Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Summary

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Abstract

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest potężnym narzędziem do badania biofilmów. Bardzo niewiele badań udało się określić ilościowo jednoczesny rozkład więcej niż dwóch składników w biofilmach, ponieważ: 1) wybór barwników fluorescencyjnych o minimalnym nakładaniu się widmowym jest skomplikowany, a 2) kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Cele: Opracowanie metodyki ilościowego określania i porównywania jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech komórkowych/zewnątrzkomórkowych składników biofilmów hodowanych na odpowiednich podłożach. Metody: Metoda składa się z odrębnych, powiązanych ze sobą etapów obejmujących wzrost biofilmu, barwienie, obrazowanie CLSM, analizę i wizualizację strukturalną biofilmu oraz analizę statystyczną parametrów strukturalnych. Biofilmy Streptococcus mutans (szczep UA159) hodowano przez 48 godzin na sterylnych próbkach kompozytów żywicznych Point 4 i TPH³. Próbki zanurzono następnie na 60 sekund w płynach do płukania jamy ustnej Biotène PBF (BIO) lub Listerine Total Care (LTO) lub w wodzie (grupa kontrolna; n=5/grupa). Biofilmy barwiono fluorochromami dla zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, białek i kwasów nukleinowych przed obrazowaniem za pomocą CLSM. Parametry strukturalne biofilmu obliczone za pomocą oprogramowania do analizy obrazu ISA3D obejmowały bioobjętość i średnią grubość biofilmu. W analizach statystycznych modeli mieszanych porównano parametry strukturalne między grupą płynu do płukania jamy ustnej a grupą kontrolną (oprogramowanie SAS; α=0,05). Oprogramowanie Volocity umożliwiło wizualizację rozkładu 3D nałożonych składników biofilmu (fluorochromów). Wyniki: Płyn do płukania jamy ustnej BIO wytwarzał struktury biofilmu, które znacznie różniły się od kontrolnego (p<0,05) na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy LTO nie powodowało różnic (p>0,05) na żadnym z produktów. Wnioski: Metodologia ta pozwoliła na skuteczne i skuteczne określenie ilościowe i porównanie jednoczesnych rozkładów 3D trzech głównych składników w biofilmach S. mutans na odpowiednich podłożach, pokonując w ten sposób dwa wyzwania związane z jednoczesną oceną składników biofilmu. Metoda ta może być również stosowana do określenia skuteczności środków przeciwbakteryjnych/przeciwporostowych przeciwko wielu składnikom biofilmu, jak wykazano przy użyciu płynów do płukania jamy ustnej. Ponadto metoda ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ ułatwia porównywanie struktur/architektury 3D biofilmów w różnych dyscyplinach.

Introduction

Biofilmy to ustrukturyzowane społeczności mikroorganizmów, które są zamknięte w samodzielnie wyprodukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej i są przyczepione do powierzchni biologicznych lub obojętnych¹. Biofilmy reprezentują powszechny styl życia wielu bakterii i tworzą się etapami od swobodnie pływających (planktonowych) komórek do złożonych społeczności wielogatunkowych. Wrodzona oporność biofilmów na środki przeciwdrobnoustrojowe jest przyczyną wielu uporczywych i przewlekłych zakażeń bakteryjnych^1,2, czego dowodem są biofilmy jamy ustnej (płytka nazębna). Mikroorganizmy próchnicotwórcze, takie jak paciorkowce mutans, przetwarzają sacharozę i inne węglowodany w celu wytworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej i wytworzenia kwasów, które mogą demineralizować strukturę zębów i powodować próchnicę. Większość matryc biofilmu to biopolimery składające się ze składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych, takich jak egzopolisacharydy (EPS), białka i kwasy nukleinowe^3,4.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM), najczęściej stosowana technika obrazowania fluorescencyjnego, radykalnie zmieniła obrazowanie optyczne w biologii, ponieważ ma możliwość zbierania obrazów 3D uwodnionych struktur biologicznych bez fiksacji^5,6,7. Ta nieniszcząca technika polega na zbieraniu obrazów cienkich odcinków w obszarze zainteresowania próbki w taki sposób, aby usunąć wpływ nieostrego światła. Jakość i rozdzielczość obrazów rejestrowanych przez CLSM wykracza poza to, co można osiągnąć przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jedną z głównych wad CLSM jest to, że skanowanie obrazów odbywa się wolniej niż w przypadku technik mikroskopii szerokokątnej, w których całe obrazy są zbierane jednocześnie5^. Jednak wraz z coraz szerszym wyborem fluorochromów, laserów i filtrów, CLSM stał się jedną z dominujących technik obrazowania wielospektralnego^5,7.

Poprzednie badania wykazały, że CLSM jest użytecznym narzędziem do badania struktury lub architektury biofilmów za pomocą jednego lub dwóch znaczników fluorescencyjnych lub barwników, aby zapewnić lepsze zrozumienie rozmieszczenia EPS i komórek w biofilmach, a zwłaszcza w macierzy zewnątrzkomórkowej^7,8. Teoretycznie barwienie/znakowanie fluorescencyjne wielu składników jest pożądane w celu zbadania szczegółowej struktury i kolokalizacji składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Jednak jednoczesna analiza różnych składników w biofilmach może być trudna, ponieważ: 1) wybór barwników fluorescencyjnych o minimalnym nakładaniu się widmowym jest skomplikowany oraz 2) kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Kolokalizacja przy użyciu wielu fluorochromów wymaga użycia wysoce specyficznych barwników z minimalną interferencją spektralną, aby uniknąć efektów przebijania, które występują, gdy dwa fluorochromy znacznie nakładają się na siebie w swoim piku widmowym, powodując, że jeden jest silniej wzbudzony niż drugi⁹. Idealnie, fluorochromy o widmach wzbudzenia, które nie nakładają się na siebie, zapewniłyby najlepsze wyniki, jednak bardzo trudno jest znaleźć plamy spełniające to kryterium. Zamiast tego wybór plam jest optymalizowany poprzez wybór fluorochromów, których widma emisyjne w minimalnym stopniu się pokrywają, co pozwala na oglądanie plam jeden po drugim w ograniczonym paśmie długości fali^{obserwacyjnej 9}.

Nakładanie obrazów fluorescencyjnych jest prawdopodobnie najczęściej używaną metodą oceny jednoczesnego rozkładu fluorochromów. Kolokalizacja różnych składników objawia się nakładaniem się różnych kolorów przez wiele kanałów utworzonych przez badane fluorochromy¹⁰. Narzędzia do wyświetlania wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych jako scalonych obrazów kolorowych są dostępne w większości programów CLSM i do analizy obrazów biologicznych. Chociaż nakładanie obrazów jest przydatne do przestrzennej oceny kolokalizacji, obrazy mogą być badane jakościowo tylko za pomocą analizy wizualnej. Dostarcza to ograniczonej ilości informacji, ponieważ te reprezentacje na ogół nie są pomocne w ilościowym określaniu kolokalizacji w różnych warunkach eksperymentalnych, ani nie określają, czy kolokalizacja wykracza poza przypadkową koincydencję¹¹. W bardzo niewielu dotychczasowych badaniach wykorzystano metody ilościowe do analizy trójwymiarowej struktury biofilmów i składników biofilmu, a jeszcze mniej określiło ilościowo wpływ zabiegów przeciwbakteryjnych lub środków przeciwporostowych na składniki biofilmu.

Celem tego badania było przedstawienie metodologii kwantyfikacji i porównania jednoczesnych 3-wymiarowych rozkładów trzech komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów. Metoda składa się z odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów, obejmujących wzrost biofilmu, barwienie, obrazowanie CLSM biofilmów, analizę strukturalną i wizualizację biofilmu oraz analizę statystyczną parametrów strukturalnych. Test wzrostu biofilmu pozwala na wzrost biofilmu na odpowiednich podłożach i wytwarza struktury biofilmu, które są powtarzalne. Połączenie nowatorskiego jednoczesnego barwienia EPS, białek i składników kwasów nukleinowych z pomiarem parametrów strukturalnych 3D biofilmu skutkuje ilościowym rozkładem składników w biofilmach. Analiza statystyczna parametrów strukturalnych biofilmu ułatwia ocenę biofilmów w określonych warunkach doświadczalnych (np. po leczeniu płynami do płukania jamy ustnej), co zostanie opisane w następnym rozdziale.

Protocol

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

1. Przygotować 300 ml pożywki do hodowli na noc (THY; 3% bulion Todd Hewitt przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta, uzupełniony 0,3% ekstraktem drożdżowym w ultraczystej wodzie) i autoklaw. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.
2. Przygotuj 1 l agaru THY (3% bulionu Todd Hewitt, 0,3% ekstraktu drożdżowego i 1,5% agaru w ultraczystej wodzie), autoklaw i ostudź do 60 °C przed przelaniem na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
3. Przygotuj 150 ml pożywki do wzrostu biofilmu (0,5 X TY uzupełnionej 10 mM sacharozy; 1,5% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego i 10 mM sacharozy w ultraczystej wodzie) i przefiltruj sterylizację. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
4. Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ w ultraczystej wodzie) i przelać w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
5. Przygotować 600 ml 10 mM buforu Tris HCl uzupełnionego 10 mM CaCl₂ w ultraczystej wodzie (bufor TC; pH 7,2) i autoklaw. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
6. Autoklaw 1 l ultraczystej wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

2. Produkcja próbek

1. Wytwarzanie próbek kompozytów z żywicy dentystycznej Point 4 (PF) i TPH³ (TP) w kształcie dysku w wykonanej na zamówienie formie ze stali nierdzewnej w dwóch przyrostach. Każdy przyrost jest utwardzany światłem przez 40 sekund za pomocą jednostki utwardzania światłem LED. Te dwa produkty mają nieco inny skład i poziomy wypełniaczy, a tym samym wytwarzają różne topografie powierzchni, na których będą hodowane biofilmy.
   1. Próbki odpowiednich substratów mogą być wytwarzane przy użyciu ustalonych protokołów z innych dyscyplin zamiast kroku 2.1.
2. Wykańczaj i poleruj próbki do akceptowalnego końcowego wykończenia powierzchni, np. za pomocą półautomatycznej szlifierko-polerki. Wypłukać wypolerowane próbki ultraczystą wodą i osuszyć sprężonym powietrzem.
3. Sterylizuj próbki za pomocą gazowego tlenku etylenu lub alternatywnej metody sterylizacji.

3. Wzrost biofilmu

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię S. mutans w 4 ml pożywki do hodowli na noc (krok 1.1). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin. Gęstość optyczna (OD₆₀₀) kultury powinna wynosić ≥0,9.
   1. Najlepiej jest używać kolonii z kultur płytkowych, które zostały pasażowane 2x z oryginalnego stada, ponieważ powoduje to bardziej spójny wzrost biofilmu.
2. Stworzyć rozcieńczenie w stosunku 1:100, stosując kulturę na noc (krok 1.1) w 10 ml pożywki do wzrostu biofilmu (krok 1.3).
3. Przenieść sterylne próbki kompozytowe z żywicy (np. PF, TP) na sterylne płytki 12-dołkowe.
4. Dodać 2,5 ml rozcieńczonej pożywki hodowlanej (krok 3.2) do studzienek w celu leczenia (płyn do płukania jamy ustnej) i grup kontrolnych. Dodać 2,5 ml sterylnej, niezaszczepionej pożywki do wzrostu biofilmu do studzienek kontrolnych sterylności.
5. Hoduj biofilmy w warunkach mikroaerofilnych. Umieścić płytki na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.
6. Po 24 godzinach asepcie odessać pożywkę ze wszystkich studzienek i przemyć dwukrotnie sterylnym PBS (krok 1.4; 2,5 ml/studzienkę), odsysając PBS po każdym przemyciu. Uzupełnić 2,5 ml świeżej pożywki do wzrostu biofilmu w każdym dołku i inkubować przez dodatkowe 24 godziny w identycznych warunkach, jak w poprzednim etapie, co daje całkowity czas wzrostu biofilmu wynoszący 48 godzin.
7. Zamiast powyższych kroków, biofilmy innych gatunków mogą być hodowane na podłożach przy użyciu ustalonych protokołów.

4. Zabiegi antybakteryjne/płyn do płukania jamy ustnej

1. Odessać pożywkę po zakończeniu wzrostu biofilmu.
2. Dodaj 2,5 ml płynu do płukania jamy ustnej Biotène PBF (BIO) lub Listerine Total Care (LTO) lub inną metodę leczenia do studzienek dla grup leczonych i dodaj 2,5 ml sterylnej ultraczystej wody do studzienki grupy kontrolnej. Zanurz próbki na 60 sekund, zgodnie z instrukcjami producenta, mieszając płytki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min. Natychmiast zassaj zarówno płyn do płukania jamy ustnej, jak i ultraczystą wodę ze studzienek.
3. Myć próbki 5 razy przez 15 sekund na mycie sterylną ultraczystą wodą na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min, zasysając wodę po każdym etapie mycia.
4. Zamiast powyższych kroków, inne środki przeciwbakteryjne mogą być testowane przy użyciu ustalonych protokołów.

5. Barwienie

1. Przygotować rozcieńczenia barwników do analizy biofilmu.
   1. Przygotować roztwór podstawowy 5 mg/ml koniugatu (AF) Concanavalin A, Alexa Fluor 647 w 0,1 M wodorowęglanie sodu o pH 8,3. Przechowywać w temperaturze -20 °C w jednorazowych porcjach przez kilka miesięcy, ponieważ odradza się zamrażanie i rozmrażanie. Używając tego roztworu podstawowego AF, przygotować rozcieńczenie 250 μg/ml w buforze TC.
   2. Przygotować rozcieńczenie 10 μM, używając 5 mM roztworu podstawowego (SY), dostarczonego przez producenta, w buforze TC. Pozostały roztwór podstawowy SY należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
   3. Przygotować 10-krotne rozcieńczenie, używając 5 000-krotnego roztworu podstawowego (SR) Sypro Red, dostarczonego przez producenta, w sterylnej wodzie ultraczystej. Pozostały roztwór podstawowy SR przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
2. Umyj wszystkie biofilmy 2x buforem TC (2,5 ml/dołek) za pomocą ręcznych ruchów wirowych, pozwalając, aby drugie płukanie pozostało na płytce przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aspirować.
3. Umieść kroplę 50 μl barwnika AF na każdej próbce biofilmu. Bejcować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Przemyć 2x buforem TC (2,5 ml/studzienkę), zasysając po każdym myciu.
4. Następnie nanieść 50 μl kropli barwnika SY na każdą próbkę biofilmu. Bejcować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Umyć 2x sterylną ultraczystą wodą (2,5 ml/studzienkę), zasysając po każdym myciu
5. Na koniec umieść kroplę 50 μl barwnika SR na każdej próbce biofilmu. Bejcować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Przemyć 3x sterylną ultraczystą wodą (2,5 ml/studzienkę), zasysając po każdym myciu.
6. Przenieś próbki na płytkę 6-dołkową, umieszczając jedną próbkę na studzienkę w 6 ml sterylnej ultraczystej wody, aby ułatwić mikroskopię konfokalną.

6. Obrazowanie za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

1. Uzyskać obrazy każdego składnika (barwnika) w biofilmach grupy poddanej działaniu środka i grupy kontrolnej za pomocą ustawień konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego pokazanych w Tabeli 1. W tym badaniu zastosowano obiektyw do zmniejszania 63x z aperturą numeryczną 0,9, który ma odległość roboczą 2,2 mm.
   
   Tabela 1. Ustawienia konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.

2. Ustaw rozmiar skanu na 250 μm x 250 μm i minimalną rozdzielczość pikseli 512 x 512, aby uzyskać obrazy CLSM w rozdzielczości odpowiedniej do analizy ilościowej.
3. Użyj barwienia SY, aby ustawić górny i dolny punkt stosu obrazu biofilmu, a następnie ustaw krok Z tak, aby był odpowiedni do analizy ilościowej (0,6 μm dla tego badania). Przed pobraniem skanu należy zoptymalizować parametry obrazu i barwienia (tj. napięcie PMT i offset) za pomocą opcji QLUT. Tabela przeglądowa kolorów została wykorzystana do przypisania pseudokolorów do każdej plamy (zielony dla SY, czerwony dla SR i niebieski dla AF), aby każdy składnik biofilmu był bardziej rozpoznawalny w rekonstrukcji 3D.
4. Zbieraj obrazy CLSM z częstotliwością odświeżania 400 Hz, korzystając ze skanowania sekwencyjnego w trybie "między stosami", aby zoptymalizować przechwytywanie obrazów wielu plam w tym samym biofilmie.

7. Analiza strukturalna biofilmu

1. Przeanalizuj obrazy CLSM zebrane za pomocą oprogramowania do analizy obrazów biofilmów. Poniższe kroki opisują użycie oprogramowania ISA3D¹² do obliczenia parametrów strukturalnych zebranych obrazów biofilmu.
   1. Skopiuj pliki obrazów CLSM dla każdego biofilmu do folderu Images, zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania. Upewnij się, że przestrzegana jest konwencja nazewnictwa plików CLSM wymagana przez oprogramowanie. Oprogramowanie umożliwia analizę plików w podfolderach w trybie wsadowym, ułatwiając w ten sposób analizę biofilmów grupy poddanej działaniu substancji i grupy kontrolnej w tym samym przebiegu.
   2. Wprowadź wymiary osi x, y i z obrazów CLSM w polach dxy i dz głównego okna dialogowego. Wybierz ustawienia mapowania progów i odległości, zgodnie z opisem w instrukcji oprogramowania (w tym badaniu użyto odpowiednio Otsu i Quasi-Euclidean). Wprowadź odpowiednią nazwę pliku wyników, a następnie uruchom program. Plik z wynikami zostanie utworzony w folderze ISA.
   3. Wyświetl plik z wynikami, aby uzyskać wartości dla dwudziestu parametrów strukturalnych 3D¹², takich jak bioobjętość i średnia grubość biofilmu (zmierzona w tym badaniu), które określają ilościowo rozkład 3D każdego składnika (barwnika) w biofilmie.

8. Wizualizacja struktury biofilmu

1. Stwórz rekonstrukcję nałożonych składników (plam) w każdym biofilmie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Poniższe kroki opisują użycie oprogramowania Volocity do tworzenia rekonstrukcji 3D.
   1. Utwórz bibliotekę dla każdego biofilmu, kopiując pliki obrazów CLSM do oprogramowania, zgodnie z opisem w instrukcji.
   2. Użyj opcji menu Renderer 3D, aby utworzyć zrekonstruowany obraz 3D z obrazów CLSM każdego biofilmu (w tym badaniu użyto formatu HR Opacity).
   3. Obróć obraz 3D, aby zorientować wszystkie biofilmy w podobny sposób w odniesieniu do osi współrzędnych x, y i z. Zrób migawkę prawidłowo zorientowanej rekonstrukcji biofilmu, a następnie wyeksportuj migawkę w formacie TIFF, JPEG lub innym odpowiednim formacie.
2. Wykonaj analizę wizualną jednoczesnego rozkładu EPS, białek i składników kwasów nukleinowych w biofilmach na zrekonstruowanych obrazach.
3. Użyj współczynnika korelacji Pearsona i współczynnika nakładania się Mandersa, aby przeprowadzić analizę kolokalizacji wielu składników biofilmu (kolokalizacja nie została zmierzona w tym badaniu).

9. Analiza statystyczna

1. Użyj oddzielnych analiz statystycznych modeli mieszanych, aby porównać średnie wartości parametrów strukturalnych między płynem do płukania jamy ustnej a grupą kontrolną (α=0,05). Na potrzeby tego badania wykorzystano oprogramowanie SAS do przeprowadzenia analizy statystycznej.

Results

Reprezentatywne wyniki dla zabiegów (płyny do płukania jamy ustnej) i nieleczonej grupy kontrolnej są pokazane w Tabeli 2 oraz na Rysunkach 1 i 2. Tabela 2 przedstawia średnie i odchylenia standardowe parametrów strukturalnych biofilmu bioobjętość (^{μm 3}) i średnią grubość biofilmu (μm), które zostały obliczone za pomocą oprogramowania ISA3D. Parametry strukturalne biofilmów poddanych działaniu płynu do płukania jamy ustnej, które różniły się istotnie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej (p<0,05), mają wartości średniej i odchylenia standardowego zaznaczone na czerwono. Wyniki analiz statystycznych modeli mieszanych wykazały, że płyn do płukania jamy ustnej BIO wytwarzał struktury biofilmu, które różniły się znacznie od kontrolnego (p<0,05) na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy płyn do płukania jamy ustnej LTO nie powodował istotnych różnic (p>0,05) na żadnym z kompozytów żywicznych. Wyniki wyraźnie pokazują, że składniki biofilmu komórkowego i zewnątrzkomórkowego pozostałe po dwóch zabiegach płukania jamy ustnej różniły się. Należy również zauważyć, że biofilmy S. mutans wyhodowane na dwóch podłożach (PF i TP) różniły się strukturą 3D, mimo że były uprawiane w podobnych warunkach i oba podłoża były polerowane podobnymi materiałami ściernymi.

Równoczesny rozkład EPS, białek i kwasów nukleinowych w biofilmach można zobrazować za pomocą rekonstrukcji 3D wygenerowanych za pomocą oprogramowania Volocity. Rysunki 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne rekonstrukcje biofilmów grupy kontrolnej hodowanych odpowiednio na kompozytach żywicznych PF i TP. Niebieska plama reprezentuje EPS w biofilmach S. mutans, zielona plama pokazuje kwasy nukleinowe, a czerwona plama pokazuje białka. Przestrzeń pomiędzy nimi może być zajęta przez wodę lub inne nieznakowane fluorescencyjnie składniki biofilmu.

Rysunek 1. Reprezentatywna rekonstrukcja 3D biofilmu S. mutans wyhodowanego na kompozycie żywicy PF w grupie kontrolnej (nieleczonej płynem do płukania jamy ustnej). Jednoczesne nakładanie trzech barwników w obrębie jednego biofilmu pozwala na jednoczesną wizualizację składników EPS (niebieskie barwienie), kwasu nukleinowego (zielone barwienie) i białka (czerwone barwienie) w biofilmach S. mutans. (1 jednostka = 24 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Reprezentatywna rekonstrukcja 3D biofilmu S. mutans wyhodowanego na kompozycie z żywicy TP w grupie kontrolnej (nieleczonej płynem do płukania jamy ustnej). Jednoczesne nakładanie trzech barwników w obrębie jednego biofilmu pozwala na jednoczesną wizualizację składników EPS (niebieskie barwienie), kwasu nukleinowego (zielone barwienie) i białka (czerwone barwienie) w biofilmach S. mutans. (1 jednostka = 24 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Kompozyt żywiczny Punkt 4 TPH3 Płukania jamy ustnej składnik BV (^{μm 3}) MT (μm) BV (^{μm 3}) MT (μm) Biotène PBF Kwasy nukleinowe 279 517±53 291 godz. 9.32±2.80 195 033±42 014 godz. 7.45±3.70 Eps 344 902±56 386 35.22±17.19 197 840±62 351 9.83±7.26 białka 298 796±62 868 54.21±21.65 216 033±66 654 godz. 24.33±39.64 Listerine Total Care Kwasy nukleinowe 355 707±110 444 godz. 26.45±14.21 273 296±47 323 godz. 13.43±2.89 Eps 494 099±180 592 osób 64,90± 26,68 329 150±47 145 34.35±30.32 białka 348 416±161 316 58.68±47.28 303 150±54 705 34.18±41.46 Kontrola (nieleczona) Kwasy nukleinowe 388 375±42 152 51.15±40.66 327 809±39 400 godz. 17.08±1.65 Eps 660 448±173 197 91.37±74.84 363 850±67 612 godz. 28.33± godz. 15.07 białka 517 274±119 475 osób 127,96±73,84 353 161±56 518 godz. 21.17±4.41

Tabela 2. Średnie i wartości odchylenia standardowego objętości biologicznej (BV) i średniej grubości biofilmu (MT) biofilmów poddanych działaniu BIO lub LTO lub niepoddanych działaniu substancji (grupa kontrolna). Parametry strukturalne biofilmów poddanych działaniu płynów do płukania jamy ustnej, które różniły się istotnie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej (p<0,05), mają wartości średniej i odchylenia standardowego zaznaczone na czerwono.

Discussion

Akwizycja obrazów CLSM musi być przeprowadzona w sposób i formacie niezbędnym do ilościowego oznaczania biofilmów i analizy kolokalizacji, tak aby rozkład intensywności sygnału w każdym obrazie był wiarygodnym odwzorowaniem rozkładu każdego fluorochromu w stosie biofilmu. Natężenie sygnału powinno być możliwe do odróżnienia od szumu i tła^10,11, niewrażliwe na autofluorescencję z podłoża i charakteryzujące się minimalnym przebijaniem z powodu zakłóceń widmowych między zastosowanymi fluorochromami¹¹. Szum jest nieuniknionym ograniczeniem mikroskopii fluorescencyjnej¹¹, a jakość obrazu może być czasami ograniczona z przyczyn technicznych lub logistycznych. Identyfikacja fluorochromów z minimalnym nakładaniem się widma ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metody, ale może być skomplikowana. Ponadto kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Dlatego nie jest zaskakujące, że bardzo niewiele badań z powodzeniem określiło ilościowo jednoczesny rozkład więcej niż dwóch składników w strukturach biofilmów.

Celem tego badania było przedstawienie metodologii składającej się z odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów kwantyfikacji i porównania jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Opisany test wzrostu biofilmu pozwala na wzrost biofilmu na odpowiednich podłożach i wytwarza struktury biofilmu, które są powtarzalne, jak wykazano w wynikach przedstawionych w tabeli 1. Połączenie nowatorskiego jednoczesnego barwienia EPS, białek i składników kwasów nukleinowych z pomiarem parametrów strukturalnych 3D biofilmu skutkuje ilościowym rozkładem składników w biofilmach. Jakościowa analiza wizualna jednoczesnego rozmieszczenia EPS, białek i kwasów nukleinowych w biofilmach jest możliwa dzięki rekonstrukcji nałożonych na siebie barwników w obrębie każdego biofilmu. Oprogramowanie ISA3D¹² zawiera kilka unikalnych parametrów strukturalnych, takich jak wymiar fraktalny, jednorodność i współczynnik chropowatości biofilmu, a także tradycyjnie mierzone parametry, takie jak porowatość i grubość biofilmu, w celu zwiększenia ilościowej identyfikacji struktur 3D biofilmów. Analiza statystyczna parametrów strukturalnych biofilmu ułatwia odpowiednie porównania biofilmów w określonych warunkach doświadczalnych, takich jak skuteczność przeciwbakteryjna/przeciwporostowa (np. po leczeniu płynami do płukania jamy ustnej) lub w czasie (skutki czasowe).

Metodologia ta pozwoliła skutecznie i skutecznie określić ilościowo i porównać równoczesne rozkłady 3D trzech głównych składników w biofilmach S. mutans , które były hodowane na odpowiednich podłożach, pokonując w ten sposób dwa wyzwania związane z jednoczesną oceną składników biofilmu. Metoda ta może być również wykorzystana do określenia skuteczności zabiegów przeciwbakteryjnych lub przeciwporostowych przeciwko wielu składnikom biofilmu, jak wykazano przy użyciu płynów do płukania jamy ustnej w tym badaniu. Co więcej, większość opisanych powyżej protokołów można zastąpić protokołami wytwarzania odpowiednich substratów i testów wzrostu biofilmu odpowiednich mikroorganizmów. W związku z tym metoda ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ ułatwia porównywanie struktur/architektury 3D biofilmów in vitro i in vivo w różnych dyscyplinach, w tym w naukach medycznych, dentystycznych, geologicznych i morskich.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Bulion	Becton, Dickinson and Company	249240
Ekstrakt drożdżowy, granulowany	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto Tryptone	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Sacharoza	EMD Millipore	8510
Chlorek potasu, odczynnik ACS, 99,0-100,5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Fosforan potasu, jednozasadowy, ≥ 99.0%, Odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Fosforan sodu, Monozasadowy, Monohydrat	EMD Millipore	SX0710-1
Tris(hydroksymetylo)aminometan, 99.8+%, Odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Sprzężony	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 lub S6653
Biotè z PBF Płukanie jamy ustnej	GlaxoSmithKline	N/A Listerine
Total Care	McNeil-PPC, Inc.	N/a