Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Rachele Sangaletti; Laura Bianchi

doi:10.3791/50649

Method Article

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

Rachele Sangaletti¹ , Laura Bianchi¹

¹Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans to potężny system modelowy, w którym techniki genetyczne i molekularne są łatwo stosowane. Do niedawna jednak techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek i izolacji określonych typów komórek, nie mogły być stosowane u C. elegans. Ograniczenie to wynikało z faktu, że tkanki są zamknięte w naskórku pod ciśnieniem, który nie jest łatwo trawiony przez leczenie enzymami i/lub detergentami. Opierając się na wczesnych, pionierskich pracach Lairda Blooma, Christensen ^{i współpracownicy} opracowali solidną metodę hodowli komórek embrionalnych C. elegans na dużą skalę. Jaja są izolowane od ciężarnych dorosłych osobników poprzez traktowanie wybielaczem/NaOH, a następnie traktowane chitynazą w celu usunięcia skorupek jaj. Komórki embrionalne są następnie dysocjowane przez ręczne pipetowanie i umieszczane na szkle pokrytym substratem w pożywce wzbogaconej surowicą. W ciągu 24 godzin od izolacji komórki zaczynają się różnicować poprzez zmianę morfologii i ekspresję markerów specyficznych dla komórki. Komórki C. elegans hodowane tą metodą przeżywają do 2 tygodni in vitro i zostały wykorzystane do analiz elektrofizjologicznych, immunochemicznych i obrazowych, a także zostały posortowane i wykorzystane do profilowania mikromacierzy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) to potężny organizm modelowy do badania molekularnych podstaw funkcji, różnicowania i zachowania komórek. Chociaż jego genom, szlaki metaboliczne i biosyntezy są podobne do kręgowców, jego podatność genetyczna i molekularna jest znacznie ^większa2. Do jego zalet należą wielkość i prosta anatomia, szybki cykl życia (3 dni w temperaturze 25 °C), krótka długość życia (2 tygodnie) i duża liczba potomstwa (200 >). Ze względu na jego hermafrodytyczny charakter i krótki cykl życiowy, manipulacje molekularne i genetyczne są proste w przypadku C. elegans, w tym tworzenie zwierząt transgenicznych ^3,4<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gwiazdki (*) wskazują nowe lub zmodyfikowane kroki w porównaniu do Christensena i wsp.¹

1. Ustawienia materiału

Procedura hodowli komórkowej wymaga dużych ilości jaj wyizolowanych od grawitacyjnych osobników dorosłych. Uprawiaj C. elegans na 8P płytki agarowe obsiane bakteriami NA22 (dostępnymi za pośrednictwem C. elegans Genetic Consortium - CGC) w celu wyizolowania dużych ilości jaj. W tych płytkach ilość użytego peptonu jest 8 razy większa niż zwykle używana w płytkach NGM. Wyższe stężenie peptonów efektywniej podtrzymuje wzrost bakterii NA22, które w przeciwieństwie do OP50-, rosną w gru....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans hodowane komórki różnicują się i wyrażają markery specyficzne dla komórek

Christensen i współpracownicy, używając barwienia błękitem trypanowym, wykazali, że >99% embrionalnych komórek >C. elegans przeżywa procedurę izolacji. W 9 i 22 dniu po posianiu odpowiednio 85% i 65% nadal żyje ¹. Wyizolowane embrionalne komórki C. elegans muszą przylegać do podłoża w celu różnicowania. Komórki, które nie przylegają, tworzą grudki i nie jest jasne, czy .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans jest potężnym organizmem modelowym do rozszyfrowywania szlaków genetycznych zaangażowanych w rozwój, zachowanie i starzenie się. Jego wygoda wynika przede wszystkim z łatwości, z jaką można go genetycznie zmanipulować, oraz z jego krótkiego cyklu życia. Pomimo swojej wygody, C. elegans ma swoje ograniczenia. Komórki C. elegans są maleńkie i zamknięte w naskórku pod ciśnieniem, co ogranicza stosowanie metod wymagających bezpośredniego dostępu do komórek, takich jak techniki elektrofiz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
ODCZYNNIKI
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Agar Difco Granulowany	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Ekstrakt z drożdży baktonowych	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Płyn	Invitrogen	11415-064
Surowica bydlęca	płodu Invitrogen	16140-063
Penicylina-streptomycyna	Sigma	P4333-100ML
Chitynaza ze Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Centrum
Lektyna z orzeszków ziemnych	Sigma	L0881-10MG
Sacharoza	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glukoza	Sigma	67528-1KG
Glikol etylenowy-bis (2-amina– kwas tetrakwasowy (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl₂	Sigma	C1016-500G
MgCl₂	Sigma	M8266-100G
MgSO₄	Sigma	M2643-500 g
K₂HPO₄	Sigma	P2222-500G
KH₂PO₄	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Autoklawowany etanol
destylowany H₂O
Wybielacz
EQUIPMENT
101-1000 μ l Niebieskie końcówki do pipet z podziałką	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterylizowana pipeta pakowana pojedynczo	USA Scentific	1071-0810
Ergonomiczna zmienna objętość (100-1000 μ l) Pipetor z wyrzutnikiem końcówek	VWR International Inc.	89079-974
Przenośny przyrząd do pipetowania, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Sterylna pipeta transferowa z tworzywa sztucznego	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Rurka stożkowa	USA Scentific	1475-1611
50 ml Rurka stożkowa	USA Scentific	1500-1811
Sterylne igły o rozmiarze 18	Becton, Dickinson and Co.
Sterylne strzykawki 10 ml	Becton, Dickinson and Co.
Plastikowe filtry strzykawkowe Corning 0,20 μ m wielkość porów	Corning	431224
Acrodic 25 mm Filtr strzykawkowy z 5 μ m versapor Membrana	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm szalka Petriego sterylna	VWR International Inc.	82050-548
Szalka Petriego 100x15 mm Sterylna	VWR International Inc.	82050-912
Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mm	VWR International Inc.	48300-560
Przezroczyste płytki do hodowli komórkowych 24-dołkowe płaskie dno z pokrywką	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Drobne kleszcze	Narzędzia do nauki	11254-20
Wirówka 5702	Eppendorf	022629883
			przepływem laminarnym
obiektywem
			z nawilżanym powietrzem otoczenia

Genetyki305196305482 o wysokiej jakości Odwrócony mikroskop z z x10Inkubator

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles