Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

17.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50677

⸱

23 sierpnia 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Streszczenie

Śródbłonek naczyniowy odgrywa integralną rolę w reakcji zapalnej. Podczas ostrej fazy zapalenia komórki śródbłonka (EC) są aktywowane przez mediatory gospodarza lub bezpośrednio przez konserwatywne składniki mikrobiologiczne lub cząsteczki niebezpieczeństwa pochodzące od gospodarza. Aktywowane EC wyrażają cytokiny, chemokiny i cząsteczki adhezyjne, które mobilizują, aktywują i zatrzymują leukocyty w miejscu infekcji lub urazu. Neutrofile są pierwszymi leukocytami, które docierają i przylegają do śródbłonka poprzez różne cząsteczki adhezyjne obecne na powierzchni obu komórek. Główne funkcje neutrofili to bezpośrednie eliminowanie zagrożeń mikrobiologicznych, wspomaganie rekrutacji innych leukocytów poprzez uwalnianie dodatkowych czynników oraz inicjowanie gojenia się ran. Dlatego ich rekrutacja i przywiązanie do śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjacji odpowiedzi zapalnej. W niniejszym raporcie opisujemy test adhezji neutrofili in vitro przy użyciu pierwotnych ludzkich neutrofili znakowanych kalceiną AM w celu ilościowego określenia zakresu aktywacji komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych. Metoda ta ma tę dodatkową zaletę, że te same próbki oznaczone ilościowo za pomocą spektrofotometrii fluorescencyjnej mogą być również wizualizowane bezpośrednio za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu bardziej jakościowej oceny wiązania neutrofili.

Wprowadzenie

Ponieważ śródbłonek naczyniowy jest w bezpośrednim kontakcie z krążącą krwią, jest wyjątkowo usytuowany do inicjowania szybkiej reakcji zapalnej podczas infekcji lub urazu. Komórki śródbłonka (EC) wyrażają receptory rozpoznawania wzorców, które rozpoznają różne konserwatywne składniki bakteryjne i cząsteczki niebezpieczne, a także receptory dla mediatorów stanu zapalnego gospodarza, takich jak TNFα. Aktywacja tych receptorów indukuje EC do wydzielania cytokin (np. IL-6, IL-8, CXCL1 i CCL2) oraz do zwiększania poziomu cząsteczek adhezyjnych (np. E/P-selektyny, VCAM-1 i ICAM-1) na powierzchni komórki 1,2. Wszystkie te cząsteczki ułatwiają lokalizację leukocytów w miejscach infekcji i urazów w celu usunięcia gospodarza z czynników zakaźnych i zainicjowania naprawy tkanek 3,4. Odpowiedź neutrofili na zakażenie obejmuje dobrze skoordynowaną interakcję między śródbłonkiem naczyniowym a reagującymi neutrofilami. Po aktywacji EC IL-8 jest wydzielana i tworzy wewnątrznaczyniowy gradient na śródbłonku, który umożliwia neutrofilom dotarcie do miejsca infekcji lub urazu 5,6. Selektyny E / P pośredniczą w wychwytywaniu neutrofili i przetaczaniu się przez stosunkowo słabe powiązania z glikocząsteczkami na powierzchni komórki neutrofilowej. Interakcje te, wraz z wiązaniem IL-8 z pokrewnymi receptorami, ułatwiają silne, pośredniczące integryny przyłączanie i ostateczne zatrzymanie neutrofili na powierzchni komórki śródbłonka 7-10. Po zatrzymaniu neutrofile mogą migrować z układu krwionośnego do określonych miejsc infekcji, aby bezpośrednio wyeliminować patogeny, wytworzyć zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się patogenów, przyspieszyć gojenie się ran i uwolnić dodatkowe czynniki, które rekrutują inne leukocyty, takie jak monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne 11-17.

Opisana w tym raporcie jest metoda in vitro do ilościowego oznaczania przylegania neutrofili do mikronaczyniowych EC po aktywacji przez mediator stanu zapalnego gospodarza TNFα. Ten test ma na celu ocenę aktywacji EC, a nie neutrofili. Pierwotne ludzkie neutrofile są najpierw izolowane za pomocą separacji w gradimencie gęstości, a następnie znakowane acetoksymetylem kalceiny (AM). Esterazy w żywych komórkach hydrolizują kalceinę AM do wysoce fluorescencyjnej cząsteczki kalceiny o wzbudzeniu 492-495 nm i emisji 513-516 nm 18. Neutrofile znakowane fluorescencyjnie są następnie inkubowane z monowarstwami EC, a następnie usuwane są neutrofile, które nie przylegają. Fluorescencja pozostałych, związanych neutrofili jest następnie mierzona za pomocą spektrofotometru fluorescencji i obliczana jako procent całkowitej fluorescencji neutrofili na studzienkę. Metoda ta ma dodatkową zaletę, że związane neutrofile znakowane kalceiną stosowane w spektrofotometrii mogą być bezpośrednio wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby uzyskać bardziej jakościowy odczyt aktywacji EC. Ponieważ test ten jest wykonywany w warunkach statycznych, oceniane będą tylko bardzo początkowe zdarzenia, które występują w kaskadzie adhezji neutrofili. Zostało to potwierdzone w niniejszym raporcie, w którym zastosowano przeciwciała blokujące selektynę E, aby pokazać, że przyleganie neutrofili do monowarstw mikronaczyniowych EC płuc (HMVEC-Lung) leczonych TNFα jest drastycznie zmniejszone, gdy interakcja z selektyną E jest zakłócona.

Oprócz TNFα, z powodzeniem użyliśmy tego testu do określenia zakresu aktywacji EC ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC) przez agonistów receptora Toll-like 1/2 związanych z peptydoglikanem lipoprotein (PAL), lipoproteiny mureiny (MLP) i Pam3Cys oraz aktywacji HMVEC-Lung przez Pam3Cys 19,20. Ponadto z powodzeniem zastosowaliśmy ten test z inhibitorami kinaz i po nokaucie białek powierzchniowych i cytoplazmatycznych za pośrednictwem RNAi w HMVEC-Lung, co sugeruje, że ta metodologia jest zgodna z różnymi testami biochemicznymi i przesiewowymi 20. Podsumowując, test ten zapewnia łatwy w użyciu, powtarzalny i bardziej funkcjonalny sposób uzyskania dostępu do zakresu aktywacji EC przez mediatory stanu zapalnego in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Poszycie i utrzymanie mikronaczyniowych komórek śródbłonka

  1. Rozmrozić i wyhodować komórki śródbłonka mikronaczyniowego zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. W tym protokole komórki hodowano w pożywce EGM-2 MV (Lonza) i zaleca się, aby wszystkie eksperymenty były wykonywane w ciągu dwóch tygodni od rozmrożenia, aby zminimalizować wszelkie zmiany spowodowane liczbą pasaży. Nasze eksperymenty z HMVEC-Lung są przeprowadzane między przejściami od 4 do 9.
  2. Dzień 1: Gdy komórki osiągną 80-90% zbieżności, trypsynizuj i ponownie zawieś w 120 000 komórek na ml. Umieść 36 000 komórek (0,3 ml) na studzience na 48-dołkowej płytce (płytkach) do hodowli tkanki polistyrenowej. Uwzględnij studzienki HMVEC, które nie będą inkubowane z neutrofilami, w celu uzyskania odczytu fluorescencji tła. O ile nie używa się 48-dołkowych płytek specjalnie zaprojektowanych do testów fluorescencyjnych, naprzemienne rzędy lub kolumny zminimalizują wszelkie zanieczyszczenie światłem z sąsiednich studzienek. UWAGA: Studzienki mogą być wstępnie pokryte polilizyną, kolagenem lub fibronektyną.
  3. Dzień 2: Dodaj świeże nośniki.
  4. Dzień 3: Za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego potwierdź, że komórki są zdrowe (tj. wygląd "bruku" i małe resztki komórek) i są w 100% zlewające się (ryc. 1). Jeśli komórki nie są w 100% zlewające się, zmieniaj podłoże codziennie, aż będą gotowe.
  5. Gdy monowarstwy HMVEC są gotowe do leczenia, przemyj komórki raz zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) i dodaj 0,3 ml świeżej pożywki EGM-2 MV lub pożywki zawierającej agonistę stanu zapalnego do odpowiednich studzienek. W tym protokole HMVEC-Lung były leczone TNFα (100 ng / ml) (PeproTech, New Jersey) przez 3 godziny, ponieważ jest to dobrze opisany aktywator EC 21. UWAGA: Zaleca się zaplanowanie eksperymentu tak, aby aktywowane komórki HMVEC (Krok 4.1) i neutrofile znakowane kalceiną AM (Krok 3.5) były gotowe do użycia w tym samym czasie. Wyizolowanie i znakowanie neutrofili zajmuje nam około 2,5 godziny.

2. Izolacja neutrofili za pomocą Polymorphprep

  1. Wyizolować neutrofile, jak opisano wcześniej, 22 lub za pomocą gotowego roztworu gradientu gęstości, aby wyizolować granulocyty wielojądrzaste z krwi pełnej. Zastosowanie Polymorphprep zgodnie z protokołem Nuzzi i wsp. 2007 daje wydajność około 2-3 x 106 neutrofili na ml krwi pełnej 23. UWAGA: Aby uniknąć nadmiernej lizy erytrocytów, przed wirowaniem w gradiacji gęstości można przeprowadzić sedymentację dekstranu w celu usunięcia czerwonych krwinek 24.
  2. Przenieś rozwiązanie gradientu gęstości Polymorphprep do RT.
  3. Zbierz 30 ml pełnej krwi od zdrowego ochotnika w obecności antykoagulantu, takiego jak heparyna, cytrynian lub EDTA. Krew należy zużyć w ciągu 2 godzin i przechowywać w temperaturze 18-22 °C.
  4. Umieścić 5 ml krwi pełnej na 5 ml roztworu gradientu gęstości w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (ryc. 2A). Należy unikać zmiany objętości krwi i roztworu gradientu gęstości, ponieważ może to zmienić warunki późniejszego wirowania.
  5. Wirować przy 450 x g przez 30 minut w temperaturze 18-22 °C. Upewnij się, że powoli przyspieszasz wirówkę w górę i w dół (tj. wyłącz hamulec wirówki) i dobrze wyważ probówki, aby zapobiec wibracjom, aby zmniejszyć aktywację neutrofili i zapobiec mieszaniu się warstw. Dłuższy czas wirowania lub większa siła odśrodkowa spowodują, że dolna warstwa leukocytów, która zawiera neutrofile, będzie migrować dalej w dół w kierunku granulowanych czerwonych krwinek.
  6. Odessać osocze i górne pasmo leukocytów zawierające PBMC, aby zapobiec zanieczyszczeniu warstwy zawierającej neutrofile (Figura 2B).
  7. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1-2 ml usunąć dolną warstwę leukocytów zawierającą neutrofile. Połączyć warstwy neutrofili w 30 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  8. Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i odwirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 18-22 °C.

Uwaga: Kroki 2.9 i 2.10 są opcjonalne, ale wysoce zalecane.

  1. Odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w 8 ml sterylnej wody na 30 sekund w celu lizy czerwonych krwinek, natychmiast dodać zawiesinę komórkową do 2 ml 5x PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i delikatnie wymieszać ręcznie. NIE INKUBUJ komórek w wodzie dłużej niż 30 sekund, ponieważ może dojść do znacznej śmierci neutrofili
    2. .
  2. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C.
  3. Przemyć komórki raz 10 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i ponownie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C.
  4. Zawiesić neutrofile w 10 ml RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej) i policzyć żywe komórki metodą wykluczania barwnika błękitu trypanowego. Należy unikać długotrwałych okresów zagęszczenia komórek większego niż 5 x 106 na ml, ponieważ może to spowodować aktywację neutrofili.

3. Znakowanie neutrofili za pomocą Calcein AM

  1. 6 x 105 neutrofili stosuje się na dołek 48-dołkowej płytki.
  2. Po zliczeniu przenieś zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz neutrofile do 2-4 x 106 komórek na ml za pomocą RPMI-1640 wolnego od czerwieni fenolowej.
  3. Dodać roztwór podstawowy kalceiny AM do 3 μM (tj. 2,98 μl bulionu kalceiny AM (1 mg/ml) na ml pożywki) i dobrze wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę. Większa niż 5 μM kalceiny AM spowoduje wyciek z neutrofili. nuta: Niefluorescencyjna kalceina AM jest rozszczepiana w komórkach przez endogenne esterazy w celu wytworzenia wysoce fluorescencyjnej cząsteczki kalceiny (tj. martwe komórki nie będą fluoryzować).
  4. Przykryć probówkę folią aluminiową i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. nuta: Dłuższy czas inkubacji może spowodować uwolnienie większej ilości kalceiny z neutrofili w trakcie testu adhezji.
  5. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C i przemyć neutrofile 2x 10 ml RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej; wstępnie podgrzane do 37 °C). Po ponownym zawieszeniu komórek do drugiego płukania, najpierw przepuść neutrofile przez sterylny filtr 40 μM w celu usunięcia grudek, a następnie ponownie odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C.
  6. Zawiesić neutrofile w RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej; wstępnie podgrzane do 37 °C) przy stężeniu 2 x 106 neutrofili na ml.

4. Test wiązania neutrofili

  1. Umyj monowarstwy HMVEC 3x 0,5 ml sterylizowanego filtrem (0,22 μm) RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej) zawierającego 3% BSA na studzienkę.
  2. Odessać pożywkę i dodać 6 x 105 neutrofili znakowanych kalceiną (0,3 ml zawiesiny komórek) lub 0,3 ml RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej) bez neutrofili do odpowiednich dołków płytki 48-dołkowej. nuta: Jest to odpowiednik 8 x 105 neutrofili nacm2.
  3. Inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Całkowita fluorescencja neutrofili (płukanie PRE): Zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studzienki o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 520 nm (zestaw filtrów fluoresceinowych) w spektrofotometrze FLUOstar lub równoważnym. Wykonaj ten krok tuż przed punktem końcowym inkubacji. nuta: W tym protokole wzbudzenie kalceiny i detekcja emitowanego światła przeprowadzono z góry odkrytych studni; Jednak oba można również wykonać z dna studni.
  5. Przemyć studzienki zawierające monowarstwy HMVEC i neutrofile 5x 0,5 ml na studzienkę PBS (z Ca2+ i Mg2+). Wyjmij media i płyny, odwracając talerz i delikatnie wklepując w ręczniki papierowe, aby usunąć pozostały płyn.
  6. Dodać z powrotem 0,3 ml RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej) do dołka.
  7. Przylegająca fluorescencja neutrofili (PO myciu): Zmierz intensywność fluorescencji każdego studzienki, jak w kroku 4.4.
  8. Określ procentową adherencję i względną adherencję na studzienkę:

Uwaga: Na tym etapie, obrazy neutrofili znakowanych kalceiną można uzyskać za pomocą mikroskopu zdolnego do fluorescencji, wyposażonego w standardowe filtry fluoresceinowe. Obrazy na rysunku 4 uzyskano za pomocą mikroskopu odwróconego Olympus IX51 wyposażonego w kamerę Retiga 2000R (Q Imaging) przy użyciu oprogramowania Q-Capture Pro7 (Q Imaging).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki w teście wiązania neutrofili, niezbędne jest, aby stan zdrowia i stopień konfluencji mikro naczyniowych komórek śródbłonka były optymalne w dniu przeprowadzania analizy, co zilustrowano na przykładzie HMVEC-Lung na Rysunku 1. Ponadto konieczne jest stosowanie mikro naczyniowych komórek śródbłonka o niskim numerze pasażu (t.j. poniżej 9 pasażu), w związku z czym zalecamy przeprowadzanie wszystkich eksperymentów w ciągu dwóch tygodni od rozmrożenia. Kluc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszymi etapami udanego testu adhezji neutrofili / mikronaczyń śródbłonka są: 1) Użycie niskiej liczby pasażów (<9), zdrowych komórek śródbłonka; 2) Utrzymanie wyizolowanych neutrofili w niskiej gęstości (tj. <5 x 106 komórek/ml) i wykorzystanie ich w ciągu dwóch godzin od izolacji; oraz 3) Skrupulatne mycie neutrofili znakowanych kalceiną AM i stosowanie neutrofili znakowanych kalceiną AM w odpowiednim czasie, aby zminimalizować odpowiednio zanieczyszczenie EC i utratę kalceiny z neutrofili.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Wydział Anestezjologii i Opieki Okołooperacyjnej UCSF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HMVEC-LungLonzaCC-2527
EGM-2 MVLonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095Można zastąpić dowolnym dostawcą
48-dołkowe płytki do hodowli tkankowychBD Falcon353078
PBS (bez czerwieni fenolowej)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL001Można zastąpić dowolnym dostawcą
D-PBS (bez Ca2+ i Mg2+ i czerwieni fenolowej)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL003Można zastąpić dowolnym dostawcą
RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej)Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
kalceina AMLife TechnologiesC3099(0,995 mM) kolba soln
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
40 μ M filtryVWR21008-949Można zastąpić dowolnym dostawcą
Spektrofotometr FLUOstar OPTIMABMG LABTECH-

Bibliografia

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745(2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja komórek śródbłonkaznakowanie calceiną AMspektrofotometria fluorescencyjnamikroskopia fluorescencyjnaizolacja neutrofiliPolymorph Preptraktowanie TNF-alfainhibicja p38 MAPK
Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.