Transgeniczne i nokautujące mysie modele chorób neurologicznych są przydatne do badania roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej neurofizjologii. W artykule opisano metodologie, które można wykorzystać do badania długotrwałego wzmocnienia, mechanizmu komórkowego, który może leżeć u podstaw uczenia się i pamięci, w transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modelach neuropatologii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad długoterminowym wzmocnieniem skuteczności synaptycznej, zależnego od aktywności zjawiska synaptycznego, posiadającego właściwości, które czynią je atrakcyjnym jako potencjalny mechanizm komórkowy leżący u podstaw uczenia się i przechowywania informacji, od dawna są wykorzystywane do wyjaśnienia fizjologii różnych obwodów neuronalnych w hipokampie, ciele migdałowatym i innych strukturach limbicznych i korowych. Mając to na uwadze, transgeniczne mysie modele chorób neurologicznych stanowią użyteczne platformy do prowadzenia długoterminowych badań nad wzmocnieniem (LTP) w celu lepszego zrozumienia roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej komunikacji synaptycznej w sieciach neuronowych zaangażowanych w uczenie się, emocje i przetwarzanie informacji. W tym artykule opisano metodologie niezawodnego indukowania LTP u swobodnie zachowującej się myszy. Metodologie te mogą być stosowane w badaniach transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modeli chorób neurodegeneracyjnych.
Wprowadzenie
Rozwój technologii manipulowania genami doprowadził do powstania transgenicznych i nokautujących mysich modeli prawie wszystkich chorób neurodegeneracyjnych i neurologicznych. Wymagało to przekształcenia technik badań elektrofizjologicznych stosowanych wcześniej u większych gatunków gryzoni na mysi model zwierzęcy. Jedną z takich technik badań neurofizjologicznych jest zastosowanie długotrwałego wzmocnienia (LTP) w celu zbadania skuteczności połączeń synaptycznych w sieciach neuronalnych zaangażowanych w różne zaburzenia neuropatologiczne. Protokół ten opisuje techniki wiarygodnego badania elektrofizjologicznego LTP u swobodnie zachowujących się myszy. Przewagą tego protokołu nad innymi jest to, że jest prosty i łatwy do wdrożenia; Jest również mniej kosztowny, ponieważ nie wymaga stosowania drogich sterowanych komputerowo systemów mikronapędowych ani faz czołowych tranzystorów polowych; i, według naszej wiedzy, jest to pierwszy protokół wideo przewlekłych zapisów elektrofizjologicznych do badania LTP u swobodnie zachowujących się myszy. W tym celu opisujemy w tym artykule proste metodologie badania długotrwałego wzmocnienia u swobodnie zachowujących się myszy. Metodologie te można łatwo przełożyć na transgeniczne i nokautujące mysie modele zaburzeń neuropatologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół ten jest odpowiedni dla myszy w wieku 3 i 18 miesięcy i przybliżonej masie ciała 30-50 g). Myszy można zdobyć w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wszystkie protokoły chirurgiczne i eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Trinity College i były zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie zwierząt i zabiegi chirurgiczne
- Przygotuj koktajl znieczulający zawierający ketaminę (25 mg/ml), ksylazynę (2,5 mg/ml) i acepromazynę (0,5 mg/ml). Wstrzyknąć 1 ml/kg masy ciała w prawy dolny kwadrant brzucha, uzupełniając wstrzyknięciami 0,2 ml/kg mc. co 45 minut, aby utrzymać stabilną głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału.
- Przygotuj znieczuloną mysz do operacji, goląc futro na jej czaszce za pomocą golarki elektrycznej. Ogolony obszar powinien obejmować środek oczu do środka uszu. Upewnij się, że nie golisz wąsów, ponieważ są one częścią systemu sensorycznego lufy myszy.
- Użyj bawełnianych wacików, aby nałożyć alkohol izopropylowy, a następnie Betadine na ogolony obszar na głowie. Następnie, również za pomocą wacików, nałóż niewielką ilość oleju mineralnego na oczy, aby zapobiec wysuszeniu gałek ocznych.
- Użyj nausznic dla niemowląt szczurów zamiast zwykłych nauszników, aby zamontować głowę zwierzęcia na aparacie stereotaktycznym ramowym. Aby to zrobić, najpierw zamontuj lewe ucho na lewej mankietzie. Następnie delikatnie przyłóż prawe ucho do prawego mankietu, delikatnie podpierając głowę zwierzęcia jedną ręką i przesuwając nausznik drugą ręką. Następnie umieść poduszkę grzewczą pod ciałem zwierzęcia i ustaw ją na 86 ° F, aby utrzymać temperaturę ciała.
- Następnie sprawdź obustronną sztywność, próbując przesunąć głowę na boki. Zwierzę jest prawidłowo zamontowane na ramie stereotaktycznej, gdy głowa jest sztywna i nie można jej przesuwać na boki, ale można ją łatwo obracać w górę i w dół.
- Delikatnie oprzyj pysk myszy na zespole nosa/paska zębów, upewniając się, że siekacze delikatnie, ale bezpiecznie spoczywają w otworze zęba nosa/paska zębów.
- Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej, zaczynając od środka oczu do środka uszu. Upewnij się, że skalpel jest trzymany pod kątem 45° i wywieraj wystarczający nacisk, aby przeciąć leżącą pod spodem powięź, ale nie przez czaszkę, ponieważ spowoduje to nadmierne krwawienie.
- Użyj bawełnianych wacików, aby oddzielić powięź i odsłonić czaszkę. Punkty orientacyjne czaszki, bregma i lambda, powinny być wyraźnie widoczne (ryc. 1A). Upewnij się, że zwierzę znajduje się w pozycji płaskiej czaszki, regulując nos / ząb w taki sposób, aby punkty orientacyjne bregma i lambda znajdowały się w tym samym położeniu grzbietowo-brzusznym (DV) (+ 0,1 mm).
- Nałóż niewielką ilość sterylnego soli fizjologicznej na odsłonięty obszar i za pomocą bawełnianych wacików delikatnie wyczyść czaszkę. Następnie odczekaj 2-3 minuty, aż czaszka całkowicie wyschnie na powietrzu, zanim przejdziesz dalej.
- Zamontuj igłę na lewym ramieniu stereotaktycznym, aby zmierzyć pozycję DV bregmy i lambdy. Położenie DV tych dwóch punktów orientacyjnych powinno znajdować się w odległości nie większej niż 0,1 mm od siebie. Jeśli nie, nos ramy stereotaktycznej można regulować w górę iw dół, aby to osiągnąć.
- Umieść igłę na bregmie, aby zarejestrować jej pomiary przednio-tylne (AP), boczne (LAT) i grzbietowo-brzuszne (DV). Upewnij się, że igła dotyka czaszki i nie przebija jej.
- Użyj atlasu mózgu myszy, takiego jak "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates"1, aby określić współrzędne dla struktur docelowych: przyśrodkowej ścieżki perforacyjnej (mPP) w pęczku kątowym i zakrętu zębatego (DG) hipokampa, względem odpowiednio lambda i bregma (patrz również Tabela 1). Następnie użyj cienkiego długopisu lub ołówka, aby zaznaczyć te punkty na czaszce.
- Zaznacz także dwa dodatkowe punkty po przeciwnej stronie czaszki. Punkty, które będą służyć jako masa (GND) i odniesienie (REF), powinny znajdować się około 3 mm od linii środkowej i być ustawione wzdłużnie względem siebie (rysunek 1A, również tabela 1).
- Usuń znacznik igły z lewego ramienia stereotaktycznego i zastąp go elektryczną wiertarką dentystyczną wyposażoną w uchwyt stereotaktyczny. Umieść wiertło nad każdym zaznaczonym punktem i wykonaj małe otwory w zadziorach o średnicy około 0.5 mm. Podczas wiercenia wykonuj powtarzalne ruchy góra-dół i często sprawdzaj, czy wiertło przebiło czaszkę, aby odsłonić powierzchnię mózgu.
- Delikatnie, ale stanowczo wkręć elektrodę śrubową (#0-80 1/8 cala maszynowe ze stali nierdzewnej, walcowy z rowkiem) w każdym z przeciwległych otworów (GND i REF) tak, aby dotykały tylko powierzchni kory mózgowej, nie penetrując jej (Rysunek 1A). Te dwie elektrody śrubowe służą jako uziemienie i odniesienie.
- Zamontuj elektrody stymulujące i rejestrujące w uchwytach elektrod odpowiednio na lewym i prawym ramieniu stereotaktycznym.
- Podłącz zaciski elektrod stymulujących do stymulatora elektrofizjologicznego z izolacją prądową, a zacisk elektrody rejestrującej do elektrofizjologicznego wzmacniacza różnicowego (wzmocnienie = 1 000, filtr pasmowoprzepustowy = 1 Hz–3 kHz), a następnie do oscyloskopu cyfrowego w celu wizualnej kontroli wywołanych odpowiedzi. Podłącz również zaciski elektrod GND i REF do wzmacniacza różnicowego.
- Delikatnie i powoli opuszczaj elektrody stymulujące i rejestrujące w odstępach co 0,5 mm, jednocześnie monitorując wizualnie wywołaną reakcję na wstrząs bodźcowy o natężeniu 600-800 uA. Kontynuuj opuszczanie każdej elektrody, aż osiągną odpowiednią pozycję docelową DV, a na oscyloskopie zostanie zaobserwowany stereotypowy sygnał (rysunek 1B).
- Następnie użyj dentystycznego cementu akrylowego, aby zrobić nasadkę, która utrzyma końcówki elektrod na miejscu; Cement dentystyczny, który dotknie skóry, powinien być natychmiast zetarty. Gdy cement dentystyczny zostanie całkowicie utwardzony, przenieś zwierzę z ramy stereotaktycznej do czystej klatki dla gryzoni. Użyj ogrzewania lamp lub podkładka, aby utrzymać temperaturę rdzenia.
- Monitoruj zwierzę co godzinę, aż odzyska przytomność. Wstrzyknięcie fluniksyny może być podawane jako środek przeciwbólowy.
2. Indukcja LTP
- Pozwól zwierzęciu na 5-7 dni na powrót do zdrowia po operacji. Umieść zwierzę w środowisku nagrywającym składającym się z klatki Faradaya (122 cm x 43 cm x 43 cm) wyposażonej w materiał dźwiękochłonny i 5-kanałowego komutatora obrotowego łączącego przewody elektrodowe z zestawem stymulującym/nagrywającym.
- Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się przez 1-2 godziny w środowisku nagrywania przed podłączeniem elektrod do przyrządów stymulujących i rejestrujących (patrz krok 1.17).
- Ustaw elementy sterujące stymulatora na wyjście 400 uA i zarejestruj amplitudę średnio 10 wywołanych reakcji, upewniając się, że między bodźcami upłynęło co najmniej 10 sekund. Użyj metody pokazanej na rysunku 1C, aby określić ilościowo wywołaną odpowiedź. Powtórz tę procedurę dla 600, 800, 1,000, 1,200 i 1,400 uA.
- Skonstruuj krzywą wejścia/wyjścia, wykreślając średnią amplitudę wywołanej odpowiedzi w funkcji intensywności bodźca. Na podstawie tego wykresu wyznacz intensywność bodźca, która odpowiada 50% zmierzonej maksymalnej amplitudy. Użyj intensywności 50% do końca eksperymentu.
- Następnie, korzystając z 50% intensywności bodźca, uzyskaj linię bazową, rejestrując średnią amplitudę 5 wywołanych reakcji co minutę przez 15 minut. Ponownie upewnij się, że między bodźcami upłynęło co najmniej 10 sekund.
- Następnie dostarczyć stymulację tężcową składającą się z 10 impulsów po 10 impulsów dostarczanych z częstotliwością 400 Hz z częstotliwością impulsu 5 Hz do przyśrodkowej ścieżki perforacji. Uważnie monitoruj zwierzę pod kątem oznak napadu, w tym mokrych potrząsań psa. Jeżeli u zwierzęcia wystąpi napad padaczkowy, doświadczenie powinno zostać przerwane, a wszystkie dane dotyczące tego zwierzęcia powinny zostać wyłączone z wyników badania.
- Następnie kontynuuj rejestrowanie średniej amplitudy 5 wywołanych odpowiedzi co minutę przez 30 minut po tetanizacji. Następnie porównaj tę amplitudę z amplitudą bazową uzyskaną w kroku 2.5, obliczając procentową zmianę w stosunku do wartości wyjściowej (rysunek 2).
- Po zakończeniu eksperymentów zwierzę zostaje poddane eutanazji poprzez inhalację izofluranu – jest to metoda zgodna z wytycznymi dotyczącymi eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tabela 1 przedstawia współrzędne dla DG i mPP wykorzystane w niniejszym protokole. Rysunek 1A pokazuje oznaczenia struktur docelowych na czaszce; zaznaczono również położenie elektrody uziemiającej i referencyjnej. Rysunek 1B ilustruje reprezentatywne zapisy odpowiedzi wywołanej przed i po tetanizacji u tego samego zwierzęcia. Należy zauważyć, że odpowiedź wywołana po tetanizacji jest większa niż odpowiedź przed tetanizacją, co świadczy o indukcji LTP2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole zademonstrowaliśmy wiarygodną i prostą metodę badania LTP w DG u swobodnie zachowujących się myszy. Podczas gdy przeprowadzono wiele badań LTP na obudzonych szczurach3,4, bardzo niewiele z nich przeprowadzono na obudzonych myszach, głównie ze względu na złożoność techniczną wynikającą z ograniczonej powierzchni czaszki u myszy i wagi główek elektrod w stosunku do średniej masy myszy5. Kilka badań, które wykazały LTP w DG u swobodnie zachowujących się myszy, wykorzystywało albo system...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować następującym: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, Mr. R.J. Austin-LaFrance, oraz Pani Jessica Koranda.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketamina (100 mg / ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Ksylazyna (20 mg / ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazyna (10 mg / ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Akryl dentystyczny w proszku | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dentystyczny płyn akrylowy | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Drut wolframowy (0,127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Rurka podskórna ze stali nierdzewnej (0,286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Wkładka druciana ze stali nierdzewnej (0,2 mm) | Świat Instrumenty precyzyjne | 792900 | |
| Stereotaktyczny aparat ramowy | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Nauszniki (nauszniki) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Stymulator elektrofizjologiczny | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Oscyloskop cyfrowy | BK Precision Corp. | 2542 | |
| Izolator prądowy | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | ||
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Wiertło dentystyczne | Stoelting | 58650 |
Bibliografia
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
