Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Podsumowanie

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Streszczenie

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej uznawane za ważny model in vitro dla zachowania komórek nowotworowych w trzech wymiarach. Bardziej fizjologicznie istotne niż konwencjonalne hodowle z przylegającymi arkuszami, dokładniej podsumowują złożoność i interakcje obecne w prawdziwych nowotworach. Aby wykorzystać ten model do lepszej oceny biologii nowotworów lub skuteczności nowych środków terapeutycznych, konieczne jest generowanie sferoidów w sposób powtarzalny, kontrolowany i w znacznej liczbie.

System AggreWell składa się z zestawu mikrostudzienek o dużej gęstości w kształcie piramidy, do których odwirowywana jest zawiesina pojedynczych komórek. Liczba komórek grupujących się na dnie każdej mikrostudzienki oraz liczba i stosunek różnych typów komórek zależą tylko od właściwości zawiesiny wprowadzonej przez eksperymentatora. W ten sposób jesteśmy w stanie generować sferoidy guza o dowolnej wielkości i składzie bez konieczności modyfikowania podstawowej technologii platformy. Setki mikrostudzienek na centymetr kwadratowy powierzchni hodowli zapewniają z kolei osiągnięcie niezwykle wysokich poziomów produkcji w prostym, niepracochłonnym procesie. Dlatego spodziewamy się, że protokół ten będzie szeroko przydatny dla badaczy zajmujących się sferoidalną dziedziną nowotworów.

Wprowadzenie

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że komórki nowotworowe zachowują się inaczej w kulturach trójwymiarowych niż podczas hodowli na plastiku, oraz że środki terapeutyczne zidentyfikowane na konwencjonalnych platformach hodowli tkankowej mogą stracić skuteczność po przejściu do bardziej fizjologicznie istotnego systemu¹. Dlatego pożądane jest zbadanie zachowania komórek nowotworowych w tych warunkach, zarówno w celu uzyskania wglądu w ich biologię, jak i w celu zwiększenia wskaźnika sukcesu w przenoszeniu nowych środków terapeutycznych z placówki przesiewowej do kliniki. Jeden z użytecznych systemów modelowych o długiej historii wykorzystuje trójwymiarowe klastry komórek nowotworowych znane jako sferoidy nowotworowe^1,2. Idealnie byłoby, gdyby techniki tworzenia sferoidów pozwoliły na produkcję dużej liczby jednorodnych sferoid, których rozmiar i skład są kontrolowane przez eksperymentatora. Podczas gdy podejścia wiszące i studzienne^3,4 są w stanie spełnić niektóre z tych wymagań, przepustowość jest na ogół ograniczona, a generowanie dużej liczby sferoid staje się pracochłonnym zadaniem.

Niedawno opracowaliśmy system do rozwiązywania podobnych problemów w dziedzinie medycyny regeneracyjnej⁵. Wykorzystując wymuszoną agregację w szeregu gęsto upakowanych studzienek w skali mikronowej (patrz rysunek 1), podejście to pozwala na generowanie sferoid z dowolnej liczby komórek, w tym mieszanin wielu typów komórek⁶, a także na wprowadzanie różnych biomateriałów⁷. Sferoidy powstają w dużych ilościach - od tysięcy do setek tysięcy lub więcej - i mogą być natychmiast ekstrahowane lub utrzymywane w mikrostudzienkach, w których zostały utworzone, z wymianą pożywki przez co najmniej jeden od⁸ do dwóch (niepublikowana obserwacja) tygodni. System ten jest zatem dobrze przystosowany do generowania dużej liczby jednorodnych i odtwarzalnych sferoid nowotworowych w celu oceny skuteczności nowych środków przeciwnowotworowych lub podstawowych badań biologicznych.

Protokół

UWAGA: Płytki Microwell są dostępne w różnych formatach, w zależności od pożądanych rezultatów. Specyfikacje, jak również przybliżone wytyczne dotyczące minimalnej i maksymalnej liczby komórek, które powinny być używane w każdym formacie, przedstawiono w tabeli 1. Mniejsze mikrostudzienki zwężają się do ostrego punktu, a zatem nie ma dolnej granicy rozmiaru, chociaż zmienność między sferoidami staje się bardziej znacząca przy mniejszych rozmiarach. Rutynowa produkcja sferoid z zaledwie 20 komórek każda jest prosta⁸. Większy rozmiar mikrostudzienki nie jest w pełni zwężany, dlatego próby utworzenia sferoid z niewielkiej liczby komórek mogą skutkować wieloma mniejszymi sferoidami w każdej mikrostudzince. Ze względu na niewielkie różnice we właściwościach powierzchni, przygotowanie roztworem środka powierzchniowo czynnego (krok 1.2) nie jest opcjonalne w przypadku stosowania płytek AggreWell 400Ex.

Ten protokół opiera się na użyciu płytek AggreWell 400 - inne formaty znajdują się w Tabeli 1. Liczbę komórek, które należy załadować do każdej studzienki, określa się poprzez pomnożenie liczby zawartych w nim mikrostudzienek przez liczbę komórek, które mają być zgrupowane dla każdej sferoidy. Na przykład, aby wygenerować sferoidy z 1000 komórek każda, każda studzienka musi być załadowana (1,200 sferoidami razy 1,000 komórek każda = ) 1,2 x 10⁶ komórek. Gęstość komórek należy obliczyć, biorąc pod uwagę, że komórki zostaną załadowane w objętości 0,4 ml. Tak więc dla przykładu sferoid utworzonych z 1000 komórek każda, 1,2 x 10⁶ komórek w 0,4 ml przekłada się na gęstość 3 x 10⁶ komórek na ml.

1. Przygotowanie mikrostudzienek do odbioru komórek

1. Płytki mikrodołkowe są sterylne zgodnie z opisem i należy je wyjmować z opakowania wyłącznie w sterylnym środowisku, takim jak komora bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Sterylność powinna być zachowana przez cały czas trwania protokołu. W przypadku naruszenia sterylności, studzienki są ponownie sterylizowane przy użyciu 70% etanolu w wodzie, wykonując następujące opcjonalne czynności.
   1. Dodać 0,5 ml 70% etanolu do każdej niewykorzystanej studzienki. Niektóre mikrostudzienki zatrzymują pęcherzyki powietrza, chociaż można to zmniejszyć, dodając płyn z jednej strony i pozwalając mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Załóż pokrywę.
   2. Podczas gdy opary etanolu powinny szybko przenikać przez wszelkie pęcherzyki, jeśli jest ich dużo, pożądane może być ich usunięcie. Wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g. Należy pamiętać, że ważne jest, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.
   3. Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.
   4. Inkubować przez 5 minut pod przykryciem w temperaturze pokojowej.
   5. Aspirat etanolu. Płytkę można teraz umyć sterylną wodą lub PBS do natychmiastowego użycia lub wysuszyć na powietrzu do przechowywania.
2. Aby zapewnić, że komórki nie wchodzą w interakcje z powierzchnią mikrostudzienki, można ją przygotować przy użyciu środka powierzchniowo czynnego. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się wykonanie tego kroku na początku, a następnie porównanie sferoid wygenerowanych z mikrostudzienkami pokrytymi środkiem powierzchniowo czynnym i bez nich.
   1. Dodać 0,5 ml roztworu płuczącego do każdej studzienki. Niektóre mikrostudzienki zatrzymują pęcherzyki powietrza, chociaż można to zmniejszyć, dodając płyn z jednej strony i pozwalając mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Załóż pokrywę.
   2. Wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g w celu usunięcia pęcherzyków. Należy pamiętać, że ważne jest, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.
   3. Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.
   4. Inkubować przez co najmniej trzydzieści minut pod pokrywką w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Płytki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni z roztworem środka powierzchniowo czynnego w studzienkach do czasu, gdy będą potrzebne, jeśli są odpowiednio zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu.
   5. Płytkę należy umyć sterylną wodą lub PBS bezpośrednio przed użyciem. Nie dopuścić do wyschnięcia płytek po nałożeniu powłoki.

2. Przygotowanie komórek

UWAGA: Szczegóły przygotowania komórek będą się nieco różnić w zależności od konkretnego typu badanej komórki. Zaobserwowaliśmy jednak, że warunki te są skuteczne w przypadku szerokiego zakresu komórek, w tym omawianych tutaj linii, a także ludzkich i mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC), ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), fibroblastów, przypuszczalnej pierwotnej endodermy i komórek zrębu. Inne grupy z powodzeniem wykorzystały ten system w szerokim zakresie zastosowań, w tym w chondrogenezie z mezenchymalnych komórek macierzystych⁹, standaryzowanym wytwarzaniu prekursorów nerwowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych¹⁰, analizach toksykologicznych w hepatocytach¹¹ i ocenie regeneracji rdzenia kręgowego u salamander¹². Szczegółowy protokół pracy z komórkami HT29 jest pokazany tutaj.

1. Zacznij od kolby T75 z komórkami HT29, hodowanymi w DMEM + 10% FBS
2. Odessać pożywkę wzrostową z kolby i dodać 3 ml trypsyny.
3. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
4. Zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając 3 ml pożywki wzrostowej. Pobrać podwielokrotność do zliczania komórek i przenieść pozostałą część do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
5. Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
6. Podczas wirowania policz komórki.
7. Odessać mieszaninę trypsyny/pożywki i zastąpić świeżą pożywką wzrostową, objętość określoną przez wymaganą gęstość komórek, jak obliczono powyżej.
8. (OPCJONALNIE) Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko w celu usunięcia wszelkich grudek. UWAGA: Warunki pobierania komórek będą się nieco różnić w zależności od linii. Jeśli dostępny jest protokół dysocjacji, na przykład do przekazywania komórek będących przedmiotem zainteresowania, należy go wykorzystać jako punkt wyjścia. W przypadku wrażliwych linii komórkowych stosowanie trypsyny może powodować nadmierną śmierć komórek. W tych przypadkach zaobserwowaliśmy dobre wyniki przy użyciu TrypLE jako alternatywnego odczynnika dysocjacyjnego⁸. Jeśli komórki zbrylą się podczas dysocjacji i stracą żywotność, dodanie DNAzy do roztworu enzymu może rozwiązać ten problem. Skrócenie czasu dysocjacji i zastosowanie etapu rozcierania w celu rozbicia grudek komórek może również zwiększyć żywotność.

3. Formacja sferoidalna

UWAGA: Sferoidy mogą być generowane w różnych formułach pożywki, jednak początkowe próby powinny być przeprowadzone przy użyciu pożywki, w której komórki były hodowane, aby odróżnić konsekwencje przejścia na 3-wymiarowy system hodowli od konsekwencji zmiany składu pożywki.

1. Dodaj 0,4 ml pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
2. Wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g w celu usunięcia pęcherzyków. Należy pamiętać, że ważne jest, aby przed wirowaniem upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.
3. Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.
4. Dodać 0,4 ml zawiesiny komórek o wymaganej gęstości (obliczonej powyżej). Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrostudzienek. Ważne jest, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w całej studni, aby uzyskać spójne sferoidy.
5. Wirować przez 5 minut przy 200 x g. Jeśli płytka nie wypoziomuje się samoczynnie podczas wirowania, mogą powstać prądy konwekcyjne, które powodują nierównomierne rozmieszczenie komórek w mikrostudzienkach. Dlatego płyta powinna być wyważona wewnętrznie, a także względem drugiej płyty, tak aby ciężar był równomiernie rozłożony po obu stronach nośnika płyty.

UWAGA: Jeśli widoczne są dowody na nierównomierne rozmieszczenie komórek, może być konieczne nałożenie niewielkiej ilości smaru na punkty obrotu na nośniku płyty - skonsultuj się z producentem wirówki w celu uzyskania instrukcji.

UWAGA: Po odwirowaniu komórek do mikrostudzienek, są one dość odporne na wymywanie przez drobne ruchy płytki. Należy unikać gwałtownych ruchów, które powodują chlupotanie podłoża, ale przeniesienie płytki z wirówki do mikroskopu lub inkubatora nie powinno spowodować znacznego przemieszczenia komórek.

6. Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach i czy są równomiernie rozmieszczone w studzience.
7. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
8. Za pomocą odwróconego mikroskopu obserwuj proces powstawania sferoid. Niektóre linie komórkowe utworzą zwarte sferoidy w ciągu 24 godzin, inne mogą potrzebować więcej czasu. Progresję od klastra do agregacji w komórkach HT29 pokazano na rysunku 2.
9. Odzyskaj sferoidy z mikrostudzienek i przenieś je do kultury zawiesinowej, delikatnie wypryskując je pipetą. Alternatywnie, utrzymuj sferoidy in situ z wymianą pożywki⁸ - czas trwania zależy od ich początkowej wielkości i tempa wzrostu, które określają czas, w którym wyrosną z mikrostudzienek, w których zostały uformowane.
   1. Aby zastąpić pożywkę bez utraty sferoid, należy zassać pożywkę na krawędzi studzienki za pomocą pipety Pasteura. Powoli opuść końcówkę, aż zacznie wyciągać płyn z łąkotki i podążaj za łąkotką w dół, gdy opada. Następnie dodaj świeże podłoże do ściany studzienki w tym samym miejscu. Kilka sferoid może zostać utraconych, jednak jeśli podłoże jest zawsze zasysane i umieszczane w tej samej pozycji, liczba ta pozostanie mała w porównaniu z dużymi liczbami w studni.

Wyniki

Sferoidy z wielu linii nowotworowych o różnym pochodzeniu anatomicznym mogą być łatwo generowane i ekstrahowane do hodowli zawiesinowej. Rysunek 3 ilustruje konsekwentną kontrolę wielkości możliwą do uzyskania za pomocą tej metody, z wysoce jednorodnymi populacjami sferoidalnymi w każdym warunku. Widoczne są również wyraźne różnice w zachowaniu między liniami, przy czym komórki raka jelita grubego HT29 i komórki raka przełyku TE6 tworzą gęsto upakowane sferoidy o ostro zdefiniowanych granicach, podczas gdy komórki raka prostaty LNCaP dały początek mniej spójnym sferoidom o nieregularnych granicach (patrz Dyskusja dla możliwych przyczyn). Silniejsze siły wewnętrzne w bardziej spójnych agregatach powodowały również zapadanie się do bardziej symetrycznej formy, nawet gdy były jeszcze w mikrostudzienkach, w których zostały uformowane, podczas gdy agregaty LNCaP, szczególnie przy większych rozmiarach, widocznie zachowują kwadratowo-piramidalną geometrię mikrostudzienek. Zależność między liczbami komórek wejściowych a fizycznym rozmiarem wynikowej sferoidy będzie zależeć od wielu zmiennych. Objętości teoretyczne oparte na iloczynu objętości na komórkę i liczbie zatrudnionych komórek mogą być zmniejszone przez utratę komórek, która z kolei może obejmować utratę komórek w fazie zawieszenia pojedynczej komórki, a także utratę z powodu zbyt małych agregatów z powodu niewystarczającej liczby sąsiadów oraz z powodu zbyt dużych agregatów z powodu ograniczeń transportu i martwicy rdzenia. Na rozmiar będzie również miała wpływ wszelka proliferacja, która może wystąpić podczas procesu agregacji. Ponieważ parametry te będą się różnić w zależności od linii komórkowej, jeśli pożądane są sferoidy o określonych wymiarach fizycznych, należy eksperymentalnie określić odpowiednią liczbę komórek do wprowadzenia. W pierwszym przybliżeniu oczekuje się, że średnica sferoidy będzie rosła wraz z pierwiastkiem sześciennym liczby włączonych komórek - np. 8-krotny wzrost liczby komórek powinien spowodować podwojenie średnicy sferoidy.

Rysunek 1. Schemat produkcji sferoid. System mikrostudzienek składa się z szeregu ciasno upakowanych mikrostudzienek w kształcie kwadratowej piramidy (625 na cm2 dla 400 μm rozmiaru), do którego komórki mogą być odwirowane. Komórki są łączone ze sobą za pomocą pochyłych ścian bocznych, a wielkość powstałej sferoidy jest kontrolowana przez zmianę gęstości zastosowanej zawiesiny komórek.

Rysunek 2. Składanie skupionych komórek w sferoidy. Sferoidy utworzono z siedmiuset komórek HT29 każda. Bezpośrednio po odwirowaniu (A) komórki są luźno zgrupowane na dnie każdej mikrostudzienki. Należy pamiętać, że w tym przypadku klastry są równomiernie przesunięte w kierunku prawego dolnego rogu. Jest to dopuszczalne, pod warunkiem, że rozmiary klastrów pozostają spójne w całej tablicy. Jeśli widoczne są znaczne różnice w rozmiarach klastrów między jedną stroną tablicy, zobacz Uwaga w kroku 3.5. Po inkubacji przez 24 godziny (B), międzykomórkowe siły adhezyjne spowodowały agregację klastrów i utworzenie spójnych sferoid, które można następnie wyekstrahować (C).

Rysunek 3. Sferoidy generowane w płytkach mikrodołkowych. Sferoidy utworzono z siedmiuset (A, C, E) lub tysiąca pięciuset (B, D, F) komórek raka jelita grubego HT29 (A, B), komórek raka prostaty LNCaP (C, D) lub komórek raka przełyku TE6 (E, F). Zwróć uwagę na konsystencję sferoid w preparacie, a także na zmienność między liniami komórkowymi - w szczególności luźnymi agregatami LNCaP w porównaniu z gęściej upakowanymi komórkami HT29 i TE6. Podziałka skali odpowiada 200 μm.

Format mikrostudzienki Studnia AggreWell 400 AggreWell 40EX Studnia AggreWell 800 Szerokość mikrostudzienki (μm) 400 szt. 400 szt. 800 szt. Mikrostudzienki na^cm2 625 szt. 625 szt. 156,25 pkt. Mikrostudzienki na studzienkę 1 200 szt. 4 700 szt. 300 szt. Minimalna liczba komórek na mikrostudzienkę* N/a N/a Rok 2000 Maksymalna liczba komórek na mikrostudzienkę* 2 000 szt. 2 000 szt. 10 000 szt. Minimalna liczba komórek na studzienkę* N/a N/a Pomieszczenia 6 x 10⁵ Maksymalna liczba komórek na studzienkę* Wymiary: 2,4 x 10⁶ 9,4 x 10⁶ 3 x 10⁶ 1,1.1 - 70% objętości etanolu (ml) 0,5 2.0 0,5 1.2.1 - Objętość roztworu płuczącego (ml) 0,5 2.0 0,5 3.2 - Średnia objętość obciążenia wstępnego (ml) 0,4 1.6 0,4 3.5 - Objętość ładowania komórek (ml) 0,4 1.6 0,4 *Liczba komórek na mikrostudzienkę jest tylko przybliżona, ponieważ wartość ta będzie się różnić w zależności od wielkości konkretnych użytych komórek i powinna być określona empirycznie

Tabela 1. Opcje AggreWell i modyfikacje protokołu.

Dyskusja

Stworzyliśmy system, w którym duża liczba jednolitych sferoid może być generowana z wielu linii komórkowych z różnych źródeł. Nie spotkaliśmy się jeszcze z przylegającą linią komórkową, która nie tworzy sferoid w tych warunkach. Wcześniej obserwowaliśmy utratę komórek w populacjach podatnych na anoikis^5,8, jednak do tej pory problem ten nie pojawił się w przypadku linii nowotworowych. System jest dowolnie skalowalny w zależności od powierzchni, z zachowaniem spójnym we wszystkich mikrodołkach w formacie 24- i 6-dołkowym, a także w prototypowych bioreaktorach zawierających 50 000 mikrodołków, z których każdy jest obecnie w fazie rozwoju.

Jeśli asymetria sferoidalna jest problemem, czas inkubacji opisany w kroku 4.8 może zostać wydłużony do dwóch lub trzech dni. Sferoidy mogą być również inkubowane przez pewien czas po ekstrakcji z mikrostudzienek w celu zwiększenia symetrii, jednak w tym przypadku należy zachować ostrożność, aby utrzymać wystarczająco niską gęstość hodowli, ponieważ sferoidy stykające się ze sobą często łączą się w większe struktury. Z tego powodu wcześniej utrzymywaliśmy kultury w mikrostudzienkach, w których powstały agregaty, przy czym głównym ograniczeniem był rozmiar sferoidy. To z kolei jest funkcją zarówno szybkości wzrostu, jak i początkowej wielkości⁸, a jeśli planowana jest rozszerzona hodowla w płytce mikrodołkowej, należy to rozważyć z wyprzedzeniem. Opcje zapobiegania przerostowi, jeśli do niego dojdzie, obejmują rozpoczęcie od mniejszych sferoid lub zastosowanie większych mikrodołków płytki AggreWell 800.

Jeśli sferoidy nie zwiększą swojej koherencji w czasie, jedną z potencjalnych przyczyn może być śmierć komórki. Szczególnie w większych skupiskach wysoce aktywnych metabolicznie komórek, ograniczenia transportu masy w dostarczaniu tlenu i niezbędnych składników odżywczych mogą skutkować nekrotycznym rdzeniem² - tak więc niespoiste sferoidy mogą być po prostu konsekwencją nadmiernej śmierci komórki. Alternatywnie, pomiary kohezji mechanicznej sferoid zostały wykorzystane do oceny międzykomórkowych sił wiązania w odniesieniu do potencjału przerzutowego danej linii komórkowej¹³. Interesujące byłoby zbadanie związku między kształtem sferoidalnym a potencjałem przerzutowym, być może przy użyciu parametrów morfometrycznych, takich jak okrągłość i stosunek obwodu do powierzchni.

Oprócz badania właściwości mechanicznych i morfometrycznych sferoid, montaż w systemie mikrostudzienki pozwala na produkcję sferoid o mieszanym składzie na dużą skalę, składających się z kombinacji wielu typów komórek i / lub biomateriałów^6,7. Interakcje komórek nowotworowych z innymi typami komórek są ważne dla dokładniejszego modelowania zachowania nowotworów in vivo¹⁴, dlatego interesujące może być generowanie sferoid z komórek nowotworowych w połączeniu na przykład z fibroblastami i komórkami śródbłonka. Mikrocząstki różnych biomateriałów mogą być również włączane i mogą wpływać na właściwości sferoidalne zarówno bezpośrednio poprzez ich interakcje z komórkami^7,15, jak i jako rezerwuary kontrolowanego uwalniania czynników wzrostu i cytokin do wnętrza sferoidy¹⁶.

Jeśli istnieje jakakolwiek obawa co do sterylności, na przykład podczas pracy z płytką mikrodołkową, w której wcześniej używano niektórych studzienek, które mogły spędzić trochę czasu w inkubatorze w ramach poprzedniego eksperymentu, studzienki można ponownie wysterylizować przy użyciu 70% etanolu w wodzie.

Po uformowaniu sferoid można je również oddzielić od pozostałych komórek nieinkorporowanych, przepuszczając zawiesinę przez sitko do komórek. Poszczególne komórki przejdą, podczas gdy sferoidy zostaną zachowane. Jeśli istnieje podejrzenie, że sferoida wydziela komórki potencjalnie przerzutowe w trakcie hodowli, pożądane może być wielokrotne wykonanie tej procedury - początkowo w celu usunięcia komórek nieinkorporowanych, a następnie w celu wyizolowania oczyszczonych populacji komórek wydzielanych przez sferoidy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka AggreWell 400	firmy StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Roztwór do płukania	StemCell Technologies Inc.	07010
Sitko do komórek (37 &mikro; m)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsyna-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Mikroskop odwrócony	VWR / Motic	Wirówka CA19000-610
Allegra X15R z nośnikami do standardowych płytek studziennych	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP