Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy żywotności komórek w hodowli

46.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50645

⸱

20 stycznia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

W tym artykule

Podsumowanie

Związki terapeutyczne są często najpierw badane in vitro za pomocą testów żywotności. Zliczanie ślepych komórek przez ludzkiego obserwatora może być bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany liczby komórek, ale nie ocenia funkcji. Komputerowe testy żywotności, jak opisano tutaj, mogą ocenić zarówno strukturę, jak i funkcję w obiektywny sposób.

Streszczenie

Ręczne liczenie komórek pod mikroskopem jest czułym sposobem oceny żywotności komórek, ale jest czasochłonne i dlatego kosztowne. Skomputeryzowane testy żywotności są drogie pod względem sprzętu, ale mogą być szybsze i bardziej obiektywne niż ręczne liczenie komórek. W niniejszym sprawozdaniu opisano zastosowanie trzech takich testów żywotności. Dwa z tych testów są w podczerwieni, a jeden luminescencyjny. Oba testy w podczerwieni opierają się na 16-bitowym obrazie Odyssey. Jeden test w podczerwieni wykorzystuje barwienie DRAQ5 dla jąder w połączeniu z barwieniem szafirowym dla cytozolu i jest wizualizowane w kanale 700 nm. Drugi test w podczerwieni, In-Cell Western, wykorzystuje przeciwciała przeciwko białkom cytoszkieletu (α-tubulina lub białko związane z mikrotubulami 2) i znakuje je w kanale 800 nm. Trzeci test żywotności jest powszechnie stosowanym testem luminescencyjnym dla ATP, ale używamy jednej czwartej zalecanej objętości, aby zaoszczędzić na kosztach. Wszystkie te pomiary są liniowe i korelują z liczbą platerowanych komórek, ale różnią się czułością. Wszystkie trzy testy pozwalają uniknąć czasochłonnej mikroskopii i pobierają próbki z całej studni, zmniejszając w ten sposób błąd pobierania próbek. Wreszcie, wszystkie testy można łatwo wykonać w ciągu jednego dnia od zakończenia eksperymentu, co pozwala na przeprowadzenie większej liczby eksperymentów w krótkich ramach czasowych. Jednak wszystkie opierają się na założeniu, że liczba komórek pozostaje proporcjonalna do siły sygnału po leczeniu, założenie, które czasami nie jest spełnione, zwłaszcza w przypadku komórkowego ATP. Ponadto, jeśli komórki zwiększają się lub zmniejszają po leczeniu, może to wpłynąć na siłę sygnału bez wpływu na liczbę komórek. Dochodzimy do wniosku, że wszystkie testy żywotności, w tym ręczne liczenie, są obarczone szeregiem zastrzeżeń, ale skomputeryzowane testy żywotności są warte początkowej inwestycji. Połączenie wszystkich trzech testów daje kompleksowy obraz struktury i funkcji komórek.

Wprowadzenie

Najczęstszym testem żywotności w naukach biologicznych jest liczenie komórek. Dowodzi tego analiza 200 najpopularniejszych (najnowszych) publikacji, które ukazały się w PubMed ze słowami kluczowymi "in vitro" lub "kultura" w dniach 29.04.2013 i 30.04.2013. Spośród tych publikacji 23,5% wykorzystywało testy zliczania komórek, w tym ręczne liczenie liczby komórek, automatyczne liczenie liczby komórek za pomocą oprogramowania do obrazowania i wykluczenie błękitu trypanowego. Test żywy/martwy został użyty w 1% tych publikacji. Liczba publikacji, w których zastosowano test MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) w celu oceny żywotności metabolicznej wyniosła 11%. To badanie literatury pokazuje również, że liczba publikacji wykorzystujących testy takie jak MTT w połączeniu z testami liczby komórek wyniosła tylko 3,5%. Pomimo tendencji do stosowania jednego testu żywotności samodzielnie, ocena funkcji komórkowej w połączeniu z liczbą komórek wydaje się najlepszym wyborem do oceny integralności komórkowej. Sama liczba komórek nie jest wystarczająca, ponieważ pozostałe komórki mogą nie być funkcjonalne lub zdrowe, mimo że są obecne w studzience1,2. I odwrotnie, miary funkcjonalne, takie jak ATP, mogą zwiększać się lub zmniejszać przy braku równoległych zmian w liczbie komórek. Rozdzielenie odczytów metabolicznych od liczby komórek sugeruje, że testy ATP i MTT nigdy nie powinny być stosowane jako jedyny test żywotności. W niniejszym raporcie opisano trzy testy żywotności, które badają zarówno struktury komórkowe, jak i funkcję metaboliczną, w celu uzyskania bardziej wszechstronnego obrazu integralności komórkowej niż jakikolwiek pojedynczy test może sobie pozwolić.

Dwa z naszych testów wymagają kamery na podczerwień, która mierzy fluorescencję w kanałach 700 i 800 nm. Szum jest niski w podczerwieni, co prowadzi do wyższych stosunków sygnału do szumu3. Używany przez nas imager Odyssey ma zakres dynamiki 4,5 log i głębię bitową 16, co przekłada się na 2,16 lub 65 536 odcieni podczerwieni. Można to skontrastować z 8-bitowym obrazowaniem kolorów, które zapewnia tylko 2,8 lub 256 odcieni kolorów dla każdej długości fali. Dzięki temu obrazowanie 16-bitowe ma lepszą rozdzielczość. Należy zauważyć, że oryginalne obrazy w podczerwieni są często pseudokolorowe na zielono (800 nm) i czerwono (700 nm) w opublikowanych raportach do prezentacji. Obrazowanie Odyssey jest powszechnie używane zarówno w westernach blotting, jak i w westernach In-Cell4-7. Westerny w komórkach na komórkach utrwalonych formaldehydem wykorzystują pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko dowolnemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania i znakują je kolejno drugorzędowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi w podczerwieni. Wiadomo, że technika ta jest szczególnie przydatna w przypadku punktów końcowych fosforylacji6. W naszych In-Cell Western barwimy utrwalone komórki pod kątem białek cytoszkieletu α-tubuliny lub białka związanego z mikrotubulami neuronalnymi 2 (MAP2) w kanale 800 nm. Białka te są wystarczająco obfite, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu. Barwimy również nasze płytki w kanale 700 nm dla jąder za pomocą barwienia DRAQ5 oraz dla cytoplazmy za pomocą barwienia szafirowego. Zarówno białka cytoszkieletu, jak i barwienia DRAQ5 + Sapphire odzwierciedlają zatem struktury komórkowe.

Trzeci test żywotności mierzy funkcję metaboliczną i nazywa się "Miano komórek Glo." W tym teście opartym na lucyferazie, wartości luminescencji są wprost proporcjonalne do poziomów ATP. Testy ATP są powszechnie stosowane do ilościowego oznaczania żywotnych komórek8-12. Jednak włączenie słowa "miano" do nazwy testu jest nieco mylące, ponieważ wartość wyjściowa ATP na komórkę może się zmieniać w funkcji leczenia toksynami i dlatego nie zawsze jest proporcjonalna do komórki numer8. Na poziom ATP mogą również wpływać rytmy okołodobowe13 oraz podział komórki14 i różnicowaniekomórek15. Niemniej jednak pokazany tutaj test ATP jest prosty do wykonania i użyteczny, ponieważ ATP jest solidną miarą żywotności metabolicznej16-21, jeśli nie liczby komórek jako takich. Użycie tego testu jako uzupełnienia podczerwieni In-Cell Westerns daje zatem bardziej wszechstronny obraz integralności komórkowej niż jakikolwiek pojedynczy test osobno.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat protokołów jest zilustrowany na rysunku 1.

1. Poszycie komórek

Płytki w 96-dołkowych płytkach o różnych gęstościach posiewu (Rysunek 2). Do kontroli liniowości linii komórkowej nerwiaka zarodkowego N2a, płytka 2,5 tys., 5 tys., 10 tys. i 15 tys. komórek na dołek w 3 lub 6 dołkach / grupę. W celu sprawdzenia liniowości w pierwotnych neuronach korowych szczurów, płytka 25k, 50k, 100k i 200k komórek na studzienkę w 3 lub 6 dołkach / grupie. Jeśli linie komórkowe lub komórki pierwotne będące przedmiotem zainteresowania wyglądają zdrowo przy różnych gęstościach posiewu, płytka jest w okolicach i wokół optymalnej gęstości komórek dla tego typu komórek.

Uwaga: W obecnym badaniu, komórki N2a zostały posiane w mediach o objętości 100 μl, a pierwotne neurony korowe w mediach o objętości 200 μl na płytkach, które są zaprojektowane do niższego parowania. Szczegółowe informacje na temat postępowania z komórkami, pożywki, surowic, antybiotyków i leczenia toksynami można znaleźć w Unnithan i wsp. dla komórek N2a8 i Posimo i wsp. dla pierwotnych kultur korymózgowej 22.

    1. Powtórzyć posiewanie na drugiej płytce 96-dołkowej. Jedna płytka zostanie oznaczona pod kątem ATP (ryc. 2A), a druga za pomocą testów w podczerwieni (ryc. 2B). Nie można użyć tej samej płytki do testów ATP i podczerwieni, ponieważ komórki muszą być lizowane w stanie otwartym w celu wewnątrzkomórkowych pomiarów ATP.
    2. Upewnij się, że masz co najmniej 3 dodatkowe studzienki do odejmowania tła w testach podczerwieni przy optymalnej gęstości posiewu (kolumna 2; Rysunek 2B).
  2. Dodaj pożywkę bez komórek lub, taniej, sterylną wodę do zewnętrznych studzienek w rzędach A i H oraz w kolumnach 1 i 12. Należy unikać polegania na danych z odwiertów wzdłuż krawędzi, ponieważ żywotność jest tutaj często niższa ze względu na skutki parowania mediów i gradientów temperatury. Takie problemy z mikropłytkami są powszechnie nazywane efektami krawędziowymi23,24. Nie utrzymuj tych studzienek pustych, ponieważ wtedy rzędy B i G oraz kolumny 2 i 11 cierpią z powodu efektu krawędzi.
    Efekty krawędziowe można ograniczyć poprzez inkubację świeżo wysianej płytki w temperaturze pokojowej w warunkach otoczenia przed przeniesieniem do inkubatora CO2 24. Ponadto niedawne badanie przeprowadzone przez Carralot opisuje matematyczną metodę korekcji płytek do mikromiareczkowania przy użyciu pojedynczej kolumny kontrolnej23. Oliver i jego współpracownicy użyli specjalnie zaprojektowanego inkubatora płytkowego do mikromiareczkowania z wymuszonym obiegiem powietrza, aby zredukować gradienty termiczne25. Jeśli efekt krawędzi jest poważnym problemem, można zakupić komory stabilności mikropłytek (np. BT&C Incorporated) w celu stworzenia jednorodnego mikrośrodowiska o wysokiej wilgotności i równomiernych gradientach temperatury.
  3. Jeśli potrzebnych jest więcej studzienek niż pokazano na rysunku 1, ponieważ będą testowane dodatkowe rozcieńczenia odczynników lub większa gęstość posiewu, należy użyć studzienek krawędziowych do odejmowania tła.
  4. Poczekaj noc na przyłączenie komórek i wykonaj test następnego ranka, jak opisano poniżej.

2. Test luminescencyjny ATP

  1. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta Cell Titer Glo dotyczącymi rekonstytucji substratu z buforem i czasu inkubacji.
    1. Usunąć odpowiednio 50 lub 150 μl podłoża ze 100 lub 200 μl podłoża galwanicznego. W studni pozostanie nieco mniej niż 50 μl. Dodać 25 μl odczynników (substrat plus bufor) do kolumn 2-6 (rysunek 2A) w rozcieńczeniu 1:2.
      Uwaga: Różne objętości pożywki pozostawione po usunięciu mogą rozcieńczyć lub skoncentrować odczynniki do oznaczania ATP w różny sposób w dołkach. Należy upewnić się, że poziom płynu we wszystkich końcówkach do pipet wielokanałowych jest jednakowy. Zmierzyć pozostałą ciecz w wybranych studzienkach w poprzek płytki za pomocą pipety bezpośrednio przed dodaniem odczynników do oznaczania ATP, aby zapewnić dokładność. Jeżeli występuje duża zmienność wynikająca z różnic w szybkości parowania pożywek na powierzchni płytki, należy usunąć wszystkie stare podłoża i dodać taką samą objętość świeżej pożywki lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do wszystkich studzienek bezpośrednio przed dodaniem odczynników do oznaczania ATP. Jeśli płytki cierpią z powodu zmiennego poziomu parowania, spróbuj przełączyć się na płyty o niskim parowaniu firmy Costar Corning. Na tych ostatnich płytach 60 studni wewnętrznych pokazanych na rysunku 2 cierpi z powodu parowania mediów średnio 0,995%±0,41 w ciągu nocy. W związku z tym występuje znikoma zmienność objętości pożywki w czasie testu.
    2. W kolumnach od 7 do 11, rzędy od B do D, usunąć wystarczającą ilość pożywki, aby pozostawić 50 μl, jak opisano powyżej, i dodać 50 μl odczynników w rozcieńczeniu 1:1.
    3. W kolumnach od 7 do 11, rzędy od E do G, pozostawić komórki w 100 μl pożywki i dodać 100 μl odczynników, ponownie w rozcieńczeniu 1:1. Firma zaleca, aby 100 μl odczynników rozcieńczyć w stosunku 1:1 w 100 μl pożywki.
      Uwaga: Aby zaoszczędzić na kosztach, możliwe jest zmniejszenie tych zaleceń zarówno pod względem objętości, jak i rozcieńczenia. Jednak zanim to zrobisz, upewnij się, że nie zmniejsza to liniowości i czułości testu.
    4. Gdy jedna określona objętość i współczynnik rozcieńczenia odczynników okażą się zadowalające, należy trzymać się ich we wszystkich kolejnych eksperymentach. Kryteria zadowalających danych są opisane w sekcji Wyniki.
    5. Niewykorzystane odczynniki po rekonstytucji można ponownie zamrozić i wykorzystać w późniejszym terminie, aby zaoszczędzić na kosztach. Według producenta, odczynniki po rekonstytucji mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez 21 tygodni przy ~3% utracie aktywności.
  2. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 2 minuty lub wytrząsarce nutującej na 10 minut. Jeśli część płytki jest badana do innego pomiaru i nie można jej wstrząsnąć, należy mieszać pożywkę za pomocą prostego pipetowania góra-dół tylko w interesujących ją studzienkach. Jednak nadmierna ilość pęcherzyków powstających na tym etapie będzie zakłócać produkcję luminescencyjną.
    1. 10 minut po dodaniu odczynników przenieść 60 μl zawartości studzienki na białe płytki 96-dołkowe. Wartości luminescencji są wyższe w białych płytkach niż w przezroczystych lub czarnych, ponieważ odbijają one światło w górę w kierunku detektora.
      Uwaga: Z naszego doświadczenia wynika, że ogniwa przeżywają lepiej na przezroczystych płytkach Costar o niskim parowaniu niż na innych płytkach. Te konkretne płyty nie są sprzedawane z białymi ściankami. Po drugie, płyty o nieprzezroczystych ściankach i przezroczystym dnie są droższe niż płyty całkowicie przezroczyste. Jeśli przeniesie się płyn luminescencyjny na białe płytki, białe płytki można umyć i ponownie wykorzystać, oszczędzając na kosztach używania nowych białych płytek do każdego eksperymentu. Przenoszenie cieczy jest więc tańszą opcją na dłuższą metę.
    2. Przed odczytaniem płytki należy usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą igły lub, najlepiej, wymuszonego przepływu powietrza z plastikowej bańki pipety transferowej. Odczytaj tabliczkę na luminometrze z czasem całkowania 1 sekundy (firma zaleca 0,25-1 sekundy jako wystarczający czas integracji). Odczytać tabliczkę 10-12 minut po dodaniu odczynników do oznaczania ATP. Czas ma kluczowe znaczenie dla porównania na różnych płytach, ponieważ sygnał luminescencyjny jest przejściowy z szybkim tempem zaniku, jak wykazali Gilbert iwspółpracownicy26.
  3. Uśrednić wartości luminescencji z 3 lub 6 dołków w każdej grupie i wykreślić jako funkcję liczby komórek na wykresie rozrzutu (patrz rysunek 3). Najpierw odejmij średnie wartości luminescencji tła odpowiednich pustych studzienek (studzienki 2B - 2G, studzienki 11B - 11D i studzienki 11E - 11G) od każdego odpowiedniego punktu danych. W tym początkowym eksperymencie będą trzy różne grupy dla każdej gęstości posiewu (rysunek 2A). Poziomy ATP mogą być liniowo skorelowane z gęstością komórek w jednej lub wszystkich tych grupach. Postępuj z najwyższym rozcieńczeniem odczynników, które nadal daje zadowalające wyniki, aby zaoszczędzić na kosztach. Kryteria zadowalających wyników są opisane w sekcji Wyniki.
    Uwaga: W przypadku pożywek użytych w niniejszym badaniu wartości tła w tym teście nie są wysokie i możliwe jest pominięcie ślepych studzienek. Jednak producent Promega zgłasza różnice w luminescencji z różnymi pożywkami hodowlanymi. W niniejszym badaniu wykorzystano Hyclone Fetal Clone III, syntetyczną wersję płodowej surowicy bydlęcej dla komórek N2a i surowicy cielęcej bydła do pierwotnych kultur korowych. Według producenta surowica cielęca obniża wartości luminescencji, ale nie zmniejsza czułości testu. Niemniej jednak, jeśli jest to poważny problem, rozcieńczyć odczynniki do oznaczania ATP w PBS zamiast w pożywce w czasie testu.
    1. Jeśli wydaje się, że komórki rosną nierównomiernie w kolumnach przez noc, spróbuj je oznaczyć w ciągu 6 godzin od posiewania. Należy jednak pamiętać, że gęstość w zwykłym czasie oznaczania (na przykład 24 godziny po poddaniu działaniu substancji) jest gęstością, przy której należy osiągnąć liniowość.

3. Testy w podczerwieni

  1. Rano po posiewie zamocuj komórki na drugiej płytce w temperaturze pokojowej w dygestorium. Na tym etapie należy założyć rękawiczki i wyrzucić utrwalacz jako odpad chemiczny, ponieważ formaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym. Dodać 4% formaldehydu i 4% sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym do istniejących pożywek w rozcieńczeniu 1:1. Pożywkę można również zmyć PBS przed utrwaleniem w pełnomocnym utrwalaczu. Każda technika działa dobrze.
    1. Inkubować w utrwalaczu przez 20 minut, a następnie usunąć utrwalacz i przemyć 3x w 200 μl PBS.
  2. Przechowywać płytkę w PBS z 0,2% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C, jeżeli oznaczenie nie zostanie przeprowadzone tego samego dnia. W przeciwnym razie kontynuuj test i umieść komórki w roztworze blokującym, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
    1. Rozcieńczyć surowicę rybią Odyssey block 1:1 w PBS i dodać 0,3 % Triton-X 100 jako permeabilizator komórek. Przygotować wystarczającą ilość roztworu blokującego, a także roztworów przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych, aby można było odpipetować 35 μl do każdej studzienki. Jeśli jednak podczas pipetowania zaobserwuje się dużo pęcherzyków, należy przygotować >50 μl na każdą studzienkę, w przeciwnym razie pęcherzyki dotrą do komórek i zablokują wiązanie przeciwciał. Nadmierne bąbelki mydlane pojawią się jako niepoplamiona okrągła plama na środku studni. W takim przypadku spróbuj wyregulować pipetowanie.
    2. Inkubować w tym roztworze blokującym przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: 5% albumina surowicy bydlęcej lub normalne surowice tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe mogą być również stosowane jako roztwory blokujące, aby zaoszczędzić na kosztach bloku surowicy rybnej. Roztwory blokujące mogą wpływać na działanie przeciwciała. W związku z tym optymalny blok dla każdego przeciwciała najlepiej określić empirycznie.
      Uwaga: Niektórzy badacze umieszczają zachodnie płytki In-Cell na wytrząsarkach podczas inkubacji. Nie jest to jednak konieczne.
  3. Wykonaj przeciwciała pierwszorzędowe: rozcieńczenie 1:10 000 dla anty-α-tubuliny (monoklonalna mysie, tabela 1) i rozcieńczenie 1:2 000 dla anty-MAP2 (monoklonalna myszy, tabela 1). Przeciwciała te są specyficzne dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tych modelach komórkowych; Specyficzność jest niezbędna dla każdego barwienia immunocytochemicznego.
    Uwaga: MAP2 jest markerem neuronów i jest odpowiedni dla mieszanych kultur neuronalnych/glejowych. Pokazane tutaj kultury postnatalne również zawierają pewną ilość gleju (~25%), ponieważ astrocyty pojawiają się jako pierwsze w 18 dniu embrionalnym, a ich liczba osiąga szczyt we wczesnym okresie noworodkowym27,28. Nie można rozróżnić astrocytów i neuronów w testach ATP i DRAQ5 + Sapphire. Aby oddzielnie mierzyć neurony i astrocyty, użyj jednoczesnego barwienia MAP2 i GFAP w kanałach 800 i 700 nm, jak opisano przez Mulletta i współpracowników4,29, pomijając DRAQ5 + Sapphire. Jeśli jednak wszystkie komórki w hodowli chcą zostać ocenione, należy użyć markera pankomórkowego, takiego jak α-tubulina, β-aktyna lub GAPDH.
    Uwaga: Te rozcieńczenia zostały zoptymalizowane dla N2a i pierwotnych komórek korowych i mogą nie uogólniać się na każdy model. Dlatego należy spróbować co najmniej dwóch rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych, jednego na lewej połowie płytki i jednego na prawej połowie (patrz rysunek 2B). Alternatywnie, spróbuj 3-4 rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych w 3 dołkach każdy. Na przykład, zalecane rozcieńczenie na arkuszu wkładki przeciwciała może być otoczone podwójnymi zmianami. Innymi słowy, jeśli zalecane rozcieńczenie dla immunocytochemii wynosi 1:500, wypróbuj również współczynniki rozcieńczenia 1:250 i 1:1,000.
    1. Rozcieńczyć przeciwciała w bloku 1:1 Odyssey:PBS i dodać 0,3% Triton-X. Aby zaoszczędzić na kosztach, spróbuj wytworzyć przeciwciała w roztworze blokującym, który został nałożony na komórki w kroku 3.2.1, usuwając ten roztwór pod koniec inkubacji. Zachowaj przy tym komórki w PBS; Nie mogą wyschnąć.
    2. Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku słabo wiążących przeciwciał i białek, które nie są obfite, inkubacja przez noc może pomóc w zwiększeniu sygnału.
      Uwaga: Pozostaw co najmniej 3 studzienki w roztworze blokującym w celu odjęcia tła przy każdym stężeniu przeciwciał drugorzędowych (studzienki 2B-2D i studzienki 2E-2G na rysunku 2B). Nie wystawiaj tych studzienek na działanie żadnego przeciwciała pierwotnego. Ujawniają one zakres niespecyficznego wiązania przez przeciwciało drugorzędowe i są przydatne do obliczania stosunku sygnału do szumu. Jeśli istnieje obawa, że przeciwciała drugorzędowe doprowadzą do wysokiego poziomu niespecyficznego wiązania, należy również uwzględnić studzienki kontrolne, które nie są narażone na działanie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych, ale otrzymują taką samą liczbę płukań. Różnica między tymi studzienkami a dołkami "tylko wtórnymi" ujawni zakres niespecyficznego wiązania spowodowanego przez samo przeciwciało wtórne. W naszym teście na mysich komórkach N2a intensywność sygnału z samym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko myszy wynosiła 0,557±0,032, sygnał z samym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi wynosił 0,533±0,041, sygnał bez przeciwciała drugorzędowego wynosił 0,357±0,003, a sygnał z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi wynosił 11,867±0,911. W związku z tym nie zaobserwowaliśmy wysokich poziomów niespecyficznego wiązania, nawet przy użyciu drugorzędowych przeciwciał anty-mysich na komórkach myszy. Istnieje kilku producentów przeciwciał drugorzędowych w podczerwieni; Zalecamy kupowanie tylko tych z dużą adsorbacją krzyżową. Należy pamiętać, że stężenie drugorzędowych przeciwciał IgG może się różnić w zależności od źródła.
  4. Zmyć przeciwciała pierwszorzędowe 3 przemycikami po 200 μl PBS na studzienkę, każde po 10 minut. Przeciwciała pierwszorzędowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni w 0,2% azydku sodu i ponownie wykorzystać, aż po wystawieniu roztworów na światło pojawią się drobne drobinki zanieczyszczeń. Odbywa się to tylko w celu zaoszczędzenia kosztów. Jeśli koszt nie jest problemem, wytwarzaj świeże przeciwciała do każdego użycia.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:1,000 lub 1:2,000 w bloku 1:1 Odyssey:PBS 0,3% Triton-X (Figura 2B). Dodać rozcieńczenie 1:1,000 do górnej połowy płytki i 1:2,000 do dolnej połowy płytki. Stężenia te można jeszcze bardziej zmniejszyć, aby zaoszczędzić na kosztach, ale przed podjęciem decyzji o tym należy sprawdzić liniowość.
    Uwaga: Należy pamiętać o dodaniu odpowiedniego roztworu przeciwciał drugorzędowych do studzienek odejmowania tła (kolumna 2 na rysunku 2B).
    1. Jeśli drugie białko zostanie oznaczone zamiast DRAQ5 + Sapphire, oznacz komórki pod kątem α-tubuliny lub MAP2 za pomocą koziej anty-mysiej IgG o długości 700 nm, a drugie białko w kanale 800 nm za pomocą pierwszorzędowych przeciwciał z gatunku innego niż mysz. Kanał 800 nm ma mniejsze tło niż kanał 700 nm i powinien być zarezerwowany dla najbardziej krytycznego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    2. Inkubować w przeciwciałach drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w szufladzie z dala od światła.
  6. Zmyć przeciwciała drugorzędowe 3 płukaniami po 200 μl PBS na studzienkę, po 10 minut każde.
  7. Wykonaj rozwiązania DRAQ5 + Sapphire. W przypadku lewej połowy płytki rozcieńczyć DRAQ5 1:10 000 (końcowe stężenie 0,5 μM) i szafir 1:1000 w PBS z 0,3% Triton-X (kolumny 3 - 6; Rysunek 2B). W prawej połowie płytki rozcieńczyć DRAQ5 1:20 000 (0,25 μM) i szafir 1:2000 (kolumny 7 - 10; Rysunek 2B).
    Uwaga: DRAQ5 był sprzedawany w magazynie 1 mM zamiast w magazynie 5 mM. W związku z tym w niektórych wcześniej opublikowanych raportach stosowano rozcieńczenia DRAQ5 8 w stosunku 1:4 000 lub 1:2 000.
    1. Aby zaoszczędzić na kosztach, jeśli dwie płytki są testowane jednocześnie, te same roztwory DRAQ5 + Sapphire można zastosować na dwóch płytkach po kolei, pipetując je z pierwszej płytki i dodając do drugiej. Jeśli te same roztwory będą używane w ten sposób dwukrotnie, zużyj je w ciągu jednego dnia. Rozcieńczonych roztworów DRAQ5 + Sapphire nie można przechowywać w temperaturze 4 °C ani zamrażać do późniejszego wykorzystania.
    2. Inkubować w tych roztworach przez 30 minut w temperaturze pokojowej z dala od światła. Jeśli czas jest krótki, a roztwory DRAQ5 + Sapphire nie zostaną ponownie użyte na innych płytkach z różnymi wtórnymi, dodaj te barwniki do drugorzędowych roztworów przeciwciał w kroku 3.5 i inkubuj przez 1 godz.
      Uwaga: Nie dodawaj roztworu DRAQ5 + Sapphire do studzienek odejmowania tła (kolumna 2 na rysunku 2B), ponieważ studzienki te nie powinny być barwione w kanale 700 nm.
  8. Myć płytkę 3x po 200 μl PBS na dołek przez 10 minut każdy. Umieścić 0,2% azydek sodu w końcowym płukaniu PBS, jeśli płytka ma być barwiona innymi przeciwciałami drugorzędowymi w zakresie widzialnym po zakończeniu obrazowania w podczerwieni.
  9. Zeskanuj płytę za pomocą urządzenia Odyssey Imager. Zacznij od zeskanowania płyt z intensywnością 5 i rozdzielczością 169 mm. Wystarczą ustawienia "średnia jakość" lub "niska jakość". Firma nie udostępnia szczegółowych informacji na temat filtrów wzbudzenia/emisji. Jednak filtry emisji mają około 20 nm szerokości i są wyśrodkowane wokół 720 i 820 nm, według producenta.
    Uwaga: Możliwe jest skanowanie płytek, gdy są jeszcze mokre, ponieważ badacze mogą chcieć nadal barwić je innymi markerami. Firma sugeruje jednak w swoim protokole online, że suche płyty powodują mniejsze rozprzestrzenianie się sygnału od źródła do studni. Jeśli zeskanujesz je zarówno na mokro, jak i na sucho, aby porównać dane, pamiętaj, aby usunąć wszystkie PBS ze studni, ponieważ sole pozostałe po odparowaniu mogą prowadzić do wysokiej fluorescencji tła wzdłuż krawędzi.
    1. Odyssey Imager skanuje w górę i na wskroś spód płyty. Płyty różnych producentów mogą wymagać różnych przesunięć ostrości, ponieważ dno studzienek może różnić się grubością i głębokością w płycie. Spróbuj skanować z różnymi przesunięciami ostrości i zobacz, gdzie uzyskuje się najwyższy stosunek sygnału do szumu i najwyraźniejszy (najbardziej ostry) sygnał: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Spróbuj również zmierzyć głębokość studni od dna talerza za pomocą linijki, aby potwierdzić odkrycia na Odysei. Pamiętaj, że plastik na dnie studni może dodać dodatkową wysokość do wymiarów linijki. Płyty Costar użyte w niniejszym badaniu wymagają przesunięcia ostrości o 4,0 mm.
    2. Użyj funkcji In-Cell Western w oprogramowaniu, aby umieścić siatkę o odpowiednim rozmiarze na obrazie płyty i wyeksportować dane do programu Microsoft Excel. Zbadaj wartości "zintegrowanej intensywności" tych samych studzienek przy różnych przesunięciach ostrości, aby znaleźć najwyższe wartości fluorescencji. Przesunięcie ostrości, które daje najwyższy stosunek sygnału do szumu (sygnał w studzienkach wybarwionych immunologicznie w porównaniu ze studzienkami "bez pierwotnej kontroli ujemnej"), jest tym, które należy wybrać poniżej.
    3. Po ustaleniu jednego przesunięcia ostrości skanuj ponownie w mniejszych przyrostach. Na przykład, jeśli najjaśniejszy sygnał znajdował się na 3,5 i 4,0 mm, spróbuj zeskanować na 3,6, 3,7, 3,8 i 3,9 mm i sprawdź, czy nastąpiła dalsza poprawa siły sygnału. Jeśli przesunięcie ostrości jest nieprawidłowe, intensywność sygnału w 12 kolumnach na pustej płycie (podczas gdy wszystkie kolumny powinny mieć równy sygnał) pojawi się jako krzywa w kształcie litery U, a nie płaska linia. Jeśli nadal stanowi to problem z plastikowymi talerzami, wypróbuj talerze ze szklanym dnem.
  10. Odejmij średnią zintegrowanych intensywności w studzienkach odejmowania tła (rysunek 2B; studzienki 2B - 2D lub studzienki 2E - 2G) od każdego odpowiedniego punktu danych w kanałach 700 i 800 nm. Następnie należy uśrednić zintegrowane intensywności sygnału dla każdej grupy studni. Wykreśl dane jako wykres rozrzutu w stosunku do gęstości komórek (patrz rysunek 3).
    1. Porównaj wyniki dwóch różnych rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych oraz wyniki dwóch różnych rozcieńczeń DRAQ5 + Szafir, aby ustalić na jednym rozcieńczeniu dla kolejnych eksperymentów. Jeśli liniowość nie zostanie osiągnięta, spróbuj skanować z inną intensywnością. Skanuj ponownie z intensywnościami 3 i 7 zamiast 5 i ponownie przeanalizuj dane. Jeśli dane poprawiają się przy jednej z tych intensywności, ale nadal nie są zadowalające, skanuj ponownie w przyrostach związanych z tą intensywnością.
    2. Należy uważać, aby nie analizować obrazów, na których oprogramowanie pokazuje białe plamy w studzienkach; plamy te oznaczają nasycony sygnał poza zasięgiem kamery. W takim przypadku skanuj z mniejszą intensywnością.
    3. Jeśli liniowość nie zostanie osiągnięta, spróbuj również utrwalić komórki w ciągu 6 godzin od posiewania, ponieważ mogą one rosnąć lub umierać nierównomiernie w różnych kolumnach z dnia na dzień. Wypróbuj również różne gęstości posiewu, różną intensywność skanowania, dalsze optymalizacje współczynników rozcieńczania odczynników, płytki ze szklanym dnem, sam DRAQ5 jako barwnik tylko w jądrze lub inne przeciwciała niż anty-α-tubulina lub anty-MAP2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Czynnikiem ograniczającym tempo w tych eksperymentach jest barwienie podczerwone, ponieważ test ATP trwa stosunkowo krótko. W przypadku analiz podczerwonych przewidujemy, że w ciągu jednego dnia można zabarwić i zeskanować osiem płytek 96-dołkowych, wprowadzając kaskadowo dwie serie po cztery płytki każda (patrz Rycina 1). Szacunek ten zakłada 20 min fiksacji, 30 min płukania, 30 min blokowania, 2 h inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie 30 min płukania, 1 h inkubacji z przeciwciałem dru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odkryliśmy, że siła sygnału we wszystkich trzech testach żywotności jest liniowa i skorelowana z gęstością posiewu. Jednak nie wszystkie testy są jednakowo wrażliwe na 2-krotne lub 1,5-krotne zmiany gęstości posiewu. W przypadku komórek N2a testy w podczerwieni są mniej czułe niż testy ATP, szczególnie przy niższych gęstościach posiewu. Chociaż testy w podczerwieni są mniej czułe niż ATP, testy DRAQ5 + Sapphire i testy α-tubuliny są zgodne, ponieważ ujawniają wysoce ochronny wpływ N-acetylocysteiny. W obu testach nastąpi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Juliannowi Jaumotte za pomysł zaoszczędzenia na ilości odczynników w teście ATP. Jesteśmy głęboko wdzięczni za wspaniałe wsparcie administracyjne Mary Caruso, Deb Willson i Jackie Farrer oraz Mylan School of Pharmacy za zapewnienie wsparcia finansowego dla tych badań. Podziękowania należą się również Fundacji Chorób Lękliwych Hunkele oraz Fundacji Zaburzeń Ruchowych i Parkinsona za wsparcie finansowe podstawowych badań neuronalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Miano komórek GloPromegaG7572Kup w ilości 100 ml i podwielokrotności, zamiast kupować droższą ilość 10 ml. Rozpuszczone, niewykorzystane odczynniki można ponownie zamrozić w temperaturze -20 & stopni; C przez co najmniej 21 tygodni
18% FormalinaThermo-Shandon9990244Zakup tego utrwalacza pozwala uniknąć ważenia proszków formaldehydu i wrzenia roztworu; w ten sposób minimalizuje się narażenie na opary
SacharozaSigma-AldrichS0389jest konieczne dodawanie tego do roztworów formaldehydu, ale poprawia wygląd komórek stałych:
Blok OdysseyLI-COR927-40003Tę rybią surowicę można kupić luzem i zamrozić w temperaturze -20 & deg; C do długotrwałego stosowania
Triton-X 100Sigma-Aldrich21568Roztwór podstawowy 10% Triton-X 100 przechowujemy w sterylnej wodzie o temperaturze 4 & st.; C
Fosforan sodu MonobasicFisherS468Można również kupić tabletki PBS lub 10x roztwory PBS, ale są one droższe
Fosforan sodu dwuzasadowyFisherS373Patrz wyżej
Azydek sodu (250x)Ricca Chemical Company7144.8-16Nie kupuj proszku, ponieważ azydek sodu jest bardzo toksyczny. Wszystkie nasze zużyte przeciwciała przechowujemy w 1x azydku sodu w temperaturze 4 & stopni; C, dopóki nie zostaną skażone szczątkami
Mysia anty-&alfa-tubulinaSigma-AldrichT5168To przeciwciało jest drogie, ale może być znacznie rozcieńczone i jest wysoce specyficzne
Mysie przeciwciało anty-MAP2Sigma-AldrichM9942To przeciwciało jest drogie, ale jest wysoce specyficzne (warunek wstępny dla westernów w komórkach)
800 nm Kozia anty-mysia IgGLI-COR926-32210Inne firmy również sprzedają przeciwciała drugorzędowe w podczerwieni. Pamiętaj, aby zakupić przeciwciała o wysokiej adsorpcji krzyżowej i pamiętać, że stężenia IgG mogą się różnić w zależności od źródła
DRAQ5BiostatusDR50200Związek ten był sprzedawany przez LI-COR w ilości 1 mM
SzafirLI-COR928-40022
LuminometrPerkinElmerVICTOR3 1420 licznik wieloetykietowy
Odyssey ImagerLI-COR9201-01
Shaker/MixerResearch Products International248555
Nie

Bibliografia

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kondycja kom rkowapomiar ATPobrazowanie w podczerwieniIn Cell Westernbarwienie DRAQ5 Sapphiretest luminescencyjnybia ka cytoszkieletoweobrazownik Odysseyluminometr
Testy żywotności komórek w hodowli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.