Artykuł metodologiczny

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

DOI:

10.3791/50658

⸱

7 października 2013

 ,  ,  ,  , 
1Surgery Unit, Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital, University College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna inżynieria tkankowa polega na połączeniu rusztowań z odpowiednimi komórkami in vitro lub in vivo. Rusztowania mogą być syntetyczne, pochodzenia naturalnego lub pochodzące z tkanek/narządów. Te ostatnie uzyskuje się za pomocą techniki zwanej decelularyzacją. Decelularyzacja może obejmować połączenie metod fizycznych, chemicznych i enzymatycznych. Celem tej techniki jest usunięcie wszystkich śladów komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu makro- i mikroarchitektury pierwotnej tkanki.

Inżynieria tkankowa jelit do tej pory używała stosunkowo prostych rusztowań, które nie odtwarzają skomplikowanej architektury rodzimego organu. Celem tego artykułu jest opisanie skutecznej techniki decelularyzacji jelita cienkiego szczura. Opisano izolację jelita cienkiego w celu zapewnienia utrzymania połączenia naczyniowego. Przedstawiono również kombinację roztworów chemicznych i enzymatycznych w celu usunięcia komórek przy jednoczesnym zachowaniu osi kosmek-krypta w aspekcie świetlnym rusztowania. Na koniec omówiono ocenę produkowanych rusztowań pod kątem odpowiednich charakterystyk.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkankowa (TE) stanowi terapeutyczną alternatywę dla transplantacji narządów, omijając problemy immunosupresji i niedoboru narządów. TE ma ostatnio udane zastosowania w klinice, z wymianą narządów, takich jak pęcherzmoczowy 1, cewka moczowa2 i tchawica, zarówno u dorosłych3,4, jak i dzieci5.

Budowa organu inżynierii tkankowej wymaga połączenia rusztowania z odpowiednimi komórkami. Rusztowanie można przygotować przy użyciu składników pochodzenia naturalnego (np. kolagen) i syntetycznych (np. kwas poli-L-glikolowy; PLGA) lub być otrzymywane przez decelularyzację natywnych narządów i tkanek. Rusztowania, które do tej pory były stosowane w leczeniu TE w jelitach, były głównie pozbawione komórek (błona podśluzowa jelita cienkiego) lub syntetyczne (kwas poli-L-glikolowy i kwas polimlekowy)6-13. Te biomateriały są bardzo proste zarówno pod względem makro, jak i mikroarchitektury, co może nie być idealne, jeśli jelito modyfikowane tkankowo ma być klinicznie translowane. Optymalny biomateriał dla jelita powinien mieć wrodzone drzewo naczyniowe, które można podłączyć do dopływu krwi gospodarza, wielopoziomową ścianę rurkową o różnych właściwościach, które odbijają warstwy ściany jelita oraz oś kosmka-krypta po stronie światła, aby pomóc w ponownym zasiedleniu przez nabłonkowe komórki macierzyste.

Decelularyzacja to nowatorska metodologia, która tworzy rusztowania poprzez usuwanie komórek z całych narządów, zachowując ich oryginalną architekturę14. Jest to lepsze niż już istniejące rusztowania, ponieważ nie tylko replikują strukturę narządu, ale także zawierają sygnały chemiczne osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które wspomagają proliferację i różnicowanie komórek. W 2008 r. tchawica zwłok została pozbawiona komórek14, obsiana własnymi komórkami pacjenta i przeszczepiona w celu zastąpienia głównego lewego oskrzela u młodego mężczyzny3. Od tego czasu wiele grup zgłosiło produkcję bezkomórkowych rusztowań dla serca15, wątroby16,17 i płuc18-20 u małych i dużych zwierząt.

Dostosowaliśmy również tę samą metodologię do produkcji rusztowania bezkomórkowego dla jelita cienkiego21. Celem opisanej w niniejszym dokumencie metody jest wytworzenie bezkomórkowych matryc jelitowych, które zachowują makroskopowe cechy oryginalnej tkanki, takie jak ukrwienie, a także mikroskopijną architekturę osi kosmek-krypta w świetle jelita. Uważamy, że ta metodologia może ostatecznie zostać zastosowana w innych narządach w celu poprawy skuteczności decelularyzacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja jelita szczura

  1. Przygotuj 1 l roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (Sigma, Wielka Brytania) z 1% antybiotykiem/antybiotykiem (Sigma, Wielka Brytania) (PBS/AA). Zamontuj pompę perystaltyczną (Masterflex L/S o zmiennej prędkości) z dwiema rurkami. Przepuścić 70% etanolu (EtOH) przez rurki pompy perystaltycznej przez 15 minut z maksymalną prędkością, a następnie PBS/AA przez kolejne 15 minut.
  2. Poddaj eutanazji dorosłe szczury Sprague-Dawley o wadze około 250-350 g poprzez wdychanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z lokalnymi wytycznymi i zezwoleniami dla zwierząt (w Wielkiej Brytanii wytyczne Ministerstwa Spraw Wewnętrznych na mocy ustawy o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r.).
  3. Autoklaw narzędzi chirurgicznych przed użyciem. Spryskaj i wytrzyj brzuch zwierzęcia za pomocą 70% EtOH.
  4. Wykonaj laparotomiczne nacięcie xifo-łonowe na brzuchu, aby zapewnić czyste pole operacyjne.
  5. Wypatroszyć jelito cienkie po prawej stronie zwierzęcia na ręcznik papierowy spryskany 70% EtOH. Należy pamiętać o ciągłym zwilżaniu jelita PBS/AA, aby uniknąć odwodnienia tkanki i denaturacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
  6. Zlokalizuj tętnicę krezkową górną (SMA) powstającą pod kątem 90° od aorty w kierunku jelita. Użyj kaniuli 27 G, aby wprowadzić się do SMA z aorty i szybko wycofaj igłę, aby uniknąć rozerwania ściany naczynia. Wsuń plastikową rurkę kaniuli do SMA i zabezpiecz za pomocą szwów (Vicryl 5/0).
  7. Potwierdź kaniulację, wstrzykując 1 ml PBS/AA. Za pomocą nożyczek sprężynowych naciąć aortę proksymalną i dystalną do SMA, aby uwolnić kaniulę.
  8. Aby uniknąć wycieku kału podczas wycinania jelita grubego, umieść jeden węzeł szwu (Silk 5/0) na bliższym końcu połączenia krętniczo-kątniczego i jeden na dystalnym końcu esicy. Następnie przetnij końcowe jelito kręte i okrężnicę między dwoma węzłami i usuń jelito grube.
  9. Przeciąć jelito na połączeniu jelita czczego i dwunastnicy i uwolnić jelito od wszelkich połączeń tkanki łącznej, które może mieć z jamą brzuszną.
  10. Przenieść jelito cienkie na szalkę Petriego z PBS/AA. Kankaniuluj proksymalny odcinek jelita za pomocą plastikowej pipety Pasteura (LSL Laboratory Consumables) i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą szwów. Przyciąć pipetę tak, aby pasowała do Luer-Lok strzykawki o pojemności 60 ml (BD Plastipak). Przepłucz światło jelita 2x 60 ml PBS/AA w celu usunięcia kału i zanieczyszczeń.

2. Metodologia decelularyzacji

  1. Podłącz kaniulę naczyniową do trójdrogowego kranu. Ułatwi to obsługę, zminimalizuje naprężenia na drzewie naczyniowym i umożliwi usunięcie pęcherzyków z rurki.
  2. Rozpocznij przepuszczanie wody dejonizowanej (rezystywność 18,2 MΩ/cm) przez pompę rolkową Masterflex L/S o zmiennej prędkości z prędkością 0,6 ml/h. Upewnij się, że w rurce nie ma pęcherzyków przed podłączeniem do kurka światła jelitowego. Niektóre pęcherzyki mogą być obecne w świetle od kroku 1.9, co może upośledzać proces decelularyzacji. Zmieniaj prędkość pompy i ostrożnie obchodź się z tkanką kleszczami, aby upewnić się, że pęcherzyki wydostają się z dystalnego końca. Nie podłączaj kaniuli naczyniowej, dopóki ten proces nie zostanie zakończony, ponieważ duże prędkości mogą uszkodzić drzewo naczyniowe.
  3. Przenieść aparaturę do chłodni, ponieważ następny etap decelularyzacji przeprowadza się w temperaturze 4 °C. Niska temperatura pozwala na usunięcie komórek przy jednoczesnym zminimalizowaniu rozkładu tkanek. Umieść szalkę Petriego w pojemniku, który zbierze przelewający się roztwór. Perfuzję zarówno światła jelita, jak i drzewa naczyniowego wodą dejonizowaną (rezystywność 18,2 MΩ/cm) przez 24 godziny przy 0,6 ml/h. Przez pierwszą godzinę regularnie sprawdzaj aparat, aby upewnić się, że wszystkie połączenia są bezpieczne, wyciek jest minimalny, a w jelicie nie ma pęcherzyków.
  4. Po 24 godzinach leczenia wodą dejonizowaną należy przenieść aparat do decelularyzacji na zewnątrz chłodni, ponieważ pozostałe etapy są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Zważyć deoksycholan sodu (Sigma, Wielka Brytania), aby przygotować 300 ml 4% roztworu w wodzie dejonizowanej. Zważyć deoksycholan sodu pod ssawką, ponieważ działa drażniąco na jamę ustną i oczy. Mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Roztwór można utrzymywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  6. Zamień roztwór dejonizowany na deoksycholan sodu, sprawdź połączenia, usuń wszelkie pęcherzyki i perfuzuj w tempie 0,6 ml/h przez 4 godziny.
  7. Po etapie deoksycholanu sodu przemyć PBS/AA przez 30 minut, aby uniknąć interakcji między deoksycholanem sodu a DNazą-I.
  8. Odważyć dezoksyrybonukleazę-I (DNazę-I, Sigma) i przygotować 250 ml roztworu o stężeniu 2 000 kU w 1 M chlorku sodu o pH 7,4. Mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i nie można go przechowywać.
  9. Utylizować z DNazą-I przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z prędkością 0,6 ml/h.
  10. Postępując zgodnie z krokiem DNase-I, przenieś rusztowanie do okapu do hodowli tkankowej i zmień płytki i narzędzia. Zaleca się stosowanie techniki aseptycznej.
  11. Myć PBS/AA przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie pozostałości roztworów decelularyzacyjnych zostały usunięte. Umieść rusztowanie na nowej szalce Petriego i przenieś do urządzenia sieciującego UV (Spectroline, USA). Uruchom dwa cykle sterylizacji. Przechowywać w 5% PBS/AA i zmieniać roztwór co 3 dni.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po udanej decelularyzacji (Rysunek 1), rusztowanie powinno mieć makroskopowy wygląd podobny do tego z jelita rodzimego, ale z półprzezroczystymi ściankami (Rysunek 2A). Zachowanie makroarchitektury powinno być również widoczne w drożności drzewa naczyniowego. Gdy barwnik jest wstrzykiwany przez kaniulę SMA, powinien równomiernie rozprowadzić się po rusztowaniu i dotrzeć do drzewa kapilarnego (ryc. 2B). Rusztowanie powinno być wolne od materiału jądrowego i cytoplazmatycznego, co można ocenić za pomocą zestawu do kwantyfikacji DNA i prostej analizy histologicznej. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) powinno wykazać brak materiału jądrowego i cytoplazmatycznego przy jednoczesnym zachowaniu warstw jelita cienkiego (ryc. 3A). W szczególności utrzymanie kosmków i krypt po stronie światła powinno być widoczne po skaningowej mikroskopii elektronowej (ryc. 4). Należy również spodziewać się zachowania składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, elastyna i glikozaminoglikany. Na przykład barwienie trichromowe Massona pokazuje nienaruszoną tkankę łączną w rusztowaniu (ryc. 3B).

figure-results-1
Rysunek 1. Plan eksperymentalny. Kalendarium procedury decelularyzacji; PBS/AA: sól fizjologiczna buforowana fosforanami z antybiotykiem-antybiotykiem, NaDeoxy: deoksycholan sodu, RT: temperatura pokojowa, DNAse-I: dezoksyrybonukleaza-I. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-2
Rysunek 2. Charakterystyka makroskopowa rusztowania. Makroskopowy obraz jelita cienkiego szczura po udanej decelularyzacji (A). Wstrzyknięcie barwnika Rosso Ponceau przez SMA wykazuje nienaruszoną sieć naczyniową (B) ; SMA: tętnica krezkowa górna Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-3
Rysunek 3. Histologia. Zabarwienie H&E (A) i MT (B) wskazuje na brak materiału komórkowego przy zachowaniu architektury tkanki łącznej; H&E: hematoksylina i eozyna, MT: trichrom Massona. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

figure-results-4
Rysunek 4. Mikroskopia elektronowa. Skaningowa mikroskopia elektronowa wskazuje na zachowaną architekturę kosmków-krypt w świetle rusztowania; Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najtrudniejsze kroki w przygotowaniu tego eksperymentu obejmują kaniulację SMA oraz ustanowienie i utrzymanie sterylności. Kaniulacja SMA u gryzoni bez pęknięcia ściany może być dość trudna ze względu na rozmiar i położenie naczynia. Alternatywnie, szew może być założony wokół bliższej aorty przed powstaniem SMA, a następnie kaniulacja samej aorty dystalnie, kierując plastikową kaniulę do SMA. Podczas decelularyzacji połączenie złego ułożenia kaniuli i wysokich prędkości przepływu może spowodować utratę dostępu naczyniowego. Bezpłodność jest poważnym problemem ze względu na ilość flory bakteryjnej obecnej w jelicie cienkim. Mycie PBS/AA po zbiorach jest bardzo ważne, a wszelkie ślady kału lub zanieczyszczeń należy usunąć ze światła. Umieszczenie części rusztowania w probówce sokoła z DMEM w inkubatorze po sterylizacji UV powinno być wskaźnikiem, czy osiągnięto sterylność. W przypadku kolonizacji bakteryjnej pożywka zmieni pH, a jego kolor zmieni się z czerwonego na żółty. Aby sobie z tym poradzić, zaleca się dalsze cykle UV, a także mycie PBS zawierającym wysokie stężenie antybiotyku/antybiotyku.

Możliwą modyfikacją w celu uzyskania rusztowania z dostępem zarówno naczyniowym, jak i żylnym byłaby kanniulacja żyły głównej dolnej (IVC), a także SMA. Decelularyzacja od strony żylnej i naczyniowej powinna być podejmowana z przerwami dla wszystkich trzech roztworów. Ciągła decelularyzacja może spowodować pęknięcie naczyń włosowatych poprzez dodatnie ciśnienie po obu stronach.

Na przestrzeni lat podjęto szereg wysiłków w zakresie TE jelitowego przy użyciu różnych kombinacji komórek i rusztowań in vitro i in vivo6,9,12. Większość prac została wykonana przy użyciu rusztowań z włókniny rurkowej 95% PGA-5% PLGA pokrytych kolagenem typu I6,7,13,22. Po wysianiu za pomocą nabłonkowych jednostek organoidowych nabłonka jelitowego (OU) i okresie implantacji w sieci myszy, tworzą torbiele z mięśniami na zewnątrz i nabłonkiem wewnątrz, które można następnie zrurkować. Jednak porowatość i prostota konstrukcji tych rusztowań nie pozwala na wytwarzanie dużych fragmentów sztucznego jelita w środowisku in vitro , takim jak bioreaktor. Dodatkowo, brak wrodzonej sieci naczyniowej, którą można połączyć z biorcą, dodatkowo ogranicza użycie tego rusztowania do tłumaczenia klinicznego. Oprócz eksperymentów z rusztowaniami PGA-PLGA, inne grupy używały rusztowań kolagenowych lub SIS, które nie odtwarzają złożoności przewodu pokarmowego. W szczególności SIS jest jedyną wcześniej opublikowaną metodologią inżynierii tkanki jelitowej i była stosowana w ponad 150 środowiskach medycznych, wykazując zdolność rusztowań bezkomórkowych do zapewniania stabilności mechanicznej i promowania wzrostu komórek, jednocześnie prowadząc do braku odpowiedzi immunogennej. Jednak brak odpowiedniej makro- i mikroarchitektury doprowadził do słabych wyników w jego stosowaniu do celów jelitowych TE9-11,23.

Korzyści płynące z opisanej przez nas metodologii decelularyzacji obejmują zachowanie cech mikroskopowych, takich jak architektura kosmków krypty świetlnej, które reprezentują odpowiednie środowisko do ponownego zasiedlenia przez niszę jelitowych komórek macierzystych. W aspekcie makroskopowym obecność hierarchicznej sieci naczyniowej umożliwi przywiązanie do biorcy, umożliwiając dostarczanie składników odżywczych i tlenu do wszystkich warstw jelita TE21. Co więcej, utrzymanie składników ECM, takich jak kolagen, elastyna i gliokozaminoglikany, odgrywa ważną rolę nie tylko dla właściwości mechanicznych, ale także dla kierowania proliferacją i różnicowaniem komórek. Co najważniejsze, zdolność metodologii decelularyzacji do skalowania do większych tkanek przy zachowaniu tych samych cech jest ważną cechą dla klinicznego translacji TE.

Opracowanie naturalnej macierzy jelitowej z siecią naczyniową pozwala na tworzenie większych segmentów sztucznego jelita, które można połączyć z gospodarzem.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Instytutowi Medycyny Regeneracyjnej Wake Forest za pomoc w opracowaniu tego protokołu. Dziękujemy za wsparcie w postaci dotacji od organizacji charytatywnej Great Ormond Street Hospital, Fundacji Eugenio Litta (Genewa, Szwajcaria), Rady Badań Medycznych, Królewskiego Kolegium Chirurgów Anglii, Sparks Children's Medical Charity, brytyjskiego Ministerstwa Spraw Zagranicznych na rzecz brytyjsko-amerykańskiej współpracy w dziedzinie komórek macierzystych oraz Mittal Research Fund. Dziękujemy również Royal Society/ Wolfson Foundation za uzyskany grant na remont laboratorium inżynierii tkankowej dla Oddziału Chirurgii Dziecięcej w Instytucie Zdrowia Dziecka. PDC i SE są wspierane przez Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór etanolu, 70% w H20Sigma02877
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanamiSigma79382
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100x)SigmaA5955
Deoksycholan soduSigmaD6750Działa drażniąco na jamy ustne i oczy; ochrona użytkowania
Chlorek
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydłaSigmaD5025
sodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  2. Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
  3. Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  4. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  5. Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
  6. Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
  7. Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
  8. Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
  9. Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
  10. Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
  11. Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
  12. Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
  13. Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. Angiogenesis in tissue-engineered small intestine. Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).
  14. Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  16. Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
  17. Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).
  18. Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  19. Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
  20. Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. Procedure for lung engineering. J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).
  21. Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
  22. Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
  23. Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Naturalne rusztowanie acelularnein ynieria tkankowa jelitjelito cienkie szczurakaniulacja t tnicy krezkowej g rnejperfuzja za pomoc pompy perystaltycznejtraktowanie wod dejonizowantraktowanie deoksycholanem sodutraktowanie DNazanaliza histologiczna

Powiązane artykuły