Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.
Artykuł metodologiczny
Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sferoidy nowotworowe są coraz częściej uznawane za ważny model in vitro dla zachowania komórek nowotworowych w trzech wymiarach. Bardziej fizjologicznie istotne niż konwencjonalne hodowle z przylegającymi arkuszami, dokładniej podsumowują złożoność i interakcje obecne w prawdziwych nowotworach. Aby wykorzystać ten model do lepszej oceny biologii nowotworów lub skuteczności nowych środków terapeutycznych, konieczne jest generowanie sferoidów w sposób powtarzalny, kontrolowany i w znacznej liczbie.
System AggreWell składa się z zestawu mikrostudzienek o dużej gęstości w kształcie piramidy, do których odwirowywana jest zawiesina pojedynczych komórek. Liczba komórek grupujących się na dnie każdej mikrostudzienki oraz liczba i stosunek różnych typów komórek zależą tylko od właściwości zawiesiny wprowadzonej przez eksperymentatora. W ten sposób jesteśmy w stanie generować sferoidy guza o dowolnej wielkości i składzie bez konieczności modyfikowania podstawowej technologii platformy. Setki mikrostudzienek na centymetr kwadratowy powierzchni hodowli zapewniają z kolei osiągnięcie niezwykle wysokich poziomów produkcji w prostym, niepracochłonnym procesie. Dlatego spodziewamy się, że protokół ten będzie szeroko przydatny dla badaczy zajmujących się sferoidalną dziedziną nowotworów.
Wprowadzenie
Istnieje coraz więcej dowodów na to, że komórki nowotworowe zachowują się inaczej w kulturach trójwymiarowych niż podczas hodowli na plastiku, oraz że środki terapeutyczne zidentyfikowane na konwencjonalnych platformach hodowli tkankowej mogą stracić skuteczność po przejściu do bardziej fizjologicznie istotnego systemu1. Dlatego pożądane jest zbadanie zachowania komórek nowotworowych w tych warunkach, zarówno w celu uzyskania wglądu w ich biologię, jak i w celu zwiększenia wskaźnika sukcesu w przenoszeniu nowych środków terapeutycznych z placówki przesiewowej do kliniki. Jeden z użytecznych systemów modelowych o długiej historii wykorzystuje trójwymiarowe klastry komórek nowotworowych znane jako sferoidy nowotworowe1,2. Idealnie byłoby, gdyby techniki tworzenia sferoidów pozwoliły na produkcję dużej liczby jednorodnych sferoid, których rozmiar i skład są kontrolowane przez eksperymentatora. Podczas gdy podejścia wiszące i studzienne3,4 są w stanie spełnić niektóre z tych wymagań, przepustowość jest na ogół ograniczona, a generowanie dużej liczby sferoid staje się pracochłonnym zadaniem.
Niedawno opracowaliśmy system do rozwiązywania podobnych problemów w dziedzinie medycyny regeneracyjnej5. Wykorzystując wymuszoną agregację w szeregu gęsto upakowanych studzienek w skali mikronowej (patrz rysunek 1), podejście to pozwala na generowanie sferoid z dowolnej liczby komórek, w tym mieszanin wielu typów komórek6, a także na wprowadzanie różnych biomateriałów7. Sferoidy powstają w dużych ilościach - od tysięcy do setek tysięcy lub więcej - i mogą być natychmiast ekstrahowane lub utrzymywane w mikrostudzienkach, w których zostały utworzone, z wymianą pożywki przez co najmniej jeden od8 do dwóch (niepublikowana obserwacja) tygodni. System ten jest zatem dobrze przystosowany do generowania dużej liczby jednorodnych i odtwarzalnych sferoid nowotworowych w celu oceny skuteczności nowych środków przeciwnowotworowych lub podstawowych badań biologicznych.
Protokół
UWAGA: Płytki Microwell są dostępne w różnych formatach, w zależności od pożądanych rezultatów. Specyfikacje, jak również przybliżone wytyczne dotyczące minimalnej i maksymalnej liczby komórek, które powinny być używane w każdym formacie, przedstawiono w tabeli 1. Mniejsze mikrostudzienki zwężają się do ostrego punktu, a zatem nie ma dolnej granicy rozmiaru, chociaż zmienność między sferoidami staje się bardziej znacząca przy mniejszych rozmiarach. Rutynowa produkcja sferoid z zaledwie 20 komórek każda jest prosta8. Większy rozmiar mikrostudzienki nie jest w pełni zwężany, dlatego próby utworzenia sferoid z niewielkiej liczby komórek mogą skutkować wieloma mniejszymi sferoidami w każdej mikrostudzince. Ze względu na niewielkie różnice we właściwościach powierzchni, przygotowanie roztworem środka powierzchniowo czynnego (krok 1.2) nie jest opcjonalne w przypadku stosowania płytek AggreWell 400Ex.
Ten protokół opiera się na użyciu płytek AggreWell 400 - inne formaty znajdują się w Tabeli 1. Liczbę komórek, które należy załadować do każdej studzienki, określa się poprzez pomnożenie liczby zawartych w nim mikrostudzienek przez liczbę komórek, które mają być zgrupowane dla każdej sferoidy. Na przykład, aby wygenerować sferoidy z 1000 komórek każda, każda studzienka musi być załadowana (1,200 sferoidami razy 1,000 komórek każda = ) 1,2 x 106 komórek. Gęstość komórek należy obliczyć, biorąc pod uwagę, że komórki zostaną załadowane w objętości 0,4 ml. Tak więc dla przykładu sferoid utworzonych z 1000 komórek każda, 1,2 x 106 komórek w 0,4 ml przekłada się na gęstość 3 x 106 komórek na ml.
1. Przygotowanie mikrostudzienek do odbioru komórek
- Płytki mikrodołkowe są sterylne zgodnie z opisem i należy je wyjmować z opakowania wyłącznie w sterylnym środowisku, takim jak komora bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Sterylność powinna być zachowana przez cały czas trwania protokołu. W przypadku naruszenia sterylności, studzienki są ponownie sterylizowane przy użyciu 70% etanolu w wodzie, wykonując następujące opcjonalne czynności.
- Dodać 0,5 ml 70% etanolu do każdej niewykorzystanej studzienki. Niektóre mikrostudzienki zatrzymują pęcherzyki powietrza, chociaż można to zmniejszyć, dodając płyn z jednej strony i pozwalając mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Załóż pokrywę.
- Podczas gdy opary etanolu powinny szybko przenikać przez wszelkie pęcherzyki, jeśli jest ich dużo, pożądane może być ich usunięcie. Wirować przez 2 minuty przy 2 000 x g. Należy pamiętać, że ważne jest, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.
- Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.
- Inkubować przez 5 minut pod przykryciem w temperaturze pokojowej.
- Aspirat etanolu. Płytkę można teraz umyć sterylną wodą lub PBS do natychmiastowego użycia lub wysuszyć na powietrzu do przechowywania.
- Aby zapewnić, że komórki nie wchodzą w interakcje z powierzchnią mikrostudzienki, można ją przygotować przy użyciu środka powierzchniowo czynnego. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się wykonanie tego kroku na początku, a następnie porównanie sferoid wygenerowanych z mikrostudzienkami pokrytymi środkiem powierzchniowo czynnym i bez nich.
- Dodać 0,5 ml roztworu płuczącego do każdej studzienki. Niektóre mikrostudzienki zatrzymują pęcherzyki powietrza, chociaż można to zmniejszyć, dodając płyn z jednej strony i pozwalając mu rozprzestrzenić się po powierzchni, zamiast upuszczać go pionowo na powierzchnię. Załóż pokrywę.
- Wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g w celu usunięcia pęcherzyków. Należy pamiętać, że ważne jest, aby upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.
- Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.
- Inkubować przez co najmniej trzydzieści minut pod pokrywką w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Płytki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni z roztworem środka powierzchniowo czynnego w studzienkach do czasu, gdy będą potrzebne, jeśli są odpowiednio zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu.
- Płytkę należy umyć sterylną wodą lub PBS bezpośrednio przed użyciem. Nie dopuścić do wyschnięcia płytek po nałożeniu powłoki.
2. Przygotowanie komórek
UWAGA: Szczegóły przygotowania komórek będą się nieco różnić w zależności od konkretnego typu badanej komórki. Zaobserwowaliśmy jednak, że warunki te są skuteczne w przypadku szerokiego zakresu komórek, w tym omawianych tutaj linii, a także ludzkich i mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC), ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), fibroblastów, przypuszczalnej pierwotnej endodermy i komórek zrębu. Inne grupy z powodzeniem wykorzystały ten system w szerokim zakresie zastosowań, w tym w chondrogenezie z mezenchymalnych komórek macierzystych9, standaryzowanym wytwarzaniu prekursorów nerwowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych10, analizach toksykologicznych w hepatocytach11 i ocenie regeneracji rdzenia kręgowego u salamander12. Szczegółowy protokół pracy z komórkami HT29 jest pokazany tutaj.
- Zacznij od kolby T75 z komórkami HT29, hodowanymi w DMEM + 10% FBS
- Odessać pożywkę wzrostową z kolby i dodać 3 ml trypsyny.
- Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając 3 ml pożywki wzrostowej. Pobrać podwielokrotność do zliczania komórek i przenieść pozostałą część do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Wirować przez 5 minut przy 200 x g.
- Podczas wirowania policz komórki.
- Odessać mieszaninę trypsyny/pożywki i zastąpić świeżą pożywką wzrostową, objętość określoną przez wymaganą gęstość komórek, jak obliczono powyżej.
- (OPCJONALNIE) Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko w celu usunięcia wszelkich grudek. UWAGA: Warunki pobierania komórek będą się nieco różnić w zależności od linii. Jeśli dostępny jest protokół dysocjacji, na przykład do przekazywania komórek będących przedmiotem zainteresowania, należy go wykorzystać jako punkt wyjścia. W przypadku wrażliwych linii komórkowych stosowanie trypsyny może powodować nadmierną śmierć komórek. W tych przypadkach zaobserwowaliśmy dobre wyniki przy użyciu TrypLE jako alternatywnego odczynnika dysocjacyjnego8. Jeśli komórki zbrylą się podczas dysocjacji i stracą żywotność, dodanie DNAzy do roztworu enzymu może rozwiązać ten problem. Skrócenie czasu dysocjacji i zastosowanie etapu rozcierania w celu rozbicia grudek komórek może również zwiększyć żywotność.
3. Formacja sferoidalna
UWAGA: Sferoidy mogą być generowane w różnych formułach pożywki, jednak początkowe próby powinny być przeprowadzone przy użyciu pożywki, w której komórki były hodowane, aby odróżnić konsekwencje przejścia na 3-wymiarowy system hodowli od konsekwencji zmiany składu pożywki.
- Dodaj 0,4 ml pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
- Wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g w celu usunięcia pęcherzyków. Należy pamiętać, że ważne jest, aby przed wirowaniem upewnić się, że wirnik jest odpowiednio wyważony przy tej prędkości.
- Używając odwróconego mikroskopu o małym powiększeniu, sprawdź, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek.
- Dodać 0,4 ml zawiesiny komórek o wymaganej gęstości (obliczonej powyżej). Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrostudzienek. Ważne jest, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w całej studni, aby uzyskać spójne sferoidy.
- Wirować przez 5 minut przy 200 x g. Jeśli płytka nie wypoziomuje się samoczynnie podczas wirowania, mogą powstać prądy konwekcyjne, które powodują nierównomierne rozmieszczenie komórek w mikrostudzienkach. Dlatego płyta powinna być wyważona wewnętrznie, a także względem drugiej płyty, tak aby ciężar był równomiernie rozłożony po obu stronach nośnika płyty.
UWAGA: Jeśli widoczne są dowody na nierównomierne rozmieszczenie komórek, może być konieczne nałożenie niewielkiej ilości smaru na punkty obrotu na nośniku płyty - skonsultuj się z producentem wirówki w celu uzyskania instrukcji.
UWAGA: Po odwirowaniu komórek do mikrostudzienek, są one dość odporne na wymywanie przez drobne ruchy płytki. Należy unikać gwałtownych ruchów, które powodują chlupotanie podłoża, ale przeniesienie płytki z wirówki do mikroskopu lub inkubatora nie powinno spowodować znacznego przemieszczenia komórek.
- Za pomocą odwróconego mikroskopu sprawdź, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach i czy są równomiernie rozmieszczone w studzience.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą odwróconego mikroskopu obserwuj proces powstawania sferoid. Niektóre linie komórkowe utworzą zwarte sferoidy w ciągu 24 godzin, inne mogą potrzebować więcej czasu. Progresję od klastra do agregacji w komórkach HT29 pokazano na rysunku 2.
- Odzyskaj sferoidy z mikrostudzienek i przenieś je do kultury zawiesinowej, delikatnie wypryskując je pipetą. Alternatywnie, utrzymuj sferoidy in situ z wymianą pożywki8 - czas trwania zależy od ich początkowej wielkości i tempa wzrostu, które określają czas, w którym wyrosną z mikrostudzienek, w których zostały uformowane.
- Aby zastąpić pożywkę bez utraty sferoid, należy zassać pożywkę na krawędzi studzienki za pomocą pipety Pasteura. Powoli opuść końcówkę, aż zacznie wyciągać płyn z łąkotki i podążaj za łąkotką w dół, gdy opada. Następnie dodaj świeże podłoże do ściany studzienki w tym samym miejscu. Kilka sferoid może zostać utraconych, jednak jeśli podłoże jest zawsze zasysane i umieszczane w tej samej pozycji, liczba ta pozostanie mała w porównaniu z dużymi liczbami w studni.
Wyniki
Sferoidy z wielu linii nowotworowych o różnym pochodzeniu anatomicznym mogą być łatwo generowane i przenoszone do hodowli w zawiesinie. Rycina 3 ilustruje spójną kontrolę wielkości uzyskiwalną za pomocą tej metody, z wysoce jednorodnymi populacjami sferoidów w każdym z warunków. Widoczne są również wyraźne różnice w zachowaniu między liniami: komórki raka jelita grubego HT29 oraz komórki raka przełyku TE6 tworzyły gęsto upakowane sferoidy o ostro zarysowanych granicach, podczas gdy komórki raka prostaty LNCaP dawały sferoidy o mniejszej spójności i nieregularnych granicach (możliwe przyczyny opisano w sekcji Dyskusja). Silniejsze siły wewnętrzne w bardziej spójnych agregatach doprowadziły również do zapadnięcia się do formy bardziej symetrycznej jeszcze w mikrodofkach, w których powstały, podczas gdy agregaty LNCaP, szczególnie o większym rozmiarze, wyraźnie zachowują kwadratowo-piramidalną geometrię mikrodofek. Zależność między liczbą wprowadzonych komórek a fizyczną wielkością powstałego sferoidu będzie zależeć od szeregu zmiennych. Objętości teoretyczne, oparte na iloczynie objętości jednej komórki i liczby użytych komórek, mogą być zmniejszone przez utratę komórek, co z kolei może obejmować utratę komórek na etapie przygotowania zawiesiny jednokomórkowej, a także utratę z nadmiernie małych agregatów z powodu niewystarczającej liczby sąsiednich komórek oraz z nadmiernie dużych agregatów z powodu ograniczeń w transporcie i martwicy w jądrze. Na wielkość będzie wpływać również jakakolwiek proliferacja, która może wystąpić podczas procesu agregacji. Ponieważ parametry te będą różnić się w zależności od linii komórkowej, w przypadku chęci uzyskania sferoidów o określonych wymiarach fizycznych, odpowiednią liczbę wprowadzanych komórek należy ustalić eksperymentalnie. Jako pierwsze przybliżenie można założyć, że średnica sferoidu będzie wzrastać proporcjonalnie do pierwiastka trzeciego stopnia z liczby włączonych komórek – np. 8-krotny wzrost liczby komórek powinien skutkować dwukrotnym zwiększeniem średnicy sferoidu.
Rycina 1. Schemat produkcji sferoidów. System mikrowycieków składa się z macierzy gęsto rozmieszczonych mikrowycieków o kształcie ostrosłupa kwadratowego (625 na cm2 dla rozmiaru 400 µm), do których można wirować komórki. Komórki są gromadzone przez skośne ściany boczne, a rozmiar powstałego sferoidu jest kontrolowany poprzez zmianę gęstości zastosowanej zawiesiny komórkowej.
Rycina 2. Agregacja skupisk komórek w sferoidy. Sferoidy utworzono z siedmiuset komórek HT29 każda. Bezpośrednio po wirowaniu (A) komórki tworzą luźne skupiska na dnie każdego mikrodobka. Należy zauważyć, że w tym przypadku skupiska są jednolicie przesunięte w prawy dolny róg. Jest to dopuszczalne, pod warunkiem że wielkość skupisk pozostaje spójna w całej matrycy. Jeśli zaobserwowane zostaną znaczące różnice w wielkości skupisk między jedną a drugą stroną matrycy, należy zapoznać się z Uwagą w kroku 3.5. Po inkubacji przez 24 hr (B) międzykomórkowe siły adhezyjne spowodowały agregację skupisk i utworzenie spójnych sferoidów, które mogą zostać następnie wyekstrahowane (C).
Rycina 3. Sferoidy wygenerowane w płytkach z mikrodofkami. Sferoidy utworzono z siedmiuset (A, C, E) lub tysiąca pięciuset (B, D, F) komórek raka jelita grubego HT29 (A, B), komórek raka prostaty LNCaP (C, D) lub komórek raka przełyku TE6 (E, F). Należy zwrócić uwagę na jednolitość sferoidów w obrębie jednej preparacji, a także na różnice między liniami komórkowymi – w szczególności na luźne agregaty LNCaP w porównaniu do bardziej gęsto upakowanych komórek HT29 i TE6. Pasek skali reprezentuje 200 μm.
| Format mikropłytek | |||
| AggreWell 400 | AggreWell 40EX | AggreWell 800 | |
| Szerokość mikrododatku (µm) | 400 | 400 | 800 |
| Liczba mikrododatków na cm2 | 625 | 625 | 156.25 |
| Liczba mikrodofków na dołek | 1,200 | 4,700 | 300 |
| Minimalna liczba komórek na mikrodopalec* | Nie dotyczy | Nie dotyczy | 2000 |
| Maksymalna liczba komórek na mikrodopalec* | 2,000 | 2,000 | 10,000 |
| Minimalna liczba komórek na dołek* | Nie dotyczy | Brak danych | 6 x 105 |
| Maksymalna liczba komórek na dołek* | 2,4 x 106 | 9,4 x 106 | 3 x 106 |
| 1.1.1 - Objętość 70% etanolu (ml) | 0.5 | 2.0 | 0.5 |
| 1.2.1 - Objętość roztworu płuczącego (ml) | 0.5 | 2.0 | 0.5 |
| 3.2 - Objętość preloadu medium (ml) | 0.4 | 1.6 | 0.4 |
| 3.5 - Objętość załadowanych komórek (ml) | 0.4 | 1.6 | 0.4 |
| *Liczba komórek na mikrodopalec jest jedynie wartością przybliżoną, ponieważ zależy ona od wielkości zastosowanych komórek i powinna zostać określona empirycznie | |||
Tabela 1. Opcje AggreWell i modyfikacje protokołu.
Dyskusja
Stworzyliśmy system, w którym duża liczba jednolitych sferoid może być generowana z wielu linii komórkowych z różnych źródeł. Nie spotkaliśmy się jeszcze z przylegającą linią komórkową, która nie tworzy sferoid w tych warunkach. Wcześniej obserwowaliśmy utratę komórek w populacjach podatnych na anoikis5,8, jednak do tej pory problem ten nie pojawił się w przypadku linii nowotworowych. System jest dowolnie skalowalny w zależności od powierzchni, z zachowaniem spójnym we wszystkich mikrodołkach w formacie 24- i 6-dołkowym, a także w prototypowych bioreaktorach zawierających 50 000 mikrodołków, z których każdy jest obecnie w fazie rozwoju.
Jeśli asymetria sferoidalna jest problemem, czas inkubacji opisany w kroku 4.8 może zostać wydłużony do dwóch lub trzech dni. Sferoidy mogą być również inkubowane przez pewien czas po ekstrakcji z mikrostudzienek w celu zwiększenia symetrii, jednak w tym przypadku należy zachować ostrożność, aby utrzymać wystarczająco niską gęstość hodowli, ponieważ sferoidy stykające się ze sobą często łączą się w większe struktury. Z tego powodu wcześniej utrzymywaliśmy kultury w mikrostudzienkach, w których powstały agregaty, przy czym głównym ograniczeniem był rozmiar sferoidy. To z kolei jest funkcją zarówno szybkości wzrostu, jak i początkowej wielkości8, a jeśli planowana jest rozszerzona hodowla w płytce mikrodołkowej, należy to rozważyć z wyprzedzeniem. Opcje zapobiegania przerostowi, jeśli do niego dojdzie, obejmują rozpoczęcie od mniejszych sferoid lub zastosowanie większych mikrodołków płytki AggreWell 800.
Jeśli sferoidy nie zwiększą swojej koherencji w czasie, jedną z potencjalnych przyczyn może być śmierć komórki. Szczególnie w większych skupiskach wysoce aktywnych metabolicznie komórek, ograniczenia transportu masy w dostarczaniu tlenu i niezbędnych składników odżywczych mogą skutkować nekrotycznym rdzeniem2 - tak więc niespoiste sferoidy mogą być po prostu konsekwencją nadmiernej śmierci komórki. Alternatywnie, pomiary kohezji mechanicznej sferoid zostały wykorzystane do oceny międzykomórkowych sił wiązania w odniesieniu do potencjału przerzutowego danej linii komórkowej13. Interesujące byłoby zbadanie związku między kształtem sferoidalnym a potencjałem przerzutowym, być może przy użyciu parametrów morfometrycznych, takich jak okrągłość i stosunek obwodu do powierzchni.
Oprócz badania właściwości mechanicznych i morfometrycznych sferoid, montaż w systemie mikrostudzienki pozwala na produkcję sferoid o mieszanym składzie na dużą skalę, składających się z kombinacji wielu typów komórek i / lub biomateriałów6,7. Interakcje komórek nowotworowych z innymi typami komórek są ważne dla dokładniejszego modelowania zachowania nowotworów in vivo14, dlatego interesujące może być generowanie sferoid z komórek nowotworowych w połączeniu na przykład z fibroblastami i komórkami śródbłonka. Mikrocząstki różnych biomateriałów mogą być również włączane i mogą wpływać na właściwości sferoidalne zarówno bezpośrednio poprzez ich interakcje z komórkami7,15, jak i jako rezerwuary kontrolowanego uwalniania czynników wzrostu i cytokin do wnętrza sferoidy16.
Jeśli istnieje jakakolwiek obawa co do sterylności, na przykład podczas pracy z płytką mikrodołkową, w której wcześniej używano niektórych studzienek, które mogły spędzić trochę czasu w inkubatorze w ramach poprzedniego eksperymentu, studzienki można ponownie wysterylizować przy użyciu 70% etanolu w wodzie.
Po uformowaniu sferoid można je również oddzielić od pozostałych komórek nieinkorporowanych, przepuszczając zawiesinę przez sitko do komórek. Poszczególne komórki przejdą, podczas gdy sferoidy zostaną zachowane. Jeśli istnieje podejrzenie, że sferoida wydziela komórki potencjalnie przerzutowe w trakcie hodowli, pożądane może być wielokrotne wykonanie tej procedury - początkowo w celu usunięcia komórek nieinkorporowanych, a następnie w celu wyizolowania oczyszczonych populacji komórek wydzielanych przez sferoidy.
Oświadczenia
Dr Ungrin jako wynalazca ma interes finansowy w technologii AggreWell.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet w Calgary, w ramach grantu dla nowego badacza dla dr. Ungrina.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka AggreWell 400 | firmy StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
| Roztwór do płukania | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
| Sitko do komórek (37 &mikro; m) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
| PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
| Trypsyna-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
| DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
| FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
| TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
| Mikroskop odwrócony | VWR / Motic | Wirówka CA19000-610 | |
| Allegra X15R z nośnikami do standardowych płytek studziennych | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |
Bibliografia
- Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids. Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), 2720(2011).
- Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. J. Vis. Exp. (57), e3337(2011).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
- Bauwens, C. L., Song, H., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).
- Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).
- Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).
- Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line. Toxicological Sciences. , (2012).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Butler, C. M., Foty, R. A. Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry. J. Vis. Exp. (50), e2739(2011).
- Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture. J. Vis. Exp. (62), e3760(2012).
- Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).
- Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development. Biomaterials. , (2012).
Przedruki i uprawnienia
