Method Article

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

DOI:

10.3791/50637

⸱

October 4th, 2013

 ,  , 
1Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki odkrywa nowe mechanizmy regulacyjne, które są ukryte w pomiarach przeprowadzonych na poziomie populacji. Przedstawiono dwie metody oparte na mikroskopii i cytometrii przepływowej, aby pokazać, w jaki sposób można pozyskać takie dane. Jako przykład posłużono się ekspresją fluorescencyjnego reportera indukowaną po aktywacji szlaku MAPK glicerolu o wysokiej osmolarności w drożdżach. Podkreślono konkretne zalety każdej z metod. Cytometria przepływowa mierzy dużą liczbę komórek (10 000) i zapewnia bezpośredni pomiar dynamiki ekspresji białek niezależnie od powolnej kinetyki dojrzewania białka fluorescencyjnego. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii jest natomiast ograniczone do pomiaru dojrzałej formy reportera w mniejszej liczbie komórek. Jednak zbiory danych generowane tą techniką mogą być niezwykle bogate dzięki kombinacjom wielu reporterów oraz informacjom przestrzennym i czasowym uzyskanym z poszczególnych komórek. Połączenie tych dwóch metod pomiarowych może dostarczyć nowych informacji na temat regulacji ekspresji białek za pomocą szlaków sygnałowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja poprzez kaskady transdukcji często kończy się ekspresją białek. Charakterystyka tego profilu ekspresji jest kluczowym elementem w zrozumieniu funkcji szlaków biologicznych. Identyfikacja spektrum białek regulowanych w górę i dynamika ich aktywacji może być osiągnięta za pomocą różnych technik, takich jak mikromacierze, northern blot lub western blot1-3. Jednak techniki te uśredniają odpowiedź całej populacji komórek. Aby zrozumieć precyzyjną regulację ekspresji białek, pożądane jest zebranie pomiarów na poziomie pojedynczej komórki. Idealnie byłoby, gdyby pomiary te dostarczyły również danych ilościowych umożliwiających opracowanie modeli matem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pomiary mikroskopowe

  1. Zaszczepić 5 ml pożywki syntetycznej drożdżami.
  2. Hoduj komórki w temperaturze 30 °C przez noc.
  3. Zmierz OD600 w nocnej kulturze następnego ranka.
  4. Rozcieńczyć kulturę przez noc w 5 ml pożywki syntetycznej do OD600 0,05.
  5. Rozcieńczoną kulturę hodować w temperaturze 30 °C przez co najmniej 4 godziny.
  6. Przygotować 3-krotnie stężony (0,6 M) roztwór NaCl w podłożu syntetycznym.
  7. Przygotować roztwór 1 mg/ml konkanawaliny A (ConA) w PBS.
  8. Przefiltrować ~200 μl roztworu ConA do szkiełka studziennego.
  9. Odstawić na 30 min.
  10. Usuń roztwór ConA.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia

Komórki drożdży z wyrażeniem reporter pSTL1-qV (ySP97) zostały przymocowane do dna szkiełka i umieszczone pod mikroskopem. Komórki były stymulowane przez dodanie pożywki antystresowej bezpośrednio do studzienki w trakcie sesji obrazowania. Dzięki temu możemy uzyskać kilka obrazów komórek przed indukcją szlaku i śledzić ich losy po stymulacji. W tym przypadku komórki obserwowano przez ~ 2 godziny w odstępie czasu 10 minut. Rysunek 1A jest obrazem ko.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia

Leczenie studni ConA jest niezbędnym krokiem do zapewnienia prawidłowego obrazowania komórek. Ponieważ ConA ma niską rozpuszczalność w PBS (5 mg/ml), proces filtracji pozwala na usunięcie dużych agregatów, które są obecne w niefiltrowanym roztworze i zakłócają obrazowanie. Komórki przyczepiają się stosunkowo silnie do leczonej powierzchni, a dodanie roztworu indukującego nie powinno zaburzać lokalizacji komórek, umożliwiając ciągłe śledzenie przed i po bodźcu. Zabieg ten może być równ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Matthiasowi Peterowi i jego grupie w Instytucie Biochemii na ETH w Zurychu, gdzie te metody zostały opracowane. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reodagent
Drożdże Azot BazaForMediumCYN6202
CSM mieszanka aminokwasówForMediumDCS0011
Concanavalin AGE Healthcare17-0450-01
CykloheksymidFluka Aldrich SigmaC7698Toksyczny
ySP9W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Materiał
MikroskopNikonTi-Eclipse
Oprogramowanie sterujące mikroskopemMicro-managerVer 1.4.11
Komora inkubacyjnaLISThe Box
Światło fluorescencyjne źródło:LumencorSpectraX
KameraHamamatsuFlash 4.0
Cytometr przepływowyBDFACS calibur
Kąpiel SonicatorTelesonicTUC-150
8-dołkowy szkiełko Thermo Lab-tek155409
96-dołkowa płytkaMatrical biologicalMGB096-1-2-LG
FACS dętkaBD Falcon352054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MAPK PathwayYeast CellsFluorescent ReporterFlow CytometryLive Cell MicroscopySingle Cell AnalysisProtein ExpressionCycloheximide TreatmentTime Lapse ImagingGene Expression

Related Articles