ²⁵

1. Przygotować roztwór SA o stężeniu 20 mg/ml w ACN, 0,1% TFA (70:30 obj.
2. Przygotować 20 mg/ml roztworu α-CHCA w ACN i 5% kwasie mrówkowym (70:30 obj./obj.) [o nazwie "roztwór α-CHCA"].
3. Przygotować roztwór DHB o stężeniu 20 mg/ml w ACN i 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA) (70:30 obj. / obj.) [o nazwie "roztwór DHB"].
4. Zmieszać "roztwór α-CHCA" i "roztwór DHB" w stosunku 1:1 (obj. / obj.), aby otrzymać "CHCA_DHB roztwór".

Uwaga: Można mieszać "roztwór α-CHCA" i "roztwór DHB" w różnych proporcjach, analizując białka o masie mniejszej niż 100 kDa. Na przykład stosunek 40:60 między α-CHCA a DHB (vol/vol) daje lepszą rozdzielczość, ale mniejszą czułość (patrz dyskusja).

6. Osadzanie próbki na tarczy MALDI

1. Osadzać 0,5 μl próbki białka na wcześniej przygotowanej cienkiej warstwie α-CHCA. Bezpośrednio po tym dodać 0,5 μl roztworu matrycy (tj. roztworu SA lub roztworu α-CHCA lub "mieszanki CHCA_DHB"). Oznacza to zmieszanie próbki i matrycy na tarczy.

Uwaga: Zazwyczaj miesza się próbkę białka z matrycą w stosunku 1:1. Stosunek ten ma kluczowe znaczenie dla dobrej jakości widm MALDI. Jeśli chcesz przetestować różne stężenia próbki, możesz użyć roztworu kwasu ACN_formic (opisanego powyżej) do rozcieńczenia próbki.

Uwaga: Jeśli wolisz, możesz wymieszać próbkę i matrycę w probówce, a następnie umieścić zmieszany "roztwór sample_matrix" na cienkiej warstwie.

Uwaga: Sugerujemy przetestowanie różnych stężeń próbki, ponieważ rozcieńczenie próbki pozwala na zmniejszenie interferencji zanieczyszczeń. Aby rozcieńczyć próbkę, można użyć roztworu kwasu ACN_formic (opisanego powyżej) w celu rozcieńczenia próbki.

7. Składanie Calibrant

1. Wprowadzić 0,5 μl wzorca kalibru (np. "wzorzec białka II", Bruker Daltonics, Bremen), a następnie dodać 0,5 μl roztworu matrycy.

Uwaga: Załaduj kalibert na płytkę MALDI obok miejsc z próbkami białka (zobacz dyskusję).

8. Pobieranie próbek kalibrów i białek za pomocą widm MALDI

Po wysuszeniu próbek i kalibru, możesz obserwować "plamy" pod mikroskopem. Ta obserwacja jest opcjonalna i może być interesująca głównie dla nowicjuszy. Aby uzyskać widma próbki, należy wprowadzić tarczę do instrumentu MALDI-TOF i wybrać odpowiednie parametry instrumentu, które są różne dla każdego typu sprzętu. Aby uzyskać najbardziej odpowiednią konfigurację, należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta. Ogólnie rzecz biorąc, podczas analizy nienaruszonych białek należy używać przyrządu w trybie liniowym (nie w trybie reflektorowym, który jest odpowiedni dla analiz peptydów). Zwykle używamy naszego instrumentu w trybie jonów dodatnich. Co więcej, kluczowym parametrem jest "pulsacyjna ekstrakcja jonów", która poprawia rozdzielczość instrumentalną ³¹. Mówiąc prościej, "pulsacyjną ekstrakcję jonów" można zdefiniować jako przerwę między generowaniem jonów próbki a czasem, w którym jony są przyspieszane w kierunku detektora. Do analizy nienaruszonych białek należy zastosować "pulsacyjną ekstrakcję jonów" (np. 500 nsec) większą niż przy obserwacji peptydów (np. 80 nsec).

Wybierz odpowiedni zakres m/z, uzyskaj widma kalibru i skalibruj instrument. Podczas uzyskiwania widm próbek należy użyć odpowiedniej intensywności lasera (patrz dyskusja).

Wyniki

Przeanalizowaliśmy nienaruszone białko (białko podtrzymujące region chromosomu 1, Crm1; masa cząsteczkowa: 123,386 Da) przy użyciu dwóch różnych matryc, dwóch metod osadzania i tej samej intensywności lasera (Rysunek 1). Jako matryce wykorzystano SA i mieszaninę CHCA_DHB. W wyniku mieszaniny uzyskano widma masowe o wyższej jakości pod względem stosunku sygnału do szumu i czułości (rys. 1A i B). W szczególności udało nam się wykryć 0,5 mola białka zdeponowanego na celu MALDI (ryc. 1C). Ta sama ilość białka była ledwo wykrywalna przy użyciu SA (ryc. 1D). Ponadto, przy użyciu mieszaniny matryc, metodą z wyboru do osadzania matrycy było podejście "cienkowarstwowe" (rysunek 1A). Stosując metodę "suchej kropelki" nie wykryliśmy żadnego białka o masie większej niż 100 kDa (dane nie pokazane). Wykorzystując mieszaninę CHCA_DHB (rysunki 1A i 1C), zaobserwowano wielokrotnie naładowany jon białka, co pozwoliło na określenie masy z większą dokładnością, ponieważ rozdzielczość szczytowa w osiowych instrumentach MALDI-TOF jest odwrotnie proporcjonalna do m/z²⁶.

Przeanalizowaliśmy również monomeryczną beta-galaktozydazę (116 300 Da) (Rysunek 2). Widma CHCA_DHB były lepsze od widm SA pod względem czułości i rozdzielczości. Co więcej, obecność wielokrotnie naładowanych jonów (M²⁺, M³⁺ i M⁴⁺) pozwoliła nam potwierdzić masę białka z większą dokładnością (ryc. 2A i 2C). Stosując podejście cienkowarstwowe, porównaliśmy wydajność samej mieszaniny CHCA_DHB, SA i α-CHCA do analizy immunoglobuliny, IgG (148 500 Da) (Figura 3). Kiedy skorelujemy różne dane, sygnały białkowe były wyższe i miały lepszą rozdzielczość w widmach CHCA_DHB. Podsumowując, zastosowanie mieszaniny CHCA_DHB i metody osadzania cienkiej warstwy wykazało znaczną poprawę jakości dużych, nienaruszonych widm masy białek uzyskanych za pomocą instrumentu MALDI-TOF.

Rysunek 1. Analiza MALDI-TOF nienaruszonego białka podtrzymującego region chromosomu 1 (Crm1), masa cząsteczkowa: 123 386 Da. A) 1 pmole Crm1 analizowano przy użyciu mieszanki DHB_CHCA jako matrycy. B) ilość: 1 pmole; matryca: SA. C) ilość: 0,5 pmol; matryca: DHB_CHCA. D) ilość: 0,5 pmole; matryca: SA. Sygnał pików, wyrażony w dowolnej skali jednostek natężenia, jest znormalizowany do maksymalnej wartości występującej w każdym widmie.

Rysunek 2. Analiza MALDI-TOF nienaruszonej beta-galaktozydazy (116 300 Da). A) kwota: 20 pmoles; matryca DHB_CHCA. B) ilość: 20 moli; matryca: SA. C) ilość: 5 pmoles; matryca: DHB_CHCA. D) ilość: 5 pmoles; matryca: SA.

Rysunek 3. Analiza MALDI-TOF nienaruszonej immunoglobuliny, IgG (148 500 Da); Ilość: 1,7 pmoles. Widma uzyskane przy użyciu mieszaniny CHCA_DHB były znacznie intensywniejsze (maksimum: 8200 jednostek arbitralnych, au) niż widma SA (maksimum: 1200 au) i widma α-CHCA (maksimum: 4500 au).

Dyskusja

Przedstawiliśmy szczegółowy protokół pozyskiwania wysokiej jakości widm masowych dużych, nienaruszonych białek o masie cząsteczkowej większej niż 100 kDa, przy użyciu instrumentu MALDI-TOF. Należy dokładnie rozważyć szereg krytycznych aspektów dotyczących przygotowania próbki w celu poprawy jakości widm masowych. Matryce i rozpuszczalniki o wysokiej czystości mają kluczowe znaczenie, ponieważ wszystkie zanieczyszczenia obecne w matrycach i rozpuszczalnikach są skoncentrowane na tarczy MALDI po odparowaniu rozpuszczalnika. W celu zwiększenia czystości matryc MALDI możliwe jest ich oczyszczenie przy użyciu klasycznych metod rekrystalizacji (patrz wyżej). Zalecamy również świeże przygotowanie roztworów matryc (co najmniej raz w tygodniu) w celu poprawy krystalizacji matrycy i uniknięcia degradacji matrycy.

Podejście oparte na osadzaniu matrycy ma kluczowe znaczenie dla końcowej jakości widm. Jak opisano powyżej, metoda cienkowarstwowa jest naszą metodą z wyboru ¹². Ponadto zoptymalizowaliśmy podejście do nakładania pierwszej warstwy. Gdy matryca jest rozpuszczona w acetonie w celu uzyskania nasyconego roztworu, propanon umożliwia szybkie odparowanie rozpuszczalnika, ale także sprawia, że wielkość pierwszej warstwy jest bardzo trudna do kontrolowania. Sugerujemy użycie końcówki GELoader jako małego pędzla, który zanurzasz w roztworze matrix_acetone, aby uzyskać minimalną objętość, którą szybko osadzasz na celu. Wielkość pierwszej warstwy w jakiś sposób kontroluje ostateczny rozmiar plamki MALDI: preferowana jest mała plamka (tj. 0,5-0,75 mm średnicy), ponieważ w tym przypadku stężenie próbki jest wyższe niż w przypadku dużej plamki. Uzyskanie małej plamki różni się od podejścia ultracienkiej warstwy zaproponowanego wcześniej w filmie JoVE ¹⁵. W Fenyo i wsp. cienkowarstwowy roztwór rozprowadza się po całej tarczy MALDI za pomocą boku końcówki pipety. Podejście to wymaga zbadania cienkiej warstwy, która powinna spełniać określone kryteria (np. szybkość parowania rozpuszczalnika). Jeśli kryterium nie jest spełnione, wzorzec MALDI należy umyć i przygotować nową cienką warstwę. To sprawia, że przygotowanie jest dość pracochłonne dla nowicjusza. Ponadto osadzanie mieszaniny próbka/matryca na płytce wymaga zasysania nadmiaru rozpuszczalnika za pomocą linii próżniowej i konieczny jest etap płukania przy użyciu TFA¹⁵ , co sprawia, że przygotowanie Fenyo i wsp. jest nieco trudniejsze niż nasze podejście.

Stosunek objętości między matrycą a próbką jest bardzo ważny dla pomyślnej analizy nienaruszonych białek za pomocą MALDI-TOF. Po przetestowaniu różnych proporcji sugerujemy użycie współczynnika 1:1. Inna proporcja matryca do próbki może pogorszyć jakość widm, prawdopodobnie z powodu niejednorodnej krystalizacji. Kolejność, w jakiej matryca i próbka są osadzane, ma również kluczowe znaczenie. Po nałożeniu cienkiej warstwy matrycy próbka jest osadzana i bezpośrednio po tym (zanim plamka próbki wyschnie) dodaje się CHCA_DHB mieszaninę. Procedura ta została zdefiniowana jako "metoda warstwowa" ²⁷, w której sama próbka jest umieszczana między dwiema warstwami matrycy. Alternatywnie, roztwór CHCA_DHB i próbkę można zmieszać w probówce o pojemności 0,5 ml, a następnie nakrapić na cienkiej warstwie CHCA ¹². W ten sposób powstaje plamka z jednorodną warstwą kryształów, co skutkuje wysokiej jakości widmami. Podczas analizy białek o masie mniejszej niż 100 kDa stężenie DHB może być zwiększone (np. 60:40 DHB:CHCA); Może to spowodować ostrzejsze pikowanie, ale może pogorszyć czułość pomiaru (tj. mniej intensywne piki).

W celu prawidłowej kalibracji przyrządu konieczne jest umieszczenie wzorców kalibru bardzo blisko miejsc pobierania próbek, co pozwala na uzyskanie lepszej dokładności masy. Wcześniej sugerowano "pseudo-wewnętrzną procedurę kalibracji" ¹⁵: po uzyskaniu widma próbki, punkt kalibru jest wystrzeliwany laserowo, a sygnał kalibru jest dodawany do widma próbki. Pozwala to na wewnętrzną kalibrację widma próbki przy użyciu pików kalibru.

Energia lasera powinna być również dokładnie kontrolowana podczas akwizycji widm. W większości przypadków wyższa energia zwiększa czułość, ale obniża rozdzielczość. Sugerujemy użycie jak najmniejszej energii lasera bez uszczerbku dla czułości akwizycji. Ponadto, aby poprawić jakość spektralną, można uzyskać więcej ujęć w każdym miejscu próbki. Zwykle im więcej ujęć (1,000-2,000 zdjęć), tym większa intensywność sygnału. Uderzając laserem w miejsce, należy znaleźć właściwą pozycję (tj. "sweet spot"), ponieważ próbka nie jest równomiernie rozprowadzona. Możesz strzelać w ten sam obszar, aż sygnał będzie się zwiększał, a następnie spróbować znaleźć inny obszar zawierający próbkę.

Podsumowując, wysoka czystość matryc i rozpuszczalników, metody stosowane do osadzania próbek i matryc na tarczy, położenie wzorców użytych do kalibracji, intensywność energii lasera, czas akwizycji (liczba strzałów/plamkę) są krytycznymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę podczas analizy nienaruszonych białek metodą MALDI-TOF MS.

Wkład autora

L.S. i E.B.E. zaprojektowali eksperymenty, przeprowadzili eksperymenty ze spektrometrią mas, przeanalizowali dane i napisali manuskrypt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
Trizma chlorowodorek	Sigma	T3253
Trizima	Sigma	T6066
Micro Bio-Spin 6 kolumny chromatograficzne	Bio-Rad	732-6221
Vivaspin 500	Sartorius	VS0122	odcięcie
metanolu	o	różnej masie cząsteczkowej14262
Etanol	Fluka	02860
KIMTECH SCIENCE Chusteczki precyzyjne Wycieraczki do tkanek	Kimberly Clark	05511
α-kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy	Sigma Aldrich	C8982
Aceton	Sigma Aldrich	650501
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy	Fluka	39319
GELoader Tips	Eppendorf	0030 001.222
Acetonitryl	Sigma Aldrich	34998
Kwas mrówkowy	Fluka	09676
Kwas trifluorooctowy	Sigma Aldrich	302031
Protein Standard II	Bruker Daltonics	207234	Zawiera trypsynogen, białko A, albuminę surowicy-immunoglobulinę bydlęcą
G	ABSciex	GEN602151
[nagłówek]
EQUIPMENT
Oczyszczacz wody PURELAB Ultra Analytic	ELGA LabWater	89204-052
Autoflex MALDI-TOF	Bruker Daltonics
MALDI-TOF celownik	Bruker Daltonics