Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

22.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50644

⸱

19 października 2013

 , 
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Streszczenie

Ten artykuł skupia się na hybrydyzacji in situ (WISH) zarodków danio pręgowanego. Technologia WISH ułatwia ocenę ekspresji genów zarówno pod kątem rozmieszczenia w tkankach, jak i etapu rozwoju. Opisano protokoły stosowania WISH na zarodkach danio pręgowanego przy użyciu antysensownych sond RNA znakowanych digoksygeniną. Sondy są generowane przez włączenie nukleotydów połączonych z digoksygeniną poprzez transkrypcję in vitro matryc genów, które zostały sklonowane i zlinearyzowane. Kosmówka zarodków pobranych w określonych stadiach rozwojowych jest usuwana przed inkubacją za pomocą specjalnych sond. Po procedurze mycia w celu usunięcia nadmiaru sondy, zarodki są inkubowane z przeciwciałem anty-digoksygeninowym sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Stosując chromogenny substrat dla fosfatazy alkalicznej, można ocenić specyficzną ekspresję genów. W zależności od poziomu ekspresji genów cała procedura może zostać zakończona w ciągu 2-3 dni.

Wprowadzenie

Danio rerio (danio rerio) stał się potężnym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem kręgowców, chorobami, zachowaniem i badaniami przesiewowymi w lekach1-3. Zarodki danio pręgowanego można uzyskać w dużych ilościach z jednego krzyżowania. Zapłodnienie i rozwój następuje ex utero, a optycznie czyste zarodki szybko się rozwijają. Krytyczne zdarzenia rozwojowe występują w ciągu pierwszych 48 godzin po zapłodnieniu (hpf). Obejmuje to pojawienie się zawiązków narządów i inicjację cytoróżnicowania. Knockdown lub nadekspresję białek można osiągnąć poprzez mikroiniekcję zarodków z oligonukleotydami antysensownego morfolinukleotydu (MO) lub mRNA odpowiednio w stadium jednej lub dwóch komórek (0,75 hpf).

ŻYCZENIE embrionów danio pręgowanego ułatwia badanie czasoprzestrzennej ekspresji konkretnych genów będących przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie techniki WISH po mikroiniekcji zarodków z mRNA lub MO w celu nadekspresji lub obniżenia określonych poziomów białka ujawnia zróżnicowaną regulację innych genów.

Zmiany we wzorcach ekspresji genów mogą być skorelowane ze zmianami fenotypowymi i ujawnić funkcję docelowych genów podczas wczesnej organogenezy. Ponieważ sondy mogą być przygotowywane i przechowywane z wyprzedzeniem, technika ISH może być stosowana do ujawniania wzorców ekspresji genów dla co najmniej 20 genów jednocześnie przy użyciu sześciodołkowych płytek i specjalnie wykonanych koszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hybrydyzacja zarodków danio pręgowanego w całości na miejscu

1.1 Przygotowanie zarodków

  1. Zbieraj zarodki na wymaganych etapach rozwoju. Zobacz Kimmel et al.5 w celu zapoznania się z opisem stadium embrionalnego.
  2. Usuń choriony ręcznie za pomocą kleszczy (Dumont Watchmakers Forceps nr 5).
  3. Utrwalić zarodki w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) sporządzonym w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Płucz zarodki PBS co najmniej 3x przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej.
  5. Przechowuj zarodki w 100% metanolu (MeOH) w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania w przyszłości technik, w tym hybrydyzacji in situ w całości.
  6. Zamrożone zarodki w stanie zaawansowania w ciekłym azocie w celu ekstrakcji RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Ekstrakcja RNA z zarodków w stadium i synteza cDNA do amplifikacji PCR, a następnie klonowania.

1.2 Synteza sond RNA znakowanych digoksygeniną

  1. Amplifikacja PCR i klonowanie genów do matrycy sondy. Ustawić reakcję PCR o całkowitej objętości 50 μl, jak pokazano w tabeli 1. Użyj więcej genomowego DNA lub mniej cDNA w reakcji PCR jako matrycy. Uwzględnij 10-minutowy czas przedłużenia w temperaturze 72 °C po ostatnim cyklu, aby upewnić się, że produkty reakcji PCR są na całej długości i 3' adenylowane, aby ułatwić klonowanie TOPO.
Odczynnik głośność Matrycowy DNA 100 ng Bufor PCR (10x) 5 μl dNTP (10 mM) 2 μl Podkłady (10 mM) 1 μM każdy Dodaj wodę do końcowej objętości 49,7 μl Polimeraza Taq (5 jednostek/μl) 0,3 μl Objętość reakcji 50 μl

Tabela 1. Reakcja amplifikacji PCR.

  1. Sprawdź rozmiar produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Szacowana wielkość produktu PCR do syntezy sondy jest bliska 1 kb.
  2. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia nukleazą, przeprowadzając eksperyment w sterylnych warunkach i używając wody wolnej od nukleaz. W przypadku zaobserwowania wielu produktów, przed przystąpieniem do klonowania należy oczyścić żelem produkt PCR o odpowiedniej wielkości za pomocą zestawu do klonowania TOPO TA. Zoptymalizuj reakcję PCR, aby wyeliminować pojawianie się rozmazywania i wielu prążków.
  3. Przeprowadzić reakcję klonowania TOPO, jak wskazano w tabeli 2. Połączyć wektor TOPO i produkt PCR i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
Odczynnik Kompetentne chemicznie komórki Ogniwa elektrokompetentne Świeży produkt reakcji PCR 1-4 μl 1-4 μl Roztwór soli 1 μl Rozcieńczony roztwór soli 1 μl Woda Do całkowitej objętości 5 μl Do całkowitej objętości 5 μl Wektor TOPO 1 μl 1 μl Ostatni tom 6 μl 6 μl

Tabela 2. Reakcja klonowania TOPO.

  1. Włącz/wprowadź produkt klonowania TOPO do kompetentnych komórek w jednym ujęciu. Ten proces nazywa się transformacją.
  2. Inkubować przekształcone komórki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przy prędkości 260 obr./min, aby zapewnić ekspresję genów oporności na antybiotyki. Mieszaninę transformacyjną (50-100 μl) rozłożyć na wstępnie podgrzanych płytkach agarowych Luria Bertani (LB) zawierających 50 μg/ml ampicyliny i X-gal. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Określ obecność wkładki na podstawie wyglądu białych lub jasnoniebieskich kolonii. Wektor TOPO zawiera gen lacz, który koduje β-galaktozydazę. W obecności X-gal produkcja β-galaktozydazy tworzy niebieski kolor. DNA zligowane w plazmidzie zaburza tworzenie funkcjonalnej β-galaktozydazy i powstają białe kolonie. Białe kolonie lub jasnoniebieskie kolonie potwierdzają obecność wkładki.
  4. Za pomocą sterylnych końcówek pipet pobrać białe kolonie z płytki agarowej i umieścić je w sterylnej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 4 ml pożywki LB i kultury w temperaturze 37 °C w inkubatorze do wytrząsania przez noc przy 200 obr./min.
  5. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu plazmidowego DNA zgodnie z instrukcją producenta.
  6. Linearyzuj cDNA po oczyszczeniu plazmidu poprzez trawienie 5 μg cDNA dla każdej sondy za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który ma unikalne miejsce zlokalizowane 3' (dla sond czujnikowych) lub 5' (dla sond antysensownych) do insertu.
  7. Oczyść zlinearyzowane DNA metodą ekstrakcji fenolem/chloroformem. Dodać równą objętość fenolu/chloroformu, energicznie obracać wierzchołkami przez 30 sekund, wirować przez 3 minuty z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Przenieść górną fazę wodną do czystej probówki i dodać równą objętość chloroformu. Wirować przez 3 minuty z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Przenieść górną fazę wodną do czystej probówki. Dodaj 10% octanu sodu (3 M) i 2,5 razy więcej 100% etanolu, aby wytrącić DNA i przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc. Wirować przez 15 minut z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Usunąć etanol i umyć granulat 75% etanolem. Protokół można przerwać, a DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C i wznowić następnego dnia. Wirować przez 10 minut z prędkością 10 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i suszyć osad przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 10 μl uzdatnionej wody DEPC i inkubować w temperaturze 55 °C przez 20 minut. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV.
  8. Oceń czystość za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, używając 1 μl DNA na 1% żelu agarozowym i działając przez około 30 minut.
  9. Ustaw reakcję znakowania RNA. Używając fiolki reakcyjnej wolnej od RNazy, dodaj 1-5 μg oczyszczonego DNA matrycy do sterylnej, wolnej od RNaz, poddanej działaniu DEPC, podwójnie destylowanej wody do objętości 13 μl. Schłodzić fiolkę reakcyjną na lodzie i dodać następujące odczynniki (patrz Tabela 3):
Odczynnik głośność Mieszanina do etykietowania NTP (10x) 2 μl Bufor transkrypcyjny (10x) 2 μl Inhibitor RNazy Protector 1 μl Polimeraza RNA SP6 lub Polimeraza RNA T7 2 μl Ostatni tom 20 μl

Tabela 3. Reakcja znakowania RNA.

  1. Odczynnik należy delikatnie wymieszać, a następnie zebrać na dnie przez krótkie odwirowanie przy 2 000 obr./min przez 30 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować mieszaninę reakcyjną przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Usunąć matrycę DNA, dodając 2 μl DNazy I, wolnej od RNazy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i zatrzymać reakcję przez dodanie 2 μl 0,2 M EDTA (pH 8,0).
  3. Wytrącić produkty reakcji, dodając 2,5 μl 4 M LiCl i 75 μl 100% etanolu. Wymieszać roztwór i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 45 minut lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc, a protokół wznowić następnego dnia.
  4. Odwirować zawiesinę przez 30 minut przy 13 000 obr./min w temperaturze 4 °C, następnie przepłukać osad 500 μl 70% etanolu przechowywanego w temperaturze -20 °C, odwirować przez kolejne 10 minut, wysuszyć przez 2 minuty, ponownie zawiesić w 50 μl i inkubować w 30 min w temperaturze 37 °C.
  5. Sprawdź jakość i integralność sondy, uruchamiając 1-2 ml na 1% żelu agarozowym przez około 30 minut. Potwierdza to obecność na żelu pojedynczego produktu biegnącego w oczekiwanym rozmiarze.
  6. Określ ilościowo stężenie sondy, mierząc ilość RNA za pomocą spektrofotometru. Wydajność tej reakcji wynosi około 10 μg RNA (100-200 ng/μl).

1.3 Hybrydyzacja In Situ w całości

  1. DZIEŃ 1
    1. Rehydracja
      1. Przygotuj kosze, używając nylonowej siatki (o średnicy mniejszej niż 1 mm) i probówek Eppendorf. Zbuduj kosze, przecinając probówki Eppendorfa (1,5 ml), aby usunąć stożkowe końce. Aby zidentyfikować poszczególne kosze, użyj różnokolorowych rurek i zdejmij górne krawędzie z połowy z nich.
      2. Wytnij małe kawałki nylonowej siatki, aby zakryć odcięte końce rurek Eppendorf. Przyklej odcięte końce rurek do nylonowej siatki, podgrzewając je na elektrycznej płycie grzejnej (ustawionej między średnią a wysoką) w dygestorium. Po schłodzeniu usuń nadmiar nylonowej siatki z koszy i przechowuj je w 100% metanolu w temperaturze pokojowej.
      3. Przygotować kolejne rozcieńczenia metanolu w PBS (75% [obj./obj. [metanolu], 50% [obj./obj.] metanolu i 25% [obj./obj.] metanolu) przy użyciu pierwszych trzech dołków z sześciodołkowych płytek, a następnie 100% PBST (sól fizjologiczna buforowana fosforanem zawierająca 0,1% Tween-20) w następnych trzech dołkach.
      4. Poddać zarodki procedurze hybrydyzacji in situ przy użyciu specjalnie wykonanych koszy, jak pokazano na rysunkach 1a i b. Roztwory wolne od RNaz należy stosować aż do etapu hybrydyzacji na płytkach 6-dołkowych (4 ml / dołek). Aby to osiągnąć, umieść do 6 koszy w pierwszej studzience. Najpierw ułóż kosz z obrzeżem, a następnie kosze bez obrzeży w różnych kolorach ułożone kolejno. Za pomocą tego układu można jednocześnie określić do 6 wzorców ekspresji genów.
      5. Odwodnione zarodki w tym samym stadium rozwoju należy umieścić w tym samym koszyku (patrz rysunek 1).
      6. Nawadniaj zarodki, przenosząc kosze z jednego dołka w płytce sześciodołkowej do następnego (5 minut na każdy krok). Użyj sześciu studzienek wypełnionych odpowiednim buforem. Zarodki poddaje się każdemu rozcieńczeniu jeden raz. W ten sposób zarodki są myte 6 razy, 5 min/mycie. Nawodnienie odwodnionych zarodków uzyskuje się poprzez zastąpienie metanolu PBS, a następnie przez przemycie 3x 100% PBST.
    2. Przepuszczalność Trawić uwodnione zarodki proteinazą K (10 μg/ml) w temperaturze pokojowej, aby stały się przepuszczalne, jak pokazano w tabeli 4. Stadium embrionalne (godziny po zapłodnieniu) Okres trawienia (proteinaza K) Maksymalnie 6 15 sekund 6-12 30 sekund 12-18 Czas trwania: 3 min 24 Czas trwania: 12-15 min Rozdział 48 Czas trwania: 25-30 min 72 Rozdział 72 Czas trwania: 40 min 96-120 szt. Czas trwania: 50 min
      Tabela 4. Reakcja przepuszczalności.
    3. Postfiksacja i mycie PBST
      1. Utrwal zarodki poprzez inkubację w 4% paraformaldehydzie (wag./obj.) w 1x PBS przez 20 min.
      2. Usunąć pozostałości paraformaldehydu poprzez mycie zarodków 3x, 5 min/mycie, w 1x PBST.
    4. Acetylacja Przygotować mieszaninę acetylacyjną (125 μl trietanoloaminy i 27 μl bezwodnika octowego w 10 ml ddH2O) i inkubować zarodki dwa razy przez 10 minut każdy. Aby zminimalizować endogenną aktywność fosfatazy, w razie potrzeby przygotuj mieszaninę acetylacyjną na świeżo. Aby usunąć nadmiar odczynnika, umyj zarodki dwukrotnie w PBST (10 min/pranie)
    5. Prehybrydyzacja Prehybrydyzacja zarodków polega na przeniesieniu zarodków z koszy do sterylnych probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i inkubacji z 200 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej przez 2-4 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C.
    6. Predesorpcja przeciwciał Usuń około 50 zarodków z koszy i przenieś je do sterylnych probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Inkubować z przeciwciałem anty-DIG-AP (1:500) przy użyciu buforu blokującego (1x PBST, 2% surowicy cielęcej [obj./obj.), 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej [BSA]) w temperaturze pokojowej przez 2-4 godziny, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Rano wyjąć z inkubatora i odczekać, aż zarodki osiągną temperaturę pokojową.
    7. Hybrydyzacja Dodać 100-200 ng sondy do wstępnie zhybrydyzowanych zarodków i inkubować przez noc w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej.
  2. DZIEŃ 2
    1. SSC (cytrynian soli fizjologicznej) myje
      1. Umieścić 50 ml probówek mieszaniny hybrydyzacyjnej (HM), 2x SSC i 0,2x SSC w zlewce z wodą w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C i ogrzewać je przez co najmniej 20 minut. Usunąć mieszaninę reakcyjną hybrydyzacji zawierającą sondę, dodać 1 ml wstępnie podgrzanej mieszaniny hybrydyzacyjnej do probówek i inkubować przez 15 minut w temperaturze 70 °C. Napełnić płytki sześciodołkowe różnymi rozcieńczeniami wstępnie podgrzanego HM w 2x SSC, zastępując Od 100% HM do 50% do 25% HM w celu usunięcia nadmiaru odczynników.
      2. W oczekiwaniu napełnić płytki sześciodołkowe 2x SSC do mycia i utrzymywać je w temperaturze 70 °C.
      3. Po 15 minutach umieścić zarodki z probówki w koszach przechowywanych na płytce sześciodołkowej wypełnionej rozcieńczeniami HM z 2x SSC i umyć zhybrydyzowane zarodki, przesuwając kosz z jednego dołka do drugiego (po 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C). Myć zarodki 2x, 15 min/mycie, w 100% 2x SSC w temperaturze 70 °C.
      4. Ustawić kolejną łaźnię wodną na 65 °C. Napełnić sześciodołkowe płytki 0,2x SSC w celu przemycia o wysokiej rygorystyczności, aby uniknąć niespecyficznej hybrydyzacji transkryptu z sondą.
      5. Po dwukrotnym przemyciu zarodków 2x SSC w temperaturze 70 °C, następnie wykonaj kolejne dwa 30-minutowe płukania w 0,2x SSC w temperaturze 65 °C.
    2. Myjnie PBST Przygotować sześciodołkowe płytki z kolejnymi rozcieńczeniami 0,2x SSC w PBST w następujący sposób: 75% (vol/vol) 0,2x SSC, 50% (vol/vol) 0,2x SSC, 25% (vol/vol) 0,2x SSC, a pozostałe dwudołkowe 100% PBST. Umyj zhybrydyzowane zarodki, przesuwając kosz z jednego dołka do drugiego (5 minut na każdy krok w temperaturze pokojowej za pomocą kołyski).
    3. Preinkubacja Wstępną inkubację zarodków przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej w buforze blokującym (1x PBST, 2% surowica cielęca [obj./obj.), 2 mg/ml BSA).
    4. Inkubacja z przeciwciałem anty-DIG Inkubować zarodki roztworem przeciwciała anty-DIG-AP (1:5 000) w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
  3. DZIEŃ 3
    1. Myjnie PBST Przygotować płytki sześciodołkowe z 4 ml/dołek PBST. Umyć inkubowane zarodki, przesuwając kosze na sześciodołkowej płytce zawierającej PBST 6x przez okres 15 minut. Zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, a protokół jest wznawiany następnego dnia.
    2. Barwienie wstępne Zarodki należy wstępnie przebarwić, myjąc 2x przez 15 minut buforem do wstępnego barwienia w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przed inkubacją w obecności BCIP (fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilo) i NBT (tetrazolium nitroniebieskie). BCIP i NBT są substratami używanymi do rozwoju barwy aktywności fosfatazy alkalicznej. Ponieważ sondy są połączone z fosfatazą alkaliczną, rozwój fioletowego koloru wskazuje na ekspresję docelowego genu. Zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, a protokół jest wznawiany następnego dnia.
    3. Barwienia
      1. Inkubować zarodki w temperaturze pokojowej w ciemności z BCIP i NBT przez 30 minut.
      2. Monitoruj reakcję barwienia co 30 minut za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Czas reakcji waha się od 15 min do 16 godzin w zależności od poziomu ekspresji genów. Czas reakcji jest krótszy w przypadku genów o wysokiej ekspresji i dłuższy w przypadku genów o słabej ekspresji. Sondy Sense będą wykrywać sygnały, jeśli gen będący przedmiotem zainteresowania wyraża komplementarne transkrypty antysensowne (AS).
    4. Po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia należy zatrzymać reakcję, przenosząc kosze zawierające zarodki do studzienek zawierających roztwór zatrzymujący (1x PBS, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Pozwoli to uniknąć dalszego rozwoju koloru. Płucz zarodki przez 10 min 2x na bujaczku z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
    5. Postfiksacja
      1. Inkubować zarodki w paraformaldehydzie 4% (wag./obj.) w PBS przez 20 min.
      2. Umyj zarodki (5 min/mycie) trzykrotnie PBST w celu usunięcia pozostałości paraformaldehydu. Utrwalone zarodki należy przechowywać w roztworze zatrzymującym w ciemności w temperaturze 4 °C.
    6. Montaż, obserwacja i akwizycja obrazu
      1. Przenieść zarodki na sześciodołkową płytkę zawierającą 100% glicerolu, używając minimalnej możliwej objętości PBS. Umieść sześciodołkową płytkę na kołysce i delikatnie mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności.
      2. Umieść zarodki w 100% glicerolu, a następnie obserwuj sygnał pod mikroskopem stereoskopowym.
      3. Pobieraj obrazy i zapisuj je w formacie pliku TIFF lub dowolnym innym typie, który umożliwia tworzenie obrazów wysokiej jakości za pomocą oprogramowania do obsługi obrazów, takiego jak Photoshop (rysunki 3-6).

2. Podwójna hybrydyzacja Inin Situ

  1. Aby uzyskać podwójne znakowanie, stosuje się metodę opisaną powyżej od 1.1 do 1.3.1.7, ale obejmuje jednoczesną inkubację zarówno sond znakowanych digoksygeniną, jak i fluoresceiną podczas hybrydyzacji.
  2. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla płukania po hybrydyzacji, a mianowicie płukania SSC i PBST (kroki 1.3.2.1 i 1.3.2.2) i inkubacji blokujących (etap 1.3.2.3). Reakcje przeciwciał i barwienia należy wykonywać sekwencyjnie, jak opisano poniżej.
  3. Inkubować zarodki z przeciwciałem anty-digoksygeninowym sprzężonym z AP (1:5 000) w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
  4. Przemyć i inkubować z BCIP-NBT (etapy 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
  5. Po wykryciu należy dwukrotnie przemyć zarodki PBST w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  6. Inkubować zarodki w temperaturze 65 °C w PBST z 1 mM EDTA przez 30 minut w celu inaktywacji przeciwciała anty-digoksygeninowego.
  7. Inkubuj zarodki w 100% metanolu, a następnie nawadniaj je w 75%, 50% i 25% metanolu za pomocą PBST i z powrotem do PBST przez 1 godzinę.
  8. Inkubować zarodki przez noc z fluoresceiną sprzężoną z AP (1:2 000) w buforze blokującym w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
  9. Umyć zarodki PBST (etap 1.3.3.1) i wstępnie wybarwić zarodki 2 razy przez 15 minut buforem do wstępnego barwienia (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przed inkubacją w obecności szybkiej czerwieni. Protokół można przerwać, a zarodki można przechowywać w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem i wznowić następnego dnia.
  10. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić jedną tabletkę Fast Red w 2 ml buforu barwiącym.
  11. Reakcję barwienia należy rozpocząć od umieszczenia zarodków w buforze barwiącym z odczynnikiem Fast Red.
  12. Przerwij reakcję barwienia, gdy zostanie osiągnięta pożądana intensywność barwienia. Może to trwać od kilku godzin w temperaturze pokojowej do jednego lub dwóch dni w nocy w przypadku barwienia w temperaturze 4 °C. Reakcję należy natychmiast przerwać, jeśli intensywność barwienia nie rozwija się dalej lub zaczyna wykazywać nieswoistość w porównaniu z kontrolą zmysłową.
  13. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi powyżej dla pozostałych etapów, a mianowicie po fiksacji, montażu, obserwacji i akwizycji obrazu (kroki 1.3.3.5 i 1.3.3.6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując protokół z 50 embrionami w koszyku (na gen/na warunek eksperymentalny), wzór ekspresji danego genu można uzyskać w ramach jednego eksperymentu. Prawie wszystkie embriony wykazują podobne wzory ekspresji dla konkretnego genu. Reprezentatywne przykłady barwienia w hybrydyzacji in situ przedstawiono na Rysunkach 3-6.

Zarówno sondy sensowne, jak i antysensowne zostały zsyntetyzowane z cDNA odpowiadających PC5.1, PC5.26, SCL/tal-17, gata-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy ulepszone metody wizualizacji RNA z wysoką rozdzielczością. Procedury hybrydyzacji in situ przeprowadza się przy użyciu prostych, wykonanych na zamówienie koszy z porowatym dnem (ryc. 1). Zarodki są przetwarzane przy użyciu roztworów wolnych od RNaz na płytkach 6-dołkowych w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach.

Do segregacji zarodków wykonuje się kosze z różnokolorowych probówek Eppendorfa. Koszyczki z obrzeżem lub bez niego służą do łatwej ori...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taq PolymeraseInvitrogen10342053
Zestaw do klonowania TopoTA - Podwójny promotor pCRII-TOPOInvitrogenK4650-01
HQ Mini zestaw do oczyszczania plazmiduInvitrogenK2100-01
AgarozaRoche11 685 660 001
Not1 i enzymy restrykcyjne HindIIIInvitrogen15441-025, 15207-012
Nasycony buforem fenol, ultraczystyInvitrogen15513039Przechowywać w temperaturze 4 stopni C. Działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe i podejrzewa się działanie rakotwórcze. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z produktem.
ChloroformFisherC607-1Toksyczny i podejrzany czynnik rakotwórczy. Praca pod wyciągiem.
DNA wolne od RNaz IRoche4716728001Przygotuj małe porcje i przechowuj w temperaturze -20&C.
Znakowanie DIG-RNA Mieszaj z polimerazą RNA Sp6, T7 i T3Roche11277073910
Inhibitor RNazyRoche10777-019
3,0 M octan sodu (pH 5,5)Fisher50-751-7355
100% etanolAlkohole
Pirowęglan dietylu (DEPC)Sigma40718-25MLDEPC działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Używaj okularów ochronnych, rękawic i maski.
NaOHFisherSS255-1
EDTA 0,5 M (pH 8,0)Fisher50-751-7404
systemy akwariowez solą oceanicznąNie dotyczy
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)FisherFL-03-0900
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148-1KGPrzygotuj i przechowuj w temperaturze -20° C jako 40 ml podwielokrotności do późniejszego wykorzystania. PFA jest toksyczny. Używaj okularów ochronnych, rękawic i maski przeciwpyłowej.
Fenylotiokarbomid (PTC)SigmaP7629-25GPTC jest wysoce toksyczny. Używaj okularów ochronnych, rękawic i maski przeciwpyłowej.
MetanolFisherA947-4
Dumont (Zegarmistrz' s) Kleszcze wzór nr 5Narzędzia
Sześciodołkowy klaster do hodowli komórkowychSarstedt83.1839
Kosze wykonane są z siatki nylonowej i probówek EppendorfaPrzygotowanieAby zrobić kosze, należy wyciąć probówki Eppendorfa (1,5 ml) z brzegami lub bez, aby usunąć stożkowy koniec. Pokrój nylonową siatkę na małe kawałki odpowiadające rozmiarowi  odcięte końce rurek Eppendorf. Umieść rurki z nylonową siatką zakrywającą odcięty koniec na elektrycznym  płyta grzejna, aż zarówno rurka, jak i siatka nylonowa skleją się ze sobą (przeprowadzić w dygestorium). Odetnij nadmiar siatki od koszy i przechowuj je w 100% metanolu do momentu użycia.
Monolaurynian polioksyetylenosorbitanu (Tween 20)SigmaP1379-500ML
Proteinaza KFermentasEO0491
Bezwodnik octowySigma242845
TrietanoloaminaSigma90279-100ML
Formamid o wysokiej czystościSigmaF9037
AG501-X8 ŻywicaBio Rad142-6424
Kwas cytrynowy jednowodnySigmaC0706-500G
Sól sodowa heparynySigmaH3393-25KU
Bufor solno-sodowy cytrynianu sodu (SSC)SigmaS6639
tRNA z drożdży piekarskich typ XSigmaR5636-1ML
NaClFisherS640-500
Tris-HClFisherBP153-1
MgCl2FisherS25403
Chlorowodorek lewamizoluSigma31742
N,N-dimetyloformamid
bezwodny (DMF)		Sigma227056Drażniący, toksyczny, palny i podejrzewany teratogen. Trzymaj się w odpowiednim stroju ochronnym, w tym rękawicach i okularach.
Fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylowy (BCIP)SigmaN6639Chronić ten roztwór przed światłem.
Nitroblue tetrazolium (NBT)Sigma840WChroń ten roztwór przed światłem.
Albumina z surowicy bydlęcej, oczyszczona frakcja V (BSA)SigmaA8806
Owcza anty-digoksygenina-AP Fab FragmentsRoche1093274910
GlycerolSigmaG5516-500ML
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowychSarstedt83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2ZIRCTg(mnx1:GFP)ml2
Natychmiastowesystemy akwarioweOcean N/A
handloweBłyskawiczne do nauki o napięciu we własnym zakresie

Bibliografia

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
  3. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
  4. Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
  5. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  6. Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
  7. Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
  8. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
  9. Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
  10. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
  11. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  12. Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
  13. Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
  14. Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
  15. Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
  16. Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
  17. Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
  18. Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156(2005).
  19. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
  20. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ekspresji gen wsondy antysensowne RNAznakowanie digoksigenindetekcja za pomoc fosfatazy alkalicznejusuwanie chorionutraktowanie proteinaz Kprocedura p ukania po hybrydyzacjibarwienie BCIP NBT
Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.