Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Podsumowanie

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Streszczenie

Kwantyfikacja ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki odkrywa nowe mechanizmy regulacyjne, które są ukryte w pomiarach przeprowadzonych na poziomie populacji. Przedstawiono dwie metody oparte na mikroskopii i cytometrii przepływowej, aby pokazać, w jaki sposób można pozyskać takie dane. Jako przykład posłużono się ekspresją fluorescencyjnego reportera indukowaną po aktywacji szlaku MAPK glicerolu o wysokiej osmolarności w drożdżach. Podkreślono konkretne zalety każdej z metod. Cytometria przepływowa mierzy dużą liczbę komórek (10 000) i zapewnia bezpośredni pomiar dynamiki ekspresji białek niezależnie od powolnej kinetyki dojrzewania białka fluorescencyjnego. Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii jest natomiast ograniczone do pomiaru dojrzałej formy reportera w mniejszej liczbie komórek. Jednak zbiory danych generowane tą techniką mogą być niezwykle bogate dzięki kombinacjom wielu reporterów oraz informacjom przestrzennym i czasowym uzyskanym z poszczególnych komórek. Połączenie tych dwóch metod pomiarowych może dostarczyć nowych informacji na temat regulacji ekspresji białek za pomocą szlaków sygnałowych.

Wprowadzenie

Sygnalizacja poprzez kaskady transdukcji często kończy się ekspresją białek. Charakterystyka tego profilu ekspresji jest kluczowym elementem w zrozumieniu funkcji szlaków biologicznych. Identyfikacja spektrum białek regulowanych w górę i dynamika ich aktywacji może być osiągnięta za pomocą różnych technik, takich jak mikromacierze, northern blot lub western blot^1-3. Jednak techniki te uśredniają odpowiedź całej populacji komórek. Aby zrozumieć precyzyjną regulację ekspresji białek, pożądane jest zebranie pomiarów na poziomie pojedynczej komórki. Idealnie byłoby, gdyby pomiary te dostarczyły również danych ilościowych umożliwiających opracowanie modeli matematycznych leżącej u podstaw szlaku.

Mikroskopia i cytometria przepływowa to dwie techniki, które idealnie nadają się do wykonywania takich ilościowych pomiarów pojedynczych komórek. Endogenne znakowanie białek białkiem fluorescencyjnym można wykorzystać do ilościowego określenia ich poziomu ekspresji ⁴. Ponieważ jednak dodanie dużej cząstki fluorescencyjnej na końcu białka może sprawić, że stanie się ono niefunkcjonalne, często bardziej pożądane jest generowanie specyficznych reporterów ekspresji w oparciu o promotor napędzający ekspresję konstruktu fluorescencyjnego. To białko reporterowe jest egzogenne dla układu komórkowego i dlatego nie wpływa na zdarzenia sygnalizacyjne zachodzące w komórce.

Zarówno mikroskopia, jak i cytometria przepływowa były szeroko stosowane w dziedzinie sygnalizacji drożdży. Jako przykłady; Colman-Lerner i współpracownicy skorelowali w pojedynczych komórkach ekspresję specyficznych dla kojarzenia i konstytutywnie wyrażonych reporterów za pomocą mikroskopii, aby określić ilościowo szum w kaskadzie transdukcji sygnału kojarzenia drożdży⁵, Acar i współpracownicy wykorzystali cytometrię przepływową do zbadania sieci regulacyjnej kontrolującej ekspresję genów GAL⁶. W poprzednim badaniu⁷ zastosowaliśmy kombinację tych dwóch technik do zbadania ekspresji ze szlaku glicerolu o wysokiej osmolarności (HOG) w pączkujących drożdżach. Ten szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) jest wyzwalany przez stres hiperosmotyczny. Powoduje to aktywację MAPK Hog1, który przemieszcza się do jądra komórki w celu wywołania programu transkrypcyjnego, w wyniku którego dochodzi do ekspresji około 300 genów. Aby zbadać ten proces, zaprojektowaliśmy reporter ekspresji oparty na promotorze STL1 (gen indukowany specjalnie w odpowiedzi na aktywność Hog1⁸) napędzający ekspresję poczwórnego białka fluorescencyjnego Wenus (pSTL1-qV). Pomiary cytometrii przepływowej ujawniły obecność dwóch populacji komórek na pośrednim poziomie stresu (0,1 M NaCl), przy czym tylko ułamek populacji wykazywał ekspresję fluorescencyjnego reportera. Użyliśmy mikroskopii, aby dokładniej zbadać to zachowanie i odkryliśmy, że ten szum w ekspresji białek był regulowany przez czynniki wewnętrzne⁹. Mogliśmy dalej zaobserwować, że komórki o podobnym poziomie aktywności Hog1 mogą wykazywać uderzająco różne wyniki ekspresji. Połączenie tych dwóch technik pozwoliło nam zademonstrować, w jaki sposób powolna przebudowa genów reakcji na stres wpłynęła na wynik ekspresji na poziomie pojedynczej komórki⁷.

W tym artykule używamy wyrażenia reporterap STL1-qV wywołanego przez szok hiperosmotyczny jako przykładu kwantyfikacji ekspresji białka za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Ten sam szczep poddany naprężeniu 0,2 M NaCl badano za pomocą obu technik. Pozwoli nam to podkreślić kilka kluczowych różnic w tych dwóch wysoce uzupełniających się technikach.

Protokół

1. Pomiary mikroskopowe

1. Zaszczepić 5 ml pożywki syntetycznej drożdżami.
2. Hoduj komórki w temperaturze 30 °C przez noc.
3. Zmierz OD₆₀₀ w nocnej kulturze następnego ranka.
4. Rozcieńczyć kulturę przez noc w 5 ml pożywki syntetycznej do OD₆₀₀ 0,05.
5. Rozcieńczoną kulturę hodować w temperaturze 30 °C przez co najmniej 4 godziny.
6. Przygotować 3-krotnie stężony (0,6 M) roztwór NaCl w podłożu syntetycznym.
7. Przygotować roztwór 1 mg/ml konkanawaliny A (ConA) w PBS.
8. Przefiltrować ~200 μl roztworu ConA do szkiełka studziennego.
9. Odstawić na 30 min.
10. Usuń roztwór ConA.
11. Dodać 150 μl H₂O do studzienki.
12. Usunąć_H2O.
13. Zmierz OD₆₀₀ hodowli komórkowej.
14. Przygotować 300 μl kultury komórkowej o średnicy_{zewnętrznej 600} = 0,02 w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
15. Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 45 sekund.
16. Krótko przekręć mikrorurkę.
17. Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 45 sekund.
18. Krótko przekręć mikrorurkę.
19. Dodaj 200 μl kultury komórkowej do studzienki.
20. Odczekaj 30 minut, aby komórki osiadły na dnie studzienki.
21. Umieść szkiełko studzienne na mikroskopie.
22. Wybierz ustawienia oświetlenia dla kanału fluorescencyjnego, który ma być nagrywany.
23. Wybierz ustawienia oświetlenia dla dwóch obrazów w jasnym polu (jeden lekko nieostry: 3 μm poniżej płaszczyzny ogniskowej, aby umożliwić prawidłową segmentację komórek).
24. Wybierz przedziały czasowe dla pomiaru poklatkowego
25. Wybierz pola widoku do obrazu.
26. Rozpocznij pobieranie kilku klatek.
27. Wstrzymaj akwizycję, aby dodać 100 μl 0,6 M Pożywki NaCl.
28. Wznów obrazowanie.

2. Pomiary cytometrii przepływowej

1. Zaszczepić 5 ml pożywki syntetycznej drożdżami.
2. Rośnie w temperaturze 30 °C przez noc.
3. Zmierz OD₆₀₀ w nocnej kulturze następnego ranka.
4. Rozcieńczyć kulturę przez noc w 5 ml pożywki syntetycznej do OD₆₀₀ 0,1.
5. Rosnąć w temperaturze 30 °C przez co najmniej 4 godziny, aby osiągnąć OD₆₀₀ 0,2-0,4.
6. Przygotować roztwór cykloheksymidu o stężeniu 1 mg/ml w_H2O.
7. Przygotować 3-krotnie stężony (0,6 M) roztwór NaCl w podłożu syntetycznym.
8. Przygotować jedną mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml ze 100 μl 0,6 M pożywki NaCl dla każdego punktu pomiarowego.
9. W czasie 0 dodaj 200 μl kultury komórkowej do każdej mikroprobówki.
10. Inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C.
11. W czasie T dodać 30 μl cykloheksymidu do mikroprobówki.
12. Powtórz krok 2.11 dla wszystkich żądanych punktów czasowych.
13. Inkubować wszystkie mikroprobówki przez co najmniej 45 minut i do 3 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
14. Przygotować probówki FACS z 400 μl PBS.
15. Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 1 min.
16. Krótko przekręć mikrorurki.
17. Sonikować komórki w łaźni wodnej przez 1 min.
18. Krótko przekręć mikrorurki.
19. Dodaj 100 μl kultury komórkowej z każdej mikroprobówki do odpowiadającej jej probówki FACS.
20. Wybierz laser wzbudzający 488 nm i filtr pasmowo-przepustowy 530/30 nm do wykrywania.
21. Przetestuj próbkę bez ekspresji i w pełni wyrażającą, aby sprawdzić, czy mieszczą się w zakresie czułości detektora.
22. Zmierz 10 000 komórek dla każdej pobranej próbki.

Wyniki

Mikroskopia

Komórki drożdży niosące reporter ekspresji pSTL1-qV (ySP9⁷) przymocowano do dna szkiełka z wgłębieniami i umieszczono pod mikroskopem. Komórki stymulowano poprzez dodanie pożywki stresowej bezpośrednio do wgłębienia w trakcie sesji obrazowania. Pozwala to na wykonanie kilku obrazów komórek przed indukcją szlaku i śledzenie ich losów po stymulacji. W niniejszym przypadku komórki obserwowano przez ~2 hr w odstępach czasu wynoszących 10 min. Rysunek 1A

Dyskusja

Mikroskopia

Leczenie studni ConA jest niezbędnym krokiem do zapewnienia prawidłowego obrazowania komórek. Ponieważ ConA ma niską rozpuszczalność w PBS (5 mg/ml), proces filtracji pozwala na usunięcie dużych agregatów, które są obecne w niefiltrowanym roztworze i zakłócają obrazowanie. Komórki przyczepiają się stosunkowo silnie do leczonej powierzchni, a dodanie roztworu indukującego nie powinno zaburzać lokalizacji komórek, umożliwiając ciągłe śledzenie przed i po bodźcu. Zabieg ten może być równ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodagent
Drożdże Azot Baza	ForMedium	CYN6202
CSM mieszanka aminokwasów	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cykloheksymid	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toksyczny
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Materiał
Mikroskop	Nikon	Ti-Eclipse
Oprogramowanie sterujące mikroskopem	Micro-manager	Ver 1.4.11
Komora inkubacyjna	LIS	The Box
Światło fluorescencyjne źródło:	Lumencor	SpectraX
Kamera	Hamamatsu	Flash 4.0
Cytometr przepływowy	BD	FACS calibur
Kąpiel Sonicator	Telesonic	TUC-150
8-dołkowy szkiełko	Thermo Lab-tek	155409
96-dołkowa płytka	Matrical biological	MGB096-1-2-LG
FACS dętka	BD Falcon	352054