Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50649

⸱

21 września 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Streszczenie

C. elegans to potężny system modelowy, w którym techniki genetyczne i molekularne są łatwo stosowane. Do niedawna jednak techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek i izolacji określonych typów komórek, nie mogły być stosowane u C. elegans. Ograniczenie to wynikało z faktu, że tkanki są zamknięte w naskórku pod ciśnieniem, który nie jest łatwo trawiony przez leczenie enzymami i/lub detergentami. Opierając się na wczesnych, pionierskich pracach Lairda Blooma, Christensen i współpracownicy opracowali solidną metodę hodowli komórek embrionalnych C. elegans na dużą skalę. Jaja są izolowane od ciężarnych dorosłych osobników poprzez traktowanie wybielaczem/NaOH, a następnie traktowane chitynazą w celu usunięcia skorupek jaj. Komórki embrionalne są następnie dysocjowane przez ręczne pipetowanie i umieszczane na szkle pokrytym substratem w pożywce wzbogaconej surowicą. W ciągu 24 godzin od izolacji komórki zaczynają się różnicować poprzez zmianę morfologii i ekspresję markerów specyficznych dla komórki. Komórki C. elegans hodowane tą metodą przeżywają do 2 tygodni in vitro i zostały wykorzystane do analiz elektrofizjologicznych, immunochemicznych i obrazowych, a także zostały posortowane i wykorzystane do profilowania mikromacierzy.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) to potężny organizm modelowy do badania molekularnych podstaw funkcji, różnicowania i zachowania komórek. Chociaż jego genom, szlaki metaboliczne i biosyntezy są podobne do kręgowców, jego podatność genetyczna i molekularna jest znacznie większa2. Do jego zalet należą wielkość i prosta anatomia, szybki cykl życia (3 dni w temperaturze 25 °C), krótka długość życia (2 tygodnie) i duża liczba potomstwa (200 >). Ze względu na jego hermafrodytyczny charakter i krótki cykl życiowy, manipulacje molekularne i genetyczne są proste w przypadku C. elegans, w tym tworzenie zwierząt transgenicznych 3,4 i stosowanie technik knock-downu genów, takich jak interferencja RNA5. Ciało i skorupka jaja C. elegans są przezroczyste. Dlatego komórki można łatwo uwidocznić zarówno u osoby dorosłej, jak i w zarodku za pomocą standardowej mikroskopii. W ciągu ostatnich 40 lat społeczność C. elegans stworzyła nieocenione zasoby do badań nad C. elegans, w tym dużą kolekcję mutantów, nokautów i transgeników, szczegółowy opis anatomii i rozwoju 6,7, w tym pełną rekonstrukcję układu nerwowego 8 oraz całkowicie zsekwencjonowany genom, który jest dobrze opisany i dostępny dla całej społeczności (www.wormbase.com).

Pomimo licznych zalet, niektóre eksperymentalne podejścia były wyzwaniem dla C. elegans. Należą do nich te, które wymagają dostępu do błony komórkowej komórek i izolacji tkanek lub typów komórek. Rzeczywiście, tkanki C. elegans są zamknięte w szkielecie hydrostatycznym pod ciśnieniem, który nie jest łatwo trawiony przez obróbkę enzymatyczną lub detergenty. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych Miriam Goodman i Janet Richmond opracowały pionierskie metody elektrofizjologicznych zapisów neuronów i komórek mięśniowych C. elegans in situ. Chociaż metody te dostarczyły nam ważnych informacji na temat funkcji neuronów i mięśni in vivo, są one trudne i mają niską przepustowość. Opracowano alternatywne metody badania funkcji komórek in vivo, w szczególności obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników wapnia, takich jak GCamP i cameleon 11-13. Metody te nie pozwalają jednak na stosowanie narzędzi farmakologicznych, ponieważ są one stosowane na nienaruszonych żywych zwierzętach.

Pierwsza próba hodowli komórek C. elegans in vitro na dużą skalę została podjęta przez Lairda Blooma podczas przygotowywania jego pracy doktorskiej 14. Niestety, trudności napotkane ze słabą przyczepnością komórek do podłoża, słabym różnicowaniem komórek i przeżywalnością uniemożliwiły ustanowienie tego wczesnego protokołu jako solidnej metody hodowli komórek. W 1995 roku Edgar i współpracownicy opublikowali procedurę badania podziału i morfogenezy komórek poprzez izolację i hodowlę pojedynczych zarodków C. elegans 15. Komórki embrionalne uzyskane przez trawienie skorupek jaj z kombinacją leczenia enzymatycznego i ręcznej dysocjacji kontynuowały proliferację, wytwarzając do ~500 komórek 15. Następnie Leung i współpracownicy wyhodowali niewielką liczbę blastomerów, aby zbadać morfogenezę jelit. Wykazali, że jeden z wyizolowanych in vitro E blastomerów wytwarza spolaryzowane komórki jelitowe, które tworzą strukturę analogiczną do światła jelita poprzez interakcję ze sobą poprzez wierzchołkowe połączenia adherensowe 16. Buechner i współpracownicy opisali również podobną metodę hodowli komórek embrionalnych C. elegans in vitro 17.

Na podstawie tej wczesnej pracy, Christensen i współpracownicy opracowali solidny protokół hodowli embrionalnych komórek C. elegans in vitro 1. Wykazali, że wyizolowane komórki C. elegans mogą różnicować się w różne typy komórek i zachowywać cechy, które posiadają in vivo, w tym ekspresję markerów specyficznych dla komórki. Kilka technik, które stanowią wyzwanie in vivo, można zastosować do izolowanych komórek embrionalnych C. elegans. Należą do nich techniki elektrofizjologiczne 1,18 19, obrazowanie i immunochemiczne 20,21, a także izolacja określonych typów komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) w celu budowy specyficznych dla komórki bibliotek cDNA 22,23. Techniki knockdownu genów, takie jak interferencja RNA (RNAi), mogą być stosowane na hodowanych komórkach C. elegans 1, a nowa metoda znakowania metabolicznego wykorzystująca cukier azydologiczny jako narzędzie do odkrywania glikoprotein została niedawno opracowana dla komórek C. elegans hodowanych in vitro 24.

Podsumowując, metoda hodowli komórkowej rozszerza wachlarz technik, które mogą być zastosowane do modelu C. elegans w celu rozszyfrowania funkcji genu w kontekście żywego organizmu. Opisujemy tutaj protokół hodowli komórek embrionalnych C. elegans in vitro, który jest w dużej mierze oparty na protokole opisanym po raz pierwszy przez Christiansena i współpracowników 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Gwiazdki (*) wskazują nowe lub zmodyfikowane kroki w porównaniu do Christensena i wsp.1

1. Ustawienia materiału

  1. Procedura hodowli komórkowej wymaga dużych ilości jaj wyizolowanych od grawitacyjnych osobników dorosłych. Uprawiaj C. elegans na 8P płytki agarowe obsiane bakteriami NA22 (dostępnymi za pośrednictwem C. elegans Genetic Consortium - CGC) w celu wyizolowania dużych ilości jaj. W tych płytkach ilość użytego peptonu jest 8 razy większa niż zwykle używana w płytkach NGM. Wyższe stężenie peptonów efektywniej podtrzymuje wzrost bakterii NA22, które w przeciwieństwie do OP50-, rosną w grubych warstwach.

8P przepis na talerze:

Rozpuść 3 g NaCl, 20 g Bacto-Pepton, 25 g agaru w 1 L sterylnej wody destylowanej i autoklaw przez 30 min. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia w temperaturze 55 °C, a następnie dodać sterylnie przefiltrowany 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w EtOH), 1 ml 1 MgCl2, 1 mlMgSO4 i 25 ml buforu KP (zapas 500 ml: 5 g K2HPO4, 30 g KH2PO4, pH 6,00). Wlej płynną pożywkę agarową do 10 cm szalek Petriego (25 ml/talerz).

  1. Następnego dnia rozprowadź całą powierzchnię każdej wzbogaconej płytki agaru peptonowego 1 ml NA22 E. coli hodowanej przez noc w pożywce 2XYT (16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl w 1 l sterylnej wody, pH 7,0) w temperaturze 37 °C. Bakterie te stanowią obfite źródło pożywienia, które tworzy grubą warstwę wspierającą wzrost dużych ilości grawitacyjnych osobników. Pozostaw talerze z nasionami na noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozwój bakterii. Proces ten można przyspieszyć poprzez inkubację w temperaturze 37 °C przez 4-5 godzin.
  2. Przenieś wygłodzone zwierzęta do zasiewu 8P Płyty. Zmyć zwierzęta z wygłodzonej płytki NGM za pomocą 5-6 ml buforu M9 lub wody i dodać 1-2 ml tej zawiesiny do każdego 8P talerz.
  3. Pozwól zwierzętom na wzrost i rozmnażanie się, aż płytki zostaną wypełnione w momencie zbiegu przez grawitujące dorosłe osobniki.
  4. Wyizolować jaja potrzebne do przygotowania komórek zarodkowych C. elegans od grawitacyjnych osobników dorosłych, używając 5-6 ml roztworu do lizy.

Przepis na roztwór do lizy

5 ml Fresh Bleach, 1,25 ml 10 N NaOH i 18,5 ml sterylnegoH2O. Mieszanina ta musi być przygotowana na świeżo przed każdym użyciem.

  1. Umyj jaja odizolowane od grawitych dorosłych osobników za pomocą bufora do jaj:

Przepis na bufor jaj

118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarność 340 mOsm.

  1. Usuń skorupkę jajka, która otacza jaja, podając je chitynazie. Chitynaza jest enzymem o najwyższej aktywności przy kwaśnym pH 25. Rozpuścić chitynazę (Sigma, nr katalogowy C6137) w buforze jajowym o pH 6,5 w końcowym stężeniu 2 mg/ml. Przechowywać roztwór podstawowy chitynazy w temperaturze -20 °C w 1 ml podwielokrotności w sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.
  2. Hodować komórki C. elegans na autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych (o średnicy 12 mm) pokrytych lektyną z orzeszków ziemnych. Lektynę z orzeszków ziemnych rozpuścić w sterylnej wodzie (0,5 mg/ml). Roztworu lektyny z orzeszków ziemnych nie należy filtrować ani sterylizować w autoklawie. Nie trzeba go również traktować światłem UV. Przechowywać 2 ml porcji w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Kompletna pożywka do hodowli komórkowych (500 ml) zawiera 500 ml pożywki L-15 firmy Gibco, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (inaktywowanej termicznie), 7,7 g sacharozy (45 mOsm), 5 ml 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (2%). Całe podłoże jest następnie filtrowane za pomocą filtra porowego 0,20 μm.

Zauważ, że bufor jaj i pożywka hodowlana mają osmolarność odpowiednio 340 i 345 mOsm. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do komórek ssaków, komórki C. elegans mają stosunkowo wysoką osmolarność, którą należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania roztworów, które będą miały bezpośredni kontakt z błoną plazmatyczną komórek. Receptury tych odczynników dostosowano tak, aby osiągnąć pożądaną osmolarność, którą zmierzono za pomocą osmometru 1. Nie jest konieczne używanie osmometru, jeśli te przepisy są dokładnie przestrzegane i należy zachować ostrożność przy przygotowywaniu tych odczynników. Należy jednak użyć osmotera, jeśli konieczne jest przygotowanie innych roztworów, których receptury nie są podane tutaj ani w żadnej z publikacji, w których wykorzystuje się hodowane komórki C. elegans.

2. Izolacja jaj

  1. Zaleca się rozpoczęcie od co najmniej czterech 8P płytki do zebrania wystarczającej ilości jaj do 12 dołków hodowanych komórek (na płytkach 24-dołkowych).
  2. Przed rozpoczęciem zabiegu rozmrozić jedną tubkę roztworu podstawowego lektyny z orzeszków ziemnych. Umieścić autoklawowane szkiełka nakrywkowe na dnie studzienek na 24-dołkowej płytce i dodać do nich 200 μl lektyny z orzeszków ziemnych. Inkubować przez 1 godzinę lub do momentu, gdy komórki będą gotowe do posiewu. Całkowicie usuń lektynę z orzeszków ziemnych i umyj studzienki raz 1 ml sterylnej wody sterylizowanej w autoklawie. Całkowite usunięcie lektyny z orzeszków ziemnych ze szkiełek nakrywkowych jest niezbędne do uniknięcia zbrylania się komórek.
  3. Zmyj ciężarne dorosłe osobniki z płytek agarowych sterylną wodą w autoklawie. Zebrać zawiesinę do dwóch sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Pozostaw probówki na lodzie na maksymalnie 5 minut, aby umożliwić wytrącenie się robaków na dnie probówek (*). Usuń wodę za pomocą plastikowej pipety transferowej i zastąp ją świeżą, sterylną, autoklawowaną wodą. Robaki granulowane przez wirowanie na stole przy 200 x g (~1,200 obr./min) przez 10 min (*). Powtórz ten ostatni krok co najmniej 3.
  4. Przenieś robaki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i granuluj je w ilości 200 x g (~1,200 obr./min) przez 10 minut (*). Nie używaj większej prędkości wirowania, aby uniknąć gromadzenia się bakterii również na dnie probówki. Czasami po odwirowaniu robaki nie są całkowicie granulowane. Po każdym przemyciu, a przed usunięciem supernatantu, umieść probówki na 5 minut na lodzie. W schłodzonej wodzie robaki wytrącają się na dno rurki.
  5. Usuń wodę i dodaj 5-6 ml roztworu do lizy (patrz Przygotowanie materiału). Delikatnie kołysz zawiesiną przez 5-10 minut, a następnie rozpocznij monitorowanie lizy robaków pod mikroskopem stereoskopowym co 2-3 minuty. Kroplę zawiesiny można również umieścić na szkiełku nakrywkowym w celu łatwiejszej kontroli. Czas inkubacji różni się w zależności od świeżości wybielacza; Kupuj małe butelki wybielacza i co miesiąc otwieraj nową butelkę.
  6. Gdy ~70-80% robaków zostanie poddanych lizie (10 minut od początku inkubacji), zatrzymaj reakcję lizy, dodając 9 ml buforu jajowego o pH 7,3 (patrz Przygotowanie materiału). Odwirować zawiesinę przy 200 x g (~1 200 obr./min) przez 10 min. Od tego momentu należy mieć włączony palnik Bunsena na stole, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu jaj (*).
  7. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej i przemyć osad 3-4x buforem do jaj, aż roztwór będzie klarowny. Upewnij się, że dobrze wymieszałeś granulki w buforze do jaj podczas każdego mycia.
  8. Jaja oddziela się od tusz zwierzęcych za pomocą 30% roztworu sacharozy. Zawiesić osad w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodać 2 ml 60% roztworu sacharozy (zapas w sterylnym buforze do jaj). Dobrze wymieszać i odwirować przez 20 minut przy 200 x g (~1,200 obr./min) (*).
  9. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Jaja unoszą się na górze roztworu. Za pomocą pipety P1000 i sterylnych końcówek przenieś wszystkie jaja do świeżej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
  10. Dodać 10 ml sterylnego buforu do jaj do probówki i wirować przy 200 x g (~1,200 obr./min) przez 10 min. Powtórzyć mycie 3 razy. Upewnij się, że jaja są całkowicie zawieszone w buforze jaj podczas każdego mycia.

3. Dysocjacja komórek embrionalnych

Przeprowadź następne kroki procedury w sterylnych warunkach, używając okapu z przepływem laminarnym. Podczas gdy zwierzęta są ubrane na talerzach bakteryjnych, mycie i leczenie roztworem do lizy zawierającym wybielacz powinno wyeliminować większość, jeśli nie wszystkie bakterie. W ten sposób użycie kaptura laminarnego na tym etapie procedury zapobiega ponownemu zanieczyszczeniu zawiesiny jaj

.
  1. Zawiesić jaja granulowane w 1 ml chitynazy o stężeniu 2 mg/ml (zapas w buforze jaj o pH 6,5 (*)) i przenieść je do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Kołysz rurką przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Dokładny czas inkubacji zmienia się w zależności od świeżości enzymu i temperatury w pomieszczeniu i dlatego powinien być określony dla każdego preparatu. Zaleca się rozpoczęcie monitorowania jaj pod mikroskopem odwróconej hodowli komórkowej po 10 minutach inkubacji. Uwaga: z naszego doświadczenia wynika, że niskie pH zwiększa aktywność enzymatyczną chitynazy. Z tego powodu używamy buforu jaj o pH 6,5 do rozpuszczenia chitynazy (przepis opisany powyżej, gdzie pH dostosowuje się do 6,5 za pomocą NaOH).
  2. Gdy ~ 80% skorupek jaj zostanie strawionych przez obróbkę chitynazą (rysunki 1 A-B), jaja osadzać przez odwirowanie przy 900 x g (~2,500 obr./min) przez 3 minuty (*). Używając pipetora P1000 i sterylnych końcówek, ostrożnie usunąć supernatant i dodać 3 ml pożywki L-15 (*).
  3. Przenieś jaja na płytkę o średnicy 6 cm i delikatnie rozdziel komórki za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 18 G. Monitorować stopień dysocjacji, umieszczając kroplę zawiesiny na świeżej plastikowej szalce Petriego i oglądając pod mikroskopem. Nie należy zasysać powietrza do strzykawki podczas tej procedury, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Kontynuuj dysocjację, aż ~ 80% komórek zostanie zdysocjowanych.
  4. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sterylnego filtra miliporowego 5 μm. Zawiesiny komórkowe muszą być filtrowane w celu usunięcia grudek komórek, niestrawionych jaj i wyklutych larw. Przefiltruj dodatkowe 4-5 ml świeżej pożywki L-15 przez filtr, aby odzyskać wszystkie komórki. Nie używaj nadmiernej siły na etapie filtracji, aby uniknąć uszkodzenia filtra i/lub komórek.

4. Hodowla komórek

  1. Zdeocjowane komórki osadzać przez odwirowanie przy 900 x g (~2,500 obr./min) przez 3 minuty (*). Za pomocą pipetora P1000 i sterylnych końcówek ostrożnie usuń cały supernatant. Zawiesić granulowane komórki w kompletnym podłożu L-15 i płytce 1 ml/dołek. Ilość dodanego podłoża zależy od liczby 8P użytych płytek, zbieganie się robaków na płytkach oraz rodzaj eksperymentów, które zostaną przeprowadzone na komórkach. Gęstość komórek można określić za pomocą hemocytometru. W przypadku nagrań typu patch-clamp optymalna jest gęstość powlekania ~ 230 000 komórek/cm2.
  2. Przechowywać 24-dołkową płytkę w plastikowym pojemniku Tupperware zawierającym mokre ręczniki papierowe, aby uniknąć odparowania pożywki hodowlanej. Przechowywać pojemnik w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 20 °C i przy obecności powietrza atmosferycznego.
  3. Komórki są zwykle gotowe do eksperymentów w ciągu 24 godzin, kiedy różnicowanie morfologiczne i ekspresja markerów GFP są zakończone. Komórki można przechowywać w hodowli do 2 tygodni, ale zwykle są one najzdrowsze do 7-9 dni po posiewie. Pożywkę należy wymieniać raz dziennie, aby utrzymać zdrowe komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

C. elegans hodowane komórki różnicują się i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla komórek

Christensen i współpracownicy, stosując barwienie błęknitem trypanowym, wykazali, że >99% embrionalnych komórek C. elegans przeżywa procedurę izolacji. W 9. i 22. dniu po wysiewaniu, odpowiednio 85% i 65% komórek nadal pozostaje żywych 1. Izolowane embrionalne komórki C. elegans muszą przywrzeć do podłoża, aby mogły ulec różnicowaniu. Komórki, które nie przywi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

C. elegans jest potężnym organizmem modelowym do rozszyfrowywania szlaków genetycznych zaangażowanych w rozwój, zachowanie i starzenie się. Jego wygoda wynika przede wszystkim z łatwości, z jaką można go genetycznie zmanipulować, oraz z jego krótkiego cyklu życia. Pomimo swojej wygody, C. elegans ma swoje ograniczenia. Komórki C. elegans są maleńkie i zamknięte w naskórku pod ciśnieniem, co ogranicza stosowanie metod wymagających bezpośredniego dostępu do komórek, takich jak techniki elektrofiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Agar Difco GranulowanyVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Ekstrakt z drożdży baktonowychVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) PłynInvitrogen11415-064
Surowica bydlęcapłodu Invitrogen16140-063
Penicylina-streptomycynaSigmaP4333-100ML
Chitynaza ze Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Centrum
Lektyna z orzeszków ziemnychSigmaL0881-10MG
SacharozaSigma57903-1KG
D-(+)GlukozaSigma67528-1KG
Glikol etylenowy-bis (2-amina– kwas tetrakwasowy (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Cholesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Autoklawowany etanol
destylowany H2O
Wybielacz
EQUIPMENT
101-1000 μ l Niebieskie końcówki do pipet z podziałkąUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterylizowana pipeta pakowana pojedynczoUSA Scentific1071-0810
Ergonomiczna zmienna objętość (100-1000 μ l) Pipetor z wyrzutnikiem końcówekVWR International Inc.89079-974
Przenośny przyrząd do pipetowania, DrummondVWR International Inc.53498-103
Sterylna pipeta transferowa z tworzywa sztucznegoVWR International Inc.14670-114
15 ml Rurka stożkowa USA Scentific1475-1611
50 ml Rurka stożkowaUSA Scentific1500-1811
Sterylne igły o rozmiarze 18Becton, Dickinson and Co.
Sterylne strzykawki 10 mlBecton, Dickinson and Co.
Plastikowe filtry strzykawkowe Corning 0,20 μ m wielkość porów Corning431224
Acrodic 25 mm Filtr strzykawkowy z 5 μ m versapor MembranaVWR International Inc.28144-095
60x15 mm szalka Petriego sterylnaVWR International Inc.82050-548
Szalka Petriego 100x15 mm SterylnaVWR International Inc.82050-912
Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mmVWR International Inc.48300-560
Przezroczyste płytki do hodowli komórkowych 24-dołkowe płaskie dno z pokrywką Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Drobne kleszcze Narzędzia do nauki11254-20
Wirówka 5702Eppendorf022629883
przepływem laminarnym
obiektywem
z nawilżanym powietrzem otoczenia
Genetyki305196305482 o wysokiej jakości Odwrócony mikroskop z z x10Inkubator

Bibliografia

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135(2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42(2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020(2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki embrionalne C. elegansizolacja jajtraktowanie chitynaządysocjacja manualnahodowla komórkowaimmunofluorescencjamikroskopiaelektrofizjologiaobrazowanie wapniapatch clamp
Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.