Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

16.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50662

⸱

1 sierpnia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich patogennych wirusów arenawirusowych.

Streszczenie

Rozwój i implementacja genetyki odwróconej arenawirusa stanowi znaczący przełom w dziedzinie arenawirusów 4. Wykorzystanie komórkowych systemów minigenomu arenawirusa wraz ze zdolnością do generowania rekombinowanych zakaźnych arenawirusów z wcześniej określonymi mutacjami w ich genomach ułatwiło zbadanie udziału determinantów wirusa w różnych etapach cyklu życiowego arenawirusa, a także interakcji wirus-gospodarz i mechanizmów patogenezy arenawirusa 1, 3, 11 . Ponadto opracowanie trójsegmentowanych arenawirusów umożliwiło wykorzystanie genomu arenawirusa do ekspresji dodatkowych obcych genów będących przedmiotem zainteresowania, otwierając w ten sposób możliwość stosowania wektorów szczepionkowych opartych na arenawirusach 5 . Podobnie opracowanie jednocyklowych zakaźnych arenawirusów zdolnych do ekspresji genów reporterowych stanowi nowe narzędzie eksperymentalne poprawiające bezpieczeństwo badań z udziałem wysoce zjadliwych ludzkich arenawirusów 16 . Wytwarzanie rekombinowanych arenawirusów przy użyciu technik genetyki odwrotnej opartej na plazmidzie do tej pory opierało się na wykorzystaniu linii komórkowych gryzoni 7,19 , co stanowi pewne bariery dla rozwoju szczepionki lub wektorów szczepionkowych licencjonowanych przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). Aby pokonać tę przeszkodę, opisujemy tutaj wydajne wytwarzanie rekombinowanych arenawirusów w zatwierdzonych przez FDA komórkach Vero.

Wprowadzenie

Arenawirusy to wirusy otoczkowe z dwusegmentowym, ujemnym genomem RNA 3, które należą do rodziny Arenaviridae. Genom arenawirusa koduje cztery białka w sposób ambisensowny z dwóch oddzielnych segmentów wirusa 3. Duży (L) segment koduje zależną od RNA polimerazę RNA (L) i małe białko palca (Z) RING (Really Interesting New Gene), które służy jako główna siła napędowa pączkowania wirusa. Mały (S) segment koduje nukleoproteinę wirusa (NP) i glikoproteinę powierzchniową (GP) (ryc. 1).

Kilku członków rodziny Arenaviridae jest odpowiedzialnych za śmiertelną gorączkę krwotoczną (HF) u ludzi 3. Zasadniczo obawy budzi wirus Lassa (LASV) i wirus Junín (JUNV), o których wiadomo, że powodują wysoką śmiertelność u hospitalizowanych pacjentów 8, 9 . Chociaż wirusy te są endemiczne odpowiednio dla Afryki Zachodniej i obszarów wiejskich Argentyny, rosną obawy o import LASV i JUNV na obszary nieendemiczne ze względu na zwiększone podróże 10. Ponadto, chociaż zwykle nie wiąże się z ciężką chorobą u ludzi, prototypowy wirus limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV) arenawirusa jest uważany za zaniedbywany patogen, ponieważ zdarzały się przypadki śmiertelnego zakażenia u pacjentów z obniżoną odpornością 6, 15 i jest odpowiedzialny za wrodzone wady wrodzone i samoistne poronienia u kobiet w ciąży 2, 13 . Obecnie nie ma zatwierdzonych przez amerykańską FDA szczepionek przeciwko arenawirusom, a leczenie ogranicza się do analogu nukleozydu rybawiryny, który jest tylko częściowo skuteczny i często wiąże się ze znacznymi skutkami ubocznymi.

Wprowadzenie genetyki odwrotnej opartej na plazmidzie 4 i generacja rekombinowanych arenawirusów 7, 19 znacznie posunęły naprzód dziedzinę badań nad arenawirusami. Obecnie komórki gryzoni (takie jak BHK-21) są wykorzystywane do wytwarzania rekombinowanych arenawirusów ze względu na specyficzny dla gatunku mysi promotor polimerazy RNA I (POL-I), kierujący początkową transkrypcją segmentów S i L. Jednak ratowanie wirusów w komórkach BHK-21 nie jest zatwierdzoną metodą generowania rekombinowanych arenawirusów jako potencjalnych kandydatów na nasiona szczepionek. Dokumentujemy tutaj użycie ludzkiego promotora pol-I do skutecznego ratowania prototypowego szczepu LCMV Starego Świata (OW) i Nowego Świata (NW) JUNV Candid#1 w komórkach Vero. Korzystając z podobnej metodologii, wygenerowaliśmy rekombinowane trójsegmentowe arenawirusy LCMV (r3LCMV) i Candid#1 (r3Candid#1), które zawierają dwa dodatkowe obce geny kodowane w dwóch różnych segmentach S RNA 5 . Ten nowy system nie tylko opiera się na wysoce powtarzalnym i prostym protokole, ale może być natychmiast wdrożony do generowania rekombinowanych arenawirusów jako potencjalnych szczepionek lub nasion wektorów szczepionkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transfekcja ratunkowa Arenavirus

Nasz system ratunkowy opierał się na wykorzystaniu zarówno plazmidów ekspresyjnych białka polimerazy II kodujących nukleoproteinę (NP), jak i zależnej od RNA polimerazy RNA (L), wirusowych czynników transaktywnych wymaganych do replikacji RNA i ekspresji genów w genomie arenawirusa 7, 19 oraz plazmidów zdolnych do kierowania syntezą wewnątrzkomórkową, poprzez komórkową polimerazę RNA I I POL-I, antygenomu gatunków RNA 7 . W naszych badaniach używamy plazmidu ekspresji białka pCAGGs, który wykorzystuje sekwencje sygnałowe promotora β-aktyny i poliadenylanacji (pA) kurczaka oraz ludzki plazmid pol-I, który wykorzystuje sekwencje ludzkiego promotora polimerazy I i mysiego terminatora (Figura 2). Segmenty S i L RNA są klonowane do plazmidu hpol-I w orientacji antygenomicznej, aby umożliwić generowanie segmentów genomowego RNA po transkrypcji przez hpol-I. W celu uratowania rekombinowanego LCMV typu dzikiego (rLCMV) i Candid#1 (rCandid#1), pCAGGs, NP i L z każdego wirusa były kotransfekowane wraz z odpowiednimi ludzkimi segmentami pol-I, S i L RNA (Figura 3). Generowanie rekombinowanych trójsegmentowych LCMV (r3LCMV) i Candid#1 (r3Candid#1) przebiegało według podobnego protokołu, ale segment S został podzielony na dwa różne plazmidy pol-I S, z których każdy kodował charakterystyczny gen reporterowy: w jednym z nich otwarta ramka odczytu NP (ORF) została zastąpiona genem reporterowym zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) (hpol-I S GFP / GP) i, w drugim prekursor glikoproteiny wirusa (GPC) ORF jest zastąpiony genem reporterowym lucyferazy Gaussia (Gluc) (hpol-I S NP/Gluc). Schematyczne przedstawienie protokołu przedstawiono na rysunku 4. Dla płytek 6-dołkowych ustalono następujący protokół transfekcji i infekcji

.
  1. Mieszanina OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000): Przygotować 250 μl pożywki OptiMEM i, w zależności od sposobu usunięcia wirusa, 10 - 12 μg LPF2000 (1 μg/μl) na transfekcję (tabela 1). Zalecany jest stosunek 2,5 μg LPF2000 na μg DNA. Inkubować przez 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotować mieszaninę transfekcji plazmidu w oddzielnej probówce do mikrowirówek (krok 1.2).
  2. Mieszanina do transfekcji plazmidowego DNA: Przygotować koktajl transfekcji plazmidu w probówce mikrowirówkowej, używając zalecanych ilości dla każdego ratowanego wirusa (patrz Tabela 1). Doprowadzić ostateczną objętość do 50 μl za pomocą OptiMEM.
  3. Mieszanina plazmidu OptiMEM-LPF2000-DNA: Dodać 250 μl mieszaniny OptiMEM-LPF2000 (etap 1.1) do mieszaniny transfekcji plazmidowego DNA (etap 1.2). Inkubować tę mieszaninę przez 20 - 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj i policz 1 x 106 komórek Vero na reakcję transfekcji. Komórki Vero zostaną transfekowane w zawiesinie.
  4. Przygotowanie komórek Vero: Komórki Vero są hodowane w szalkach o średnicy 100 mm. Przed rozpoczęciem doprowadzić 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS i mieszaninę trypsyna-EDTA do 37 °C.
    1. Umyj komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS.
    2. Trypsynizować komórki za pomocą 1 ml trypsyny-EDTA i czekać, aż komórki się oderwą (około 5 minut). Może być konieczne delikatne stukanie, aby całkowicie oderwać komórki od naczyń.
    3. Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować komórki przez 5 minut z prędkością 1 000 obr./min w wirówce.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru i dostosować stężenie do 1 x 106 komórek/ml. Zaobserwowano, że 0,5 - 1 x 106 komórek Vero na transfekcję dawało najlepsze wyniki.
  5. Wymieszaj LPF2000/DNA i komórki: Po 20 - 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej (krok 1.3) dodać 1 ml komórek Vero (1 x 106) (krok 1.4) do mieszaniny plazmidu OptiMEM-LPF2000-DNA i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Mieszanka LPF2000 nasienna / DNA z komórkami na płytkach 6-dołkowych: Dodaj mieszaninę DNA-LPF2000-Vero (krok 1.5) do dołków płytki 6-dołkowej. Delikatnie wstrząsnąć płytką 6-dołkową i pozostawić transfekcję na noc do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Zmień pożywkę transfekcyjną: Około 16 - 24 godziny po transfekcji usuń pożywkę do transfekcji, dodaj 2 ml pożywki infekcyjnej i inkubuj transfekowane komórki przez dodatkowe 48 godzin.
  8. Pasaż komórkowy: Po 48 godzinach inkubacji w pożywce infekcyjnej należy usunąć supernatant z hodowli tkankowej (TCS) i przenieść transfekowane komórki do naczynia o średnicy 100 mm. TCS rzadko zawiera zakaźnego wirusa, ponieważ transfekowane komórki wymagają dodatkowej inkubacji w celu wytworzenia cząsteczek wirusa. Dla przejścia komórkowego:
    1. Umyj komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS.
    2. Trypsynizuj komórki 0,5 ml trypsyny-EDTA i poczekaj, aż komórki się odłączą.
    3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    4. Odwirować komórki przez 5 minut przy 5 000 obr./min, 4 °C w mikrowirówce.
    5. Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki infekcyjnej i przenieść komórki do naczynia o średnicy 100 mm. Zwiększyć całkowitą objętość na płytce z pożywką zakaźną do 8 ml, objętości wystarczającej do zapobieżenia wysuszeniu komórek, jak również do zagęszczenia wirusa.
  9. Delikatnie wstrząsnąć szalką o średnicy 100 mm i kontynuować inkubację komórek Vero w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny.
  10. Pobieranie TCS: Po 72 godzinach inkubacji zebrać TCS w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Usuń resztki komórek, wirując przez 5 minut z prędkością 2,500 obr./min w wirówce. Zakaźny arenawirus znajduje się w TCS, więc usuń z resztek komórki osad i przechowuj TCS w temperaturze -80 °C.

2. Potwierdzenie ratowania rekombinowanego wirusa arenawirusa

Wykrycie udanego ratowania rLCMV i rCandid#1 jest osiągane za pomocą testu immunofluorescencyjnego (IFA) za pomocą jednostki tworzącej ognisko (FFU). Do ratowania wirusa typu dzikiego używamy przeciwciał specyficznych dla NP wirusa. R3LCMV i r3Candid#1 kodują dwa geny reporterowe (GFP i Gluc), umożliwiając w ten sposób wykrywanie i miareczkowanie wirusa bez konieczności stosowania przeciwciał za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (GFP) i/lub luminescencji (Gluc).

  1. Potwierdź ratowanie rekombinowanego arenawirusa typu dzikiego: Dzień przed miareczkowaniem przemyj komórki Vero dwukrotnie PBS, trypsynizuj i przygotuj 96-dołkowe płytki, aby następnego dnia osiągnąć 80 - 90% konfluencji (4 x 104 komórki / dołek). Delikatnie potrząśnij płytkami ręcznie, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie komórek. Hodować komórki przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić monowarstwę, przed przystąpieniem do infekcji:
    1. Seryjnie rozcieńczyć (10-krotne rozcieńczenia) zawierający wirusa TCS odzyskany z transfekowanych komórek na szalce o średnicy 100 mm (krok 1.10) w OptiMEM.
    2. Usunąć pożywkę z wysiewanych komórek Vero, przemyć dwukrotnie 50 μl 1x PBS i zainfekować komórki 50 μl seryjnie rozcieńczonego wirusa (krok 2.1). Infekuj komórki przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Po zakażeniu należy usunąć inokulum wirusa, dodać 100 μl pożywki infekcyjnej/dołka i inkubować komórki przez 16 - 18 godzin. Ponowna infekcja wirusowa może nastąpić po 18 godzinach inkubacji, co może spowodować przeszacowanie mian wirusa.
    4. Po 16 - 18 godzinach od infekcji usuń TCS z każdej studzienki i utrwal komórki 4% formaldehydem rozcieńczonym w 1x PBS, przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Następnie usuń roztwór utrwalający i przepuszczaj komórki 0,1% trytonem X-100 rozcieńczonym w 1x PBS, przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Odessać roztwór permeabilizacyjny, a następnie przemyć komórki 3 razy 1x PBS.
    7. Zablokować komórki 2,5% albuminową surowicą bydlęcą (BSA) w 1x PBS (roztwór blokujący) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, komórki można zablokować przez noc w temperaturze 4 °C i kontynuować inkubację przeciwciał następnego dnia.
    8. W międzyczasie przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla LCMV i Candid#1 w roztworze blokującym, a następnie odwirować roztwór przeciwciała/blokującego przez 15 minut przy 3,500 obr./min. Monoklonalne przeciwciało anty-LCMV NP klon 1.1.3 (rozcieńczenie 1:30) 16 i monoklonalne przeciwciało anty-JUNV NP SA02-BG12 z BEI Resources (rozcieńczenie 1:500) mogą być stosowane odpowiednio do wykrywania rLCMV i rCandid#1.
    9. Po 1 godzinnej inkubacji odessać roztwór blokujący i dodać 50 μl przeciwciała pierwszorzędowego do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    10. W tym czasie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze blokującym, a następnie odwirować przeciwciało/roztwór blokujący przez 15 minut z prędkością 3 500 obr./min. Poliklonalne królicze przeciwciało przeciw mysim IgG FITC do wykrywania pierwszorzędowych przeciwciał monoklonalnych wykorzystano do uzyskania obrazów obserwowanych na rycinie 5.
    11. Po 1 godzinie inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe, przemyć 3 razy 1x PBS i dodawać przeciwciało drugorzędowe przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    12. Po 30 minutach inkubacji odessać przeciwciało drugorzędowe i przemyć 3 razy 1x PBS. Komórki są teraz gotowe do obserwacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zarówno w celu określenia powodzenia ratowania wirusa, jak i miareczkowania poprzez zliczanie jednostek tworzących ognisko na ml (FFU/ml).
  2. Ratunek wirusowi r3LCMV i r3Candid#1: Ponieważ wirusy te wykazują ekspresję dwóch genów reporterowych, ich uratowanie może być monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wykrycia ekspresji GFP lub ekspresji Gluc w TCS. Ratunek można również potwierdzić przez ekspresję Gluc w TCS. Aby miareczkować trójsegmentowane wirusy, wykonujemy kroki od 2.1 do 2.1.4, jednak komórki nie muszą być utrwalane, aby określić skuteczne uratowanie wirusa z powodu ekspresji GFP. Miareczkowanie wirusa zostanie określone przez zliczenie FFU/ml. Aby określić skuteczne uratowanie wirusa przez ekspresję Gluc, ekspresję Gluc z TCS można zmierzyć za pomocą zestawu testowego Gluc (zestaw do testów lucyferazy Biolux Gaussa, New England Biolabs). W tym celu:
    1. Odpipetować 100 μl TCS do 96-dołkowej białej płytki (płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem, Fisher Scientific).
    2. Zainstaluj luminometr (LumiCount, Packard Biosciences).
    3. Dodać 50 - 100 μl roztworu do oznaczania Gluc (zgodnie z zaleceniami producenta) do każdej próbki i zmierzyć ekspresję genu reporterowego Gluc za pomocą luminometru. Jako kontrolę negatywną zmierzono ekspresję Gluc TCS z komórek zakażonych wirusami typu dzikiego.

3. Przejście supernatantów z kultur tkankowych

Ratowanie wirusów zależy od skuteczności transfekcji. Wykazano, że komórki Vero mają niższą skuteczność transfekcji niż inne linie komórkowe 14 . Jeśli miana wirusa w TCS są niskie, należy zainfekować świeże komórki Vero przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,01 (LCMV) lub 0,1 (Candid#1) przez 72 godziny, aby amplifikować wirusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślną rekonstytucję rekombinowanego arenawirusa typu dzikiego potwierdzi się obecnością antygenów wirusowych za pomocą metody IFA (Rycina 5). W przypadku rekombinowanych wirusów trójsegmentowych pomyślną rekonstytucję wirusa można ocenić poprzez obserwację ekspresji GFP przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (Rycina 6A). Pomyślną rekonstytucję potwierdzi ponadto ocena ekspresji Gluc (Rycina 6B). Reprezentatywne wyniki obrazujące pomyślną rekonstytucję arenawirusa ty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie rekombinowanych arenawirusów przy użyciu technik genetyki odwrotnej opartej na plazmidach stało się szeroko stosowanym podejściem do badania wielu różnych aspektów biologii arenawirusów. W tym miejscu dokumentujemy kluczowe ulepszenie obecnego systemu poprzez przeprowadzanie akcji ratunkowych dla arenawirusów w komórkach Vero, co pozwala na potencjalne generowanie zatwierdzonych przez FDA kandydatów na szczepionki przeciwko arenawirusom i wektorom szczepionkowym przeciwko innym chorobom zakaźnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy byłym i obecnym członkom laboratoriów JCT i LM-S za rozwój i doskonalenie technik genetyki odwrotnej arenawirusa i plazmidów. Dziękujemy również Snezhhanie Dimitrovej za wsparcie techniczne. Przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko JUNV NP (SA02-BG12) uzyskano z BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository). BYHC był wspierany przez grant numer GM068411 z Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R jest laureatem programu Fullbright-Conicyt (BIO 2008) i Rochester Vaccine Fellowship (2012). Obecne wsparcie EO-R jest zapewnione przez stypendium podoktoranckie na rzecz różnorodności i doskonałości akademickiej z Biura ds. Rozwoju Wydziału i Różnorodności na Uniwersytecie w Rochester. Badania w laboratorium LM-S są finansowane przez granty NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (HHSN266200700008C) oraz The University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).

Badania w laboratorium JCT były wspierane przez granty RO1 AI047140, RO1 AI077719 i RO1 AI079665 od NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał i metody
Linie komórkowe
Vero E6 (komórki nabłonkowe nerki afrykańskiej zielonej małpy) są utrzymywane w 37 ° Inkubator C z 5 % CO2 w DMEM 10 % FBS 1 % PS. Komórki są dostępne w American Type Culture Collection (ATCC, numer katalogowy CRL-1586).

Plasmids
Wszystkie plazmidy, z wyjątkiem hpol-I L, mogą być hodowane w temperaturze 37 stopni; C, przez 16-18 godzin. Zalecamy, aby kultury hpol-I L były uprawiane w temperaturze 30 & deg; C przez 24 godziny. Plazmidy są przygotowywane przy użyciu zestawu plazmidowego maxi (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) zgodnie z zaleceniami producenta i przechowywane w temperaturze -20 stopni C. Stężenie oczyszczonego plazmidu DNA określa się za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 260 nm, przy czym czystość szacuje się przy użyciu stosunku 260:280 nm. Preparaty o proporcjach 1,8-2,0 260:280 nm są uważane za odpowiednie do celów ratowania wirusów. Dodatkowo stężenie i czystość plazmidu należy potwierdzić elektroforezą w żelu agarozowym.

Viruses
Opisany protokół ratowania rLCMV (Armstrong 53b) i rCandid#1 może być wykonany w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2. Zanieczyszczony materiał, w tym TCS i komórki, należy wysterylizować przed utylizacją. Ratowanie innych arenawirusów może wymagać wyższego zaplecza BSL, dlatego należy przestrzegać odpowiednich środków bezpieczeństwa.

Pożywki i roztwory do hodowli tkankowych
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml modyfikowana pożywka Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml 100X penicyliny/streptomycyny (PS). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka ta będzie używana do konserwacji komórek Vero.

Infectious Media: mieszanina 2 do 1 OptiMEM i DMEM 10 %FBS 1 %PS. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka ta będzie używana podczas infekcji wirusowych.

10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. Dodaj ddH2O do 1 litra. Dostosuj pH do 7,3. Sterylizuj w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
1X PBS: Rozcieńczyć 10X PBS 1:10 z ddH2O. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2,5% BSA: 2,5 g BSA w 97,5 ml 1X PBS. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Jest to używane jako rozwiązanie blokujące dla IFA.

Bibliografia

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

transfekcja plazmidowaratowanie wirusatest immunofluorescencjiekspresja lucyferazywirus tr jsegmentowykom rki zatwierdzone przez FDAgenetyka odwrotna
Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.