Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Podsumowanie

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Streszczenie

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest potężnym narzędziem do badania biofilmów. Bardzo niewiele badań udało się określić ilościowo jednoczesny rozkład więcej niż dwóch składników w biofilmach, ponieważ: 1) wybór barwników fluorescencyjnych o minimalnym nakładaniu się widmowym jest skomplikowany, a 2) kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Cele: Opracowanie metodyki ilościowego określania i porównywania jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech komórkowych/zewnątrzkomórkowych składników biofilmów hodowanych na odpowiednich podłożach. Metody: Metoda składa się z odrębnych, powiązanych ze sobą etapów obejmujących wzrost biofilmu, barwienie, obrazowanie CLSM, analizę i wizualizację strukturalną biofilmu oraz analizę statystyczną parametrów strukturalnych. Biofilmy Streptococcus mutans (szczep UA159) hodowano przez 48 godzin na sterylnych próbkach kompozytów żywicznych Point 4 i TPH³. Próbki zanurzono następnie na 60 sekund w płynach do płukania jamy ustnej Biotène PBF (BIO) lub Listerine Total Care (LTO) lub w wodzie (grupa kontrolna; n=5/grupa). Biofilmy barwiono fluorochromami dla zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, białek i kwasów nukleinowych przed obrazowaniem za pomocą CLSM. Parametry strukturalne biofilmu obliczone za pomocą oprogramowania do analizy obrazu ISA3D obejmowały bioobjętość i średnią grubość biofilmu. W analizach statystycznych modeli mieszanych porównano parametry strukturalne między grupą płynu do płukania jamy ustnej a grupą kontrolną (oprogramowanie SAS; α=0,05). Oprogramowanie Volocity umożliwiło wizualizację rozkładu 3D nałożonych składników biofilmu (fluorochromów). Wyniki: Płyn do płukania jamy ustnej BIO wytwarzał struktury biofilmu, które znacznie różniły się od kontrolnego (p<0,05) na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy LTO nie powodowało różnic (p>0,05) na żadnym z produktów. Wnioski: Metodologia ta pozwoliła na skuteczne i skuteczne określenie ilościowe i porównanie jednoczesnych rozkładów 3D trzech głównych składników w biofilmach S. mutans na odpowiednich podłożach, pokonując w ten sposób dwa wyzwania związane z jednoczesną oceną składników biofilmu. Metoda ta może być również stosowana do określenia skuteczności środków przeciwbakteryjnych/przeciwporostowych przeciwko wielu składnikom biofilmu, jak wykazano przy użyciu płynów do płukania jamy ustnej. Ponadto metoda ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ ułatwia porównywanie struktur/architektury 3D biofilmów w różnych dyscyplinach.

Wprowadzenie

Biofilmy to ustrukturyzowane społeczności mikroorganizmów, które są zamknięte w samodzielnie wyprodukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej i są przyczepione do powierzchni biologicznych lub obojętnych¹. Biofilmy reprezentują powszechny styl życia wielu bakterii i tworzą się etapami od swobodnie pływających (planktonowych) komórek do złożonych społeczności wielogatunkowych. Wrodzona oporność biofilmów na środki przeciwdrobnoustrojowe jest przyczyną wielu uporczywych i przewlekłych zakażeń bakteryjnych^1,2, czego dowodem są biofilmy jamy ustnej (płytka nazębna). Mikroorganizmy próchnicotwórcze, takie jak paciorkowce mutans, przetwarzają sacharozę i inne węglowodany w celu wytworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej i wytworzenia kwasów, które mogą demineralizować strukturę zębów i powodować próchnicę. Większość matryc biofilmu to biopolimery składające się ze składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych, takich jak egzopolisacharydy (EPS), białka i kwasy nukleinowe^3,4.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM), najczęściej stosowana technika obrazowania fluorescencyjnego, radykalnie zmieniła obrazowanie optyczne w biologii, ponieważ ma możliwość zbierania obrazów 3D uwodnionych struktur biologicznych bez fiksacji^5,6,7. Ta nieniszcząca technika polega na zbieraniu obrazów cienkich odcinków w obszarze zainteresowania próbki w taki sposób, aby usunąć wpływ nieostrego światła. Jakość i rozdzielczość obrazów rejestrowanych przez CLSM wykracza poza to, co można osiągnąć przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jedną z głównych wad CLSM jest to, że skanowanie obrazów odbywa się wolniej niż w przypadku technik mikroskopii szerokokątnej, w których całe obrazy są zbierane jednocześnie5^. Jednak wraz z coraz szerszym wyborem fluorochromów, laserów i filtrów, CLSM stał się jedną z dominujących technik obrazowania wielospektralnego^5,7.

Poprzednie badania wykazały, że CLSM jest użytecznym narzędziem do badania struktury lub architektury biofilmów za pomocą jednego lub dwóch znaczników fluorescencyjnych lub barwników, aby zapewnić lepsze zrozumienie rozmieszczenia EPS i komórek w biofilmach, a zwłaszcza w macierzy zewnątrzkomórkowej^7,8. Teoretycznie barwienie/znakowanie fluorescencyjne wielu składników jest pożądane w celu zbadania szczegółowej struktury i kolokalizacji składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Jednak jednoczesna analiza różnych składników w biofilmach może być trudna, ponieważ: 1) wybór barwników fluorescencyjnych o minimalnym nakładaniu się widmowym jest skomplikowany oraz 2) kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Kolokalizacja przy użyciu wielu fluorochromów wymaga użycia wysoce specyficznych barwników z minimalną interferencją spektralną, aby uniknąć efektów przebijania, które występują, gdy dwa fluorochromy znacznie nakładają się na siebie w swoim piku widmowym, powodując, że jeden jest silniej wzbudzony niż drugi⁹. Idealnie, fluorochromy o widmach wzbudzenia, które nie nakładają się na siebie, zapewniłyby najlepsze wyniki, jednak bardzo trudno jest znaleźć plamy spełniające to kryterium. Zamiast tego wybór plam jest optymalizowany poprzez wybór fluorochromów, których widma emisyjne w minimalnym stopniu się pokrywają, co pozwala na oglądanie plam jeden po drugim w ograniczonym paśmie długości fali^{obserwacyjnej 9}.

Nakładanie obrazów fluorescencyjnych jest prawdopodobnie najczęściej używaną metodą oceny jednoczesnego rozkładu fluorochromów. Kolokalizacja różnych składników objawia się nakładaniem się różnych kolorów przez wiele kanałów utworzonych przez badane fluorochromy¹⁰. Narzędzia do wyświetlania wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych jako scalonych obrazów kolorowych są dostępne w większości programów CLSM i do analizy obrazów biologicznych. Chociaż nakładanie obrazów jest przydatne do przestrzennej oceny kolokalizacji, obrazy mogą być badane jakościowo tylko za pomocą analizy wizualnej. Dostarcza to ograniczonej ilości informacji, ponieważ te reprezentacje na ogół nie są pomocne w ilościowym określaniu kolokalizacji w różnych warunkach eksperymentalnych, ani nie określają, czy kolokalizacja wykracza poza przypadkową koincydencję¹¹. W bardzo niewielu dotychczasowych badaniach wykorzystano metody ilościowe do analizy trójwymiarowej struktury biofilmów i składników biofilmu, a jeszcze mniej określiło ilościowo wpływ zabiegów przeciwbakteryjnych lub środków przeciwporostowych na składniki biofilmu.

Celem tego badania było przedstawienie metodologii kwantyfikacji i porównania jednoczesnych 3-wymiarowych rozkładów trzech komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów. Metoda składa się z odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów, obejmujących wzrost biofilmu, barwienie, obrazowanie CLSM biofilmów, analizę strukturalną i wizualizację biofilmu oraz analizę statystyczną parametrów strukturalnych. Test wzrostu biofilmu pozwala na wzrost biofilmu na odpowiednich podłożach i wytwarza struktury biofilmu, które są powtarzalne. Połączenie nowatorskiego jednoczesnego barwienia EPS, białek i składników kwasów nukleinowych z pomiarem parametrów strukturalnych 3D biofilmu skutkuje ilościowym rozkładem składników w biofilmach. Analiza statystyczna parametrów strukturalnych biofilmu ułatwia ocenę biofilmów w określonych warunkach doświadczalnych (np. po leczeniu płynami do płukania jamy ustnej), co zostanie opisane w następnym rozdziale.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i odczynników

1. Przygotować 300 ml pożywki do hodowli nocnej (THY; 3% bulion Todd Hewitt przygotowany zgodnie z instrukcją producenta, uzupełniony o 0,3% ekstraktu drożdżowego w wodzie ultrapurej) i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.
2. Przygotować 1 L agaru THY (3% bulion Todd Hewitt, 0,3% ekstraktu drożdżowego oraz 1,5% agaru w wodzie ultrapurej), wysterylizować w autoklawie i schłodzić do 60 °C przed rozlaniem do szalek Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
3. Przygotować 150 ml pożywki do wzrostu biofilmu (0,5X TY uzupełnione o 10 mM sacharozy; 1,5% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego i 10 mM sacharozy w wodzie ultrapurej) i wysterylizować za pomocą filtracji. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
4. Przygotować 1 L soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ oraz 0,24 g KH₂PO₄ w wodzie ultrapurej) i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
5. Przygotować 600 ml 10 mM buforu Tris HCl uzupełnionego o 10 mM CaCl₂ w wodzie ultrapurej (bufor TC; pH 7,2) i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
6. Wysterylizować w autoklawie 1 L wody ultrapurej. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

2. Przygotowanie próbek

1. Wykonaj dyskowate próbki kompozytów dentystycznych Point 4 (PF) oraz TPH³ (TP) w dedykowanej formie ze stali nierdzewnej, nakładając materiał w dwóch warstwach. Każdą warstwę utwardzaj światłem przez 40 sec za pomocą polimeryzatora LED. Oba produkty mają nieco inny skład i poziom napełnienia, co skutkuje powstaniem różnych topografii powierzchni, na których będą hodowane biofilmy.
   1. Zamiast kroku 2.1 można wykonać próbki odpowiednich podłoży zgodnie z uznanymi protokołami z innych dyscyplin.
2. Wykończ i wypoleruj próbki do uzyskania akceptowalnej końcowej gładkości powierzchni, np. używając półautomatycznej polerki szlifierskiej. Opłucz wypolerowane próbki wodą ultrapure i osusz sprężonym powietrzem.
3. Zesterylizuj próbki za pomocą tlenku etylenu lub alternatywnej metody sterylizacji.

3. Wzrost biofilmu

1. Zaszczep pojedynczą kolonię S. mutans do 4 ml podłoża hodowlanego do inkubacji nocnej (krok 1.1). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przez 16-18 hr. Gęstość optyczna (OD₆₀₀) kultury powinna wynosić ≥0.9.
   1. Zaleca się użycie kolonii z kultur na płytkach, które zostały przepaszowane 2x z oryginalnego banku, ponieważ zapewnia to bardziej spójny wzrost biofilmu.
2. Przygotować rozcieńczenie 1:100, używając kultury z inkubacji nocnej (krok 1.1) w 10 ml podłoża do wzrostu biofilmu (krok 1.3).
3. Przenieść sterylne próbki kompozytu żywicznego (np. PF, TP) do sterylnych płytek 12-dołkowych.
4. Dodać 2.5 ml rozcieńczonego podłoża hodowlanego (krok 3.2) do dołków dla grup badawczych (płyn do płukania jamy ustnej) i kontrolnych. Do dołków kontroli sterylności dodać 2.5 ml sterylnego, niezaszczepionego podłoża do wzrostu biofilmu.
5. Hodować biofilmy w warunkach mikroaerofilnych. Umieścić płytki na wytrząsarce przy 100 rpm w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 24 hr.
6. Po 24 hr aseptycznie odessać podłoże ze wszystkich dołków i przemyć dwukrotnie sterylnym PBS (krok 1.4; 2.5 ml/dołek), odsysając PBS po każdym przemyciu. Dodać 2.5 ml świeżego podłoża do wzrostu biofilmu do każdego dołka i inkubować przez kolejne 24 hr w tych samych warunkach co w poprzednim kroku, aby całkowity czas wzrostu biofilmu wyniósł 48 hr.
7. Zamiast powyższych kroków, biofilmy innych gatunków można hodować na podłożach zgodnie z uznanymi protokołami.

4. Zabiegi antybakteryjne/płukanki do ust

1. Odessać pożywkę po zakończeniu wzrostu biofilmu.
2. Do dołków grup traktowanych dodać 2,5 ml płynu do płukania jamy ustnej Biotène PBF (BIO) lub Listerine Total Care (LTO), bądź zastosować inną metodę terapii, a do dołka grupy kontrolnej dodać 2,5 ml sterylnej wody ultrapure. Zanurzyć próbki na 60 s, zgodnie z instrukcjami producenta, wytrząsając płytki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 rpm. Natychmiast odessać zarówno płyn do płukania jamy ustnej, jak i wodę ultrapure z dołków.
3. Przemyć próbki 5-krotnie przez 15 s podczas każdego płukania sterylną wodą ultrapure na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 rpm, odsysając wodę po każdym etapie mycia.
4. Zamiast powyższych kroków można przetestować inne środki przeciwbakteryjne, korzystając z uznanych protokołów.

5. Barwienie

1. Przygotuj rozcieńczenia barwników do analizy biofilmu.
   1. Przygotuj roztwór zapasowy Concanavalin A, koniugatu Alexa Fluor 647 (AF) o stężeniu 5 mg/ml w 0,1 M wodorowęglanie sodu pH 8,3. Przechowuj w temperaturze -20 °C w jednorazowych alikwotach przez kilka miesięcy, ponieważ odradza się zamrażanie i rozmrażanie. Z tego roztworu zapasowego AF przygotuj rozcieńczenie 250 μg/ml w buforze TC.
   2. Przygotuj rozcieńczenie 10 μM, wykorzystując dostarczony przez producenta roztwór zapasowy Syto 9 (SY) o stężeniu 5 mM, w buforze TC. Pozostały roztwór zapasowy SY przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
   3. Przygotuj rozcieńczenie 10x, wykorzystując dostarczony przez producenta roztwór zapasowy Sypro Red (SR) o stężeniu 5,000x, w sterylnej wodzie ultrapure. Pozostały roztwór zapasowy SR przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
2. Przemyj wszystkie biofilmy 2x buforem TC (2,5 ml/dołek), delikatnie kołysząc płytką; drugą porcję buforu pozostaw w płytce na 30 min w temperaturze pokojowej. Odessij płyn.
3. Nanieś kroplę 50 μl barwnika AF na każdy preparat biofilmu. Barw przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj 2x buforem TC (2,5 ml/dołek), odsysając płyn po każdym płukaniu.
4. Następnie nanieś kroplę 50 μl barwnika SY na każdy preparat biofilmu. Barw przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj 2x sterylną wodą ultrapure (2,5 ml/dołek), odsysając płyn po każdym płukaniu.
5. Na koniec nanieś kroplę 50 μl barwnika SR na każdy preparat biofilmu. Barw przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przemyj 3x sterylną wodą ultrapure (2,5 ml/dołek), odsysając płyn po każdym płukaniu.
6. Przenieś preparaty do płytki 6-dołkowej, umieszczając jeden preparat na dołek w 6 ml sterylnej wody ultrapure w celu ułatwienia mikroskopii konfokalnej.

6. Obrazowanie z wykorzystaniem konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

1. Należy pozyskać obrazy każdego komponentu (barwienia) w obrębie biofilmów grup badawczej i kontrolnej, korzystając z ustawień konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego przedstawionych w Tabeli 1. W niniejszym badaniu wykorzystano obiektyw imersyjny 63X z aperturą numeryczną 0,9 i odległością roboczą 2,2 mm.
   
   Tabela 1. Ustawienia konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

2. Ustaw rozmiar skanowania na 250 μm x 250 μm oraz minimalną rozdzielczość pikseli na 512 x 512, aby pozyskać obrazy CLSM w rozdzielczości odpowiedniej do analizy ilościowej.
3. Użyj barwnika SY do wyznaczenia górnego i dolnego punktu stosu obrazów biofilmu, a następnie ustaw krok z (z-step) odpowiedni do analizy ilościowej (0,6 μm w niniejszym badaniu). Przed rozpoczęciem skanowania zoptymalizuj parametry obrazu i barwienia (i.e. napięcie PMT i offset) za pomocą opcji QLUT. Użyto tablicy kolorów (look-up table), aby przypisać pseudokolory do każdego barwnika (zielony dla SY, czerwony dla SR i niebieski dla AF), w celu zwiększenia rozróżnialności poszczególnych komponentów biofilmu w rekonstrukcji 3D.
4. Pozyskaj obrazy CLSM przy częstotliwości 400 Hz, stosując skanowanie sekwencyjne w trybie „between stacks”, aby zoptymalizować rejestrację obrazów wielu barwników w obrębie tego samego biofilmu.

7. Analiza strukturalna biofilmu

1. Przeanalizuj obrazy CLSM za pomocą oprogramowania do analizy obrazów biofilmu. Poniższe kroki opisują zastosowanie oprogramowania ISA3D¹² w celu obliczenia parametrów strukturalnych zebranych obrazów biofilmu.
   1. Skopiuj pliki obrazów CLSM dla każdego biofilmu do folderu Images, zgodnie z instrukcją oprogramowania. Upewnij się, że stosowana jest konwencja nazewnictwa plików CLSM wymagana przez program. Oprogramowanie umożliwia analizę plików w podfolderach w trybie wsadowym, co ułatwia analizę biofilmów z grup badawczych i kontrolnych w jednym przebiegu.
   2. Wprowadź wymiary osi x, y i z obrazów CLSM w polach dxy oraz dz głównego okna dialogowego. Wybierz ustawienia progu (threshold) i mapowania odległości zgodnie z opisem w instrukcji oprogramowania (w niniejszym badaniu zastosowano odpowiednio metodę Otsu oraz Quasi-Euclidean). Wprowadź odpowiednią nazwę pliku wyników, a następnie uruchom program. W folderze ISA zostanie utworzony plik z wynikami.
   3. Przejrzyj plik wyników, aby uzyskać wartości dla dwudziestu parametrów strukturalnych 3D¹², takich jak biovolume oraz średnia grubość biofilmu (zmierzona w niniejszym badaniu), które kwantyfikują rozkład 3D każdego składnika (barwnika) w obrębie biofilmu.

8. Wizualizacja struktury biofilmu

1. Utworzyć rekonstrukcję nałożonych na siebie komponentów (barwień) w obrębie każdego biofilmu przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Poniższe kroki opisują wykorzystanie oprogramowania Volocity do tworzenia rekonstrukcji 3D.
   1. Utworzyć bibliotekę dla każdego biofilmu poprzez skopiowanie plików obrazów CLSM do oprogramowania, zgodnie z opisem w instrukcji.
   2. Użyć opcji menu 3D Renderer w celu wygenerowania zrekonstruowanego obrazu 3D z obrazów CLSM każdego biofilmu (w niniejszym badaniu zastosowano format HR Opacity).
   3. Obrócić obraz 3D tak, aby zorientować wszystkie biofilmy w podobny sposób względem osi współrzędnych x, y i z. Wykonać migawkę poprawnie zorientowanej rekonstrukcji biofilmu, a następnie wyeksportować migawkę w formacie TIFF, JPEG lub innym odpowiednim formacie.
2. Przeprowadzić analizę wizualną współwystępowania EPS, białek i komponentów kwasów nukleinowych w obrębie biofilmów na zrekonstruowanych obrazach.
3. Użyć współczynnika korelacji Pearsona oraz współczynnika nakładania Mandersa do przeprowadzenia analizy kolokalizacji wielu komponentów biofilmu (w niniejszym badaniu kolokalizacja nie była mierzona).

9. Analiza statystyczna

1. Wykorzystaj oddzielne analizy statystyczne z zastosowaniem modeli mieszanych w celu porównania średnich wartości parametrów strukturalnych między grupą płukanki do ust a grupą kontrolną (α=0.05). W niniejszym badaniu do przeprowadzenia analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SAS.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki dla grup traktowanych (płukanki do ust) oraz grupy kontrolnej nietraktowanej przedstawiono w Tabeli 2 oraz na Rysunkach 1 i 2. Tabela 2 prezentuje wartości średnie i odchylenia standardowe parametrów strukturalnych biofilmu: biovolume (μm³) oraz średniej grubości biofilmu (μm), które obliczono za pomocą oprogramowania ISA3D. Parametry strukturalne biofilmów traktowanych płukanką do ust, które różniły się istotnie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej (p<0.05), mają wartości średnie i odchylenia standardowe wyróżnione kolorem czerwonym. Wyniki statystycznych analiz modeli mieszanych wykazały, że płukanka BIO spowodowała powstanie struktur biofilmu, które różniły się istotnie od kontroli (p<0.05) na obu kompozytach żywicznych, podczas gdy płukanka LTO nie spowodowała istotnych różnic (p>0.05) na żadnym z kompozytów żywicznych. Wyniki wyraźnie pokazują, że pozostałe po zastosowaniu dwóch rodzajów płukanek do ust komponenty komórkowe i zewnątrzkomórkowe biofilmu różniły się od siebie. Należy również zauważyć, że biofilmy S. mutans hodowane na dwóch podłożach (PF i TP) różniły się strukturą 3D, mimo że były hodowane w podobnych warunkach, a oba podłoża zostały wypolerowane podobnymi materiałami ściernymi.

Równoczesny rozkład EPS, białek i kwasów nukleinowych w obrębie biofilmów można zwizualizować za pomocą rekonstrukcji 3D wygenerowanych w oprogramowaniu Volocity. Ryciny 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne rekonstrukcje biofilmów grupy kontrolnej hodowanych odpowiednio na kompozytach żywicznych PF i TP. Niebieskie barwienie reprezentuje EPS w biofilmach S. mutans, zielone barwienie wskazuje kwasy nukleinowe, a czerwone barwienie pokazuje białka. Przestrzeń pomiędzy nimi może być wypełniona wodą lub innymi nieoznakowanymi fluorescencyjnie komponentami biofilmów.

Rysunek 1. Reprezentatywna rekonstrukcja 3D biofilmu S. mutans wyhodowanego na kompozycie żywicznym PF w grupie kontrolnej (nieleczonej płynem do płukania jamy ustnej). Jednoczesna nakładka trzech barwień w obrębie jednego biofilmu umożliwia równoległą wizualizację składników EPS (barwienie niebieskie), kwasów nukleinowych (barwienie zielone) i białek (barwienie czerwone) w biofilmach S. mutans. (1 jednostka = 24 μm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 2. Reprezentatywna rekonstrukcja 3D biofilmu S. mutans wyhodowanego na kompozycie żywicznym TP w grupie kontrolnej (nieleczonej płynem do płukania jamy ustnej). Jednoczesna nakładka trzech barwień w obrębie jednego biofilmu umożliwia symultaniczną wizualizację komponentów EPS (barwienie niebieskie), kwasów nukleinowych (barwienie zielone) i białek (barwienie czerwone) w biofilmach S. mutans. (1 jednostka = 24 μm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Kompozyt żywiczny		Punkt 4		TPH3
Płukanka do ust	Składnik	BV (μm3)	MT (μm)	BV (μm3)	MT (μm)
Biotène PBF	Kwasy nukleinowe	279,517±53,291	9.32±2.80	195,033±42,014	7.45±3.70
	EPS	344,902±56,386	35.22±17.19	197,840±62,351	9.83±7.26
	Białka	298,796±62,868	54.21±21.65	216,033±66,654	24.33±39.64
Listerine Total Care	Kwasy nukleinowe	355,707±110,444	26.45±14.21	273,296±47,323	13.43±2.89
	EPS	494,099±180,592	64.90± 26.68	329,150±47,145	34.35±30.32
	Białka	348,416±161,316	58.68±47.28	303,150±54,705	34.18±41.46
Kontrola (nieleczona)	Kwasy nukleinowe	388,375±42,152	51.15±40.66	327,809±39,400	17.08±1.65
	EPS	660,448±173,197	91.37±74.84	363,850±67,612	28.33± 15.07
	Białka	517,274±119,475	127.96±73.84	353,161±56,518	21.17±4.41

Tabela 2. Średnie wartości i odchylenia standardowe biovolume (BV) oraz średniej grubości biofilmu (MT) dla biofilmów traktowanych BIO lub LTO, bądź pozostawionych bez obróbki (grupa kontrolna). Parametry strukturalne biofilmów traktowanych płynami do płukania jamy ustnej, które różniły się istotnie od parametrów biofilmów w grupie kontrolnej (p<0,05), mają wartości średnich i odchyleń standardowych wyróżnione na czerwono.

Dyskusja

Akwizycja obrazów CLSM musi być przeprowadzona w sposób i formacie niezbędnym do ilościowego oznaczania biofilmów i analizy kolokalizacji, tak aby rozkład intensywności sygnału w każdym obrazie był wiarygodnym odwzorowaniem rozkładu każdego fluorochromu w stosie biofilmu. Natężenie sygnału powinno być możliwe do odróżnienia od szumu i tła^10,11, niewrażliwe na autofluorescencję z podłoża i charakteryzujące się minimalnym przebijaniem z powodu zakłóceń widmowych między zastosowanymi fluorochromami¹¹. Szum jest nieuniknionym ograniczeniem mikroskopii fluorescencyjnej¹¹, a jakość obrazu może być czasami ograniczona z przyczyn technicznych lub logistycznych. Identyfikacja fluorochromów z minimalnym nakładaniem się widma ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej metody, ale może być skomplikowana. Ponadto kwantyfikacja wielu fluorochromów stanowi problem wieloczynnikowy. Dlatego nie jest zaskakujące, że bardzo niewiele badań z powodzeniem określiło ilościowo jednoczesny rozkład więcej niż dwóch składników w strukturach biofilmów.

Celem tego badania było przedstawienie metodologii składającej się z odrębnych, ale powiązanych ze sobą etapów kwantyfikacji i porównania jednoczesnych trójwymiarowych rozkładów trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Opisany test wzrostu biofilmu pozwala na wzrost biofilmu na odpowiednich podłożach i wytwarza struktury biofilmu, które są powtarzalne, jak wykazano w wynikach przedstawionych w tabeli 1. Połączenie nowatorskiego jednoczesnego barwienia EPS, białek i składników kwasów nukleinowych z pomiarem parametrów strukturalnych 3D biofilmu skutkuje ilościowym rozkładem składników w biofilmach. Jakościowa analiza wizualna jednoczesnego rozmieszczenia EPS, białek i kwasów nukleinowych w biofilmach jest możliwa dzięki rekonstrukcji nałożonych na siebie barwników w obrębie każdego biofilmu. Oprogramowanie ISA3D¹² zawiera kilka unikalnych parametrów strukturalnych, takich jak wymiar fraktalny, jednorodność i współczynnik chropowatości biofilmu, a także tradycyjnie mierzone parametry, takie jak porowatość i grubość biofilmu, w celu zwiększenia ilościowej identyfikacji struktur 3D biofilmów. Analiza statystyczna parametrów strukturalnych biofilmu ułatwia odpowiednie porównania biofilmów w określonych warunkach doświadczalnych, takich jak skuteczność przeciwbakteryjna/przeciwporostowa (np. po leczeniu płynami do płukania jamy ustnej) lub w czasie (skutki czasowe).

Metodologia ta pozwoliła skutecznie i skutecznie określić ilościowo i porównać równoczesne rozkłady 3D trzech głównych składników w biofilmach S. mutans , które były hodowane na odpowiednich podłożach, pokonując w ten sposób dwa wyzwania związane z jednoczesną oceną składników biofilmu. Metoda ta może być również wykorzystana do określenia skuteczności zabiegów przeciwbakteryjnych lub przeciwporostowych przeciwko wielu składnikom biofilmu, jak wykazano przy użyciu płynów do płukania jamy ustnej w tym badaniu. Co więcej, większość opisanych powyżej protokołów można zastąpić protokołami wytwarzania odpowiednich substratów i testów wzrostu biofilmu odpowiednich mikroorganizmów. W związku z tym metoda ta ma szerokie zastosowanie, ponieważ ułatwia porównywanie struktur/architektury 3D biofilmów in vitro i in vivo w różnych dyscyplinach, w tym w naukach medycznych, dentystycznych, geologicznych i morskich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt Bulion	Becton, Dickinson and Company	249240
Ekstrakt drożdżowy, granulowany	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto Tryptone	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Sacharoza	EMD Millipore	8510
Chlorek potasu, odczynnik ACS, 99,0-100,5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Fosforan potasu, jednozasadowy, ≥ 99.0%, Odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Fosforan sodu, Monozasadowy, Monohydrat	EMD Millipore	SX0710-1
Tris(hydroksymetylo)aminometan, 99.8+%, Odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Sprzężony	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 lub S6653
Biotè z PBF Płukanie jamy ustnej	GlaxoSmithKline	N/A Listerine
Total Care	McNeil-PPC, Inc.	N/a